Als uitgangspunt voor de experimenten werd een stock van melkzuurbacteriën aangemaakt. Er werd gestart vanuit vials met culturen geïsoleerd uit zuurdesems door bachelorstudenten. Deze culturen werden opgekweekt op MRS (De Man, Rogosa en Sharpe)-agar. De platen werden gedurende 7 dagen geïncubeerd bij 25°C.
Gelijktijdig werden de MZB-stammen uit enkele aangekochte starterculturen (zie bijlage, fig. 13) geïsoleerd. De starterculturen in poeder- of korrelvorm werden gesuspendeerd in MRS-broth, 2 dagen geïncubeerd bij 25°C, uitgestreken op MRS-agar en vervolgens 7 dagen geïncubeerd bij 25°C. Het betreft vier starters van Lactoferm: kaasferment (LK), zuurkoolferment (LZ), bifidus ferment (LB) en yoghurt ferment (LY); flora danica (FD) en een yoghurt cultuur (YC) van Chr. Hansen; en Malocid van Vinoferm (VM). Één cultuur werd reeds geïdentificeerd ontvangen: Lactobacillus sanfranciscensis.
3.2 Opzuivering
De zuurdesemculturen en starters bevatten verschillende stammen. De zuiverheid van een plaat kon soms moeilijk bepaald worden omdat kolonies van verschillende species toch een gelijkaardig uitzicht konden hebben en kolonies van stammen van eenzelfde species toch konden verschillen in uitzicht. Om de zuiverheid te garanderen, werden afzonderlijke kolonies zorgvuldig aangetikt met behulp van een entnaald en uitgestreken op nieuwe MRS-platen die gedurende 4 dagen geïncubeerd werden bij 25°C. Bij een goede uitvoering werden platen met zuivere culturen bekomen en konden de kolonies overgebracht worden enerzijds in een cryovial en anderzijds in een eppendorf tube (2mL) voor de stockage en de identificatie, respectievelijk.
3.3 Stockage
Op het einde van de opzuiveringstap werden de micro-organismen met behulp van een entnaald overgebracht in cryovials gevuld met een 25% glycerol - 75% MRS-oplossing en werden ze gestockeerd in een diepvries bij -20°C.
3.4 Identificatie via MALDI-TOF MS
De opgezuiverde micro-organismen werden in een laatste stap geïdentificeerd via MALDI-TOF MS (matrix assisted laser desorption/ionisation time-of-flight mass spectrometer). Met behulp van de MALDI-TOF MS technologie konden micro-organismen geïdentificeerd worden tot op soort-
32 en zelfs stamniveau (Dumolin et al., 2019). Met behulp van een entnaald werd een hoeveelheid celmassa van de opgezuiverde cultuur (maximaal 4 dagen oud) overgebracht in een 2mL gesteriliseerd epje met 300µL ultrapuur water (milli-Q). Na vortexen van het epje werd 900µL ethanol toegevoegd en gecentrifugeerd. Dit werd bewaard bij -20°C tot de analyse. Na centrifugatie werd het supernatans verwijderd. Deze stap werd herhaald tot geen supernatans meer overbleef. Daarna werd 40µL 70% mierenzuur toegevoegd, gevortexed, 40µL 100% acetonitril toegevoegd en nogmaals gevortexed. Hierna werd twee minuten gecentrifugeerd (14 000 rpm, 4°C), waarna 40µL van de bovenste laag (peptide-extract) in een nieuw epje (1,5mL) werd gepippeteerd.
Op een Bruker Target Plate werd 1μl van het eiwitextract gespot, gedroogd en daarna bedekt met 1 μl matrixoplossing (2,5mg α-cyano-4-hydroxycinnamic acid in 250μl acetonitrile:Water:TFA in verhouding 50:47.5:2.5). Er werd ook één spot met enkel matrixoplossing meegenomen als negatieve controle. Wanneer de spots droog waren, werd de plaat in het docking station van de Bruker MicroflexTM LT geplaatst en de analyse uitgevoerd.
Tijdens de analyse werd een hoeveelheid celmassa van de geïsoleerde culturen bestraald met een laser bij een golflengte van 337nm. Door de bestraling werd het het sample geïoniseerd, waarna de verkregen wolk van ionen versneld werd in de time-of-flight tube bij een hoog voltage (20kV). De moleculaire ionen werden gescheiden in de tijd op basis van hun m/z ratio, waardoor karakteristieke pieken (spectrum) gecreëerd werden. Op basis van een databank van spectra vond de software de overeenkomende species volgens een betrouwbaarheidsindex tussen de twee spectra (Polet, Botteldoorn, & Dierick, 2015).
3.5 Katalase
Met behulp van waterstofperoxide (H2O2) kon de aanwezigheid van het enzym katalase nagegaan worden. Dit enzym is in staat waterstofperoxide te splitsen in zuurstof en water. Op een draagglaasje werd een hoeveelheid cultuur van een MRS-plaat geschraapt en in contact gebracht met waterstofperoxide. Bij een positieve reactie, indien de cultuur het enzym bezat, ontstonden gasbelletjes. Bij een negatieve reactie ontstonden geen gasbellen. Melkzuurbacteriën zijn katalasenegatief en kunnen zo onderscheiden worden van gisten of andere aerobe micro- organismen.
3.6 Gram positiviteit/negativiteit
Het gramkarakter van een cultuur werd vastgesteld met behulp van een kaliumhydroxide (KOH) oplossing. Wanneer gramnegatieve bacteriën behandeld werden met 3% (m/v) KOH, loste de
33 celwand op en kwam DNA vrij onder vorm van slijmerige draden. Grampositieve cellen, zoals melkzuurbacteriën, hebben een dikkere peptidoglycaanlaag die de oplossing van de celwand verhindert en vertonen geen slijmvorming.
3.7 Exopolysacharide vorming
Exopolysachariden (EPS) zijn polysachariden die aan de celwand vasthangen of die extracellulair worden geproduceerd door bepaalde MZB species. De EPS-productie werd nagegaan met behulp van MRS-platen met sucrose (10 g/L). Indien de melkzuurbacteriën EPS vormden, werd dit waargenomen als slijmerige kolonies op de MRS-sucrose-platen.
3.8 Koolzuurgas productie
Om de productie van koolzuurgas na te gaan werd een proefbus gevuld met MRS-broth en voorzien van een omgekeerde eppendorf tube (als vervanging voor een Durham tube). Het geheel werd geautoclaveerd waardoor het epje volledig gevuld werd met de MRS-broth- oplossing. Een hoeveelheid cultuur werd toegevoegd aan de oplossing. Indien de cultuur koolzuurgas produceerde, was een gasbel zichtbaar in het epje.
3.9 Groei van melkzuurbacteriën in wort
3.9.1 Bij 37°C
De fermentaties werden uitgevoerd in 96-well platen (Greiner 96 Flat Bottom Transparent Polystyrene). De gebruikte stammen waren Lactobacillus brevis, Pediococcus pentosaceus (a), Lactobacillus plantarum, Leuconostoc pseudomesenteroides, Lactococcus lactis en Lactococcus lactis ssp lactis. Voor elke MZB-stam werden 9 fermentaties uitgevoerd: drie verschillende inoculumconcentraties (5,0%, 1,0% en 0,1%) telkens in triplicaat. De cultuurstocks, die bewaard werden bij -20°C in een 25% glycerol - 75% MRS-oplossing, werden opgegroeid in proefbuizen met MRS-broth en geïncubeerd bij een temperatuur van 25°C gedurende 2 dagen.
Wort werd aangemaakt door 70g/L moutextract (8EBC, Brewferm®) op te lossen in gedestilleerd water. Na de activatie van de melkzuurbacteriën werd 2,5mL van een volgroeide cultuur toegevoegd aan 47,5mL geautoclaveerd wort om een 5,0%-inoculumoplossing aan te maken. De 5,0%-oplossing werd 5x en 50x verdund door aan te lengen met geautoclaveerd wort (W). De concentratie aan micro-organismen in de 5,0% oplossing werd bepaald door een verdunningsreeks (10-5, 10-6, 10-7, 10-8) uit te platen op MRS.
34
3.9.2 Bij 25°C
Het experiment werd een tweede maal uitgevoerd mits enkele aanpassingen, zoals een lagere fermentatietemperatuur, om meer de condities zoals bij de productie van een wortgebaseerde drank na te bootsen. Ten opzichte van het experiment bij 37°C werden twee extra stammen opgenomen: P. pentosaceus (b) en Lactobacillus sanfranciscensis. De Le. pseudomesenteroides stam werd vervangen nadat bleek dat de eerder gebruikt stam niet levend meer was. De cultuurstocks bewaard bij -20°C werden rechtstreeks gebruikt voor de inoculatie van het wort, zonder activatie vooraf. Ze werden enkele minuten op kamertemperatuur gebracht en gevortexed tot een homogene, vloeibare oplossing werd bekomen. Aan een 1mL eppendorf tube werd 50µL inoculum toegevoegd en aangelengd met 950 µL wort om een 5,0%-inoculumoplossing te bekomen. Het gebruikte wort werd op een gelijkaardige manier aangemaakt als bij het eerste assay, maar werd gekookt in plaats van te autoclaveren. De gebruikte stammen werden ook in triplicaat geïnoculeerd in MRS (1,0%) als positieve controle. Hiervoor werd in een 1mL epje 10µL inoculum aangelengd met 990 µL geautoclaveerd MRS om een 1,0%-inoculumoplossing aan te maken. De rest van het experiment werd op een gelijkaardige wijze uitgevoerd als bij 37°C. De concentratie aan micro-organismen in de 5,0% oplossing werd bepaald door een verdunningsreeks (10-5, 10-6, 10-7, 10-8) uit te platen op MRS.
3.9.3 Optische densiteit
De groei van de MZB gedurende de fermentatie in wort werd opgevolgd via de optische densiteit. De optische densiteit (OD600) meet de hoeveelheid licht die weerkaatst wordt door de aanwezige
micro-organismen (levend of dood) binnen een optische weglengte en is evenredig met de concentratie aan microbiële cellen. Meer weerkaatsing betekent een hogere turbiditeit en een hogere concentratie aan cellen. Wanneer de gemeten waarden werden uitgezet ten opzichte van de tijd in een grafiek, werden groeicurves zichtbaar waarin een lag-fase, log-fase en stationaire fase onderscheiden konden worden. Hiervoor werd de 96-well plaat geïncubeerd in de spectrofotometer (Tecan Infinite® 200 PRO) bij een temperatuur van 25°C of 37°C. Gedurende 48h werd elk uur een meting uitgevoerd bij een golflengte van 600nm.
3.10 Fermenteerbaarheid mono- en disachariden
De fermentaties werden uitgevoerd in 96-well platen (Greiner 96 Flat Bottom Transparent Polystyrene). De gebruikte stammen waren L. brevis, P. pentosaceus (a en b), L. plantarum, Le. pseudomesenteroides, Lc. lactis, Lc. lactis ssp lactis en L. sanfranciscensis. Per stam werden 12 fermentaties uitgevoerd: vier verschillende suikers (40g/L glucose, fructose, maltose of sucrose),
35 telkens in triplicaat. Een geconcentreerd MRS medium zonder glucose werd aangemaakt door verschillende ingrediënten (zie bijlage, tabel 4) op te lossen in gedestilleerd water en de oplossing vervolgens te autoclaveren.
De cultuurstocks, bewaard bij -20°C, werden na ontdooien rechtstreeks gebruikt voor de inoculatie van het wort, zonder activatie vooraf. In een 2mL eppendorf tube werd 75µL inoculum aangelengd met 1425µL geautoclaveerd MRS (zonder glucose). In iedere welletje werd 100µL van de 5,0%-inoculumoplossing en 100µL geautoclaveerde suikeroplossing gebracht. Vervolgens werd de plaat geladen in de spectrofotometer (iMark™ Microplate Absorbance Reader). Na 0h, 6h, 12h, 24h, 36h en 72h werd een meting uitgevoerd bij 595nm. Na iedere meting werd de plaat teruggeplaatst in de warme kamer, waar de fermentatie doorliep bij een temperatuur van 25°C.
36