Artifizielle Lichtsammelkomplexe ermöglichen Rieske‐Oxygenase‐ katalysierte
Hydroxylierungen in nicht‐photosynthetischen Zellen
Feyza Özgen, F.; Runda, Michael E.; Burek, Bastien O.; Wied, Peter; Bloh, Jonathan Z.;
Kourist, Robert; Schmidt, Sandy
Published in:
Angewandte Chemie
DOI:
10.1002/ange.201914519
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2020
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Feyza Özgen, F., Runda, M. E., Burek, B. O., Wied, P., Bloh, J. Z., Kourist, R., & Schmidt, S. (2020).
Artifizielle Lichtsammelkomplexe ermöglichen Rieske‐Oxygenase‐ katalysierte Hydroxylierungen in nicht‐
photosynthetischen Zellen. Angewandte Chemie, 132(10), 4010-4016.
https://doi.org/10.1002/ange.201914519
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Internationale Ausgabe: DOI: 10.1002/anie.201914519
Photokatalyse
Deutsche Ausgabe: DOI: 10.1002/ange.201914519Artifizielle Lichtsammelkomplexe ermçglichen
Rieske-Oxygenase-katalysierte Hydroxylierungen in nicht-photosynthetischen Zellen
F. Feyza zgen, Michael E. Runda, Bastien O. Burek, Peter Wied, Jonathan Z. Bloh,
Robert Kourist und Sandy Schmidt*
Abstract: In dieser Studie wurde ein auf E. coli basierendes Ganzzellsystem ber Lichtsammelkomplexe an Rieske-Oxy-genasen(RO)-katalysierte Hydroxylierungen in vivo ange-koppelt. Obwohl diese Enzyme vielversprechende Biokataly-satoren darstellen, wird ihre praktische Anwendbarkeit durch ihre Abhngigkeit von NAD(P)H sowie ihre Mehrkompo-nentennatur und intrinsische Instabilitt in zellfreien Systemen beeintrchtigt. Um die Grenzen von E. coli als Chassis fr knstliche Photosynthese zu erforschen, sowie aufgrund der berichteten Instabilitt von ROs, haben wir diese herausfor-dernden Enzyme als Modellsystem verwendet. Der Licht-ge-triebene Ansatz beruht auf Lichtsammelkomplexen wie bei-spielsweise Eosin Y, 5(6)-Carboxyeosin oder Rose Bengal und Elektronendonoren (EDTA, MOPS oder MES), die von den Zellen leicht aufgenommen werden kçnnen. Die erzielten Produktbildungen von bis zu 1.3 g L 1und Raten von bis zu
1.6 mm h 1zeigen, dass dies ein vergleichbarer Ansatz zu
ty-pischen Ganzzelltransformationen in E. coli ist. Die An-wendbarkeit dieser photokatalytischen Synthese wurde de-monstriert und ist das erste Beispiel eines photoinduzierten RO-Systems.
D
ie Kreativitt der Natur bei der Entwicklung von Lçsun-gen fr Funktionalisierungsreaktionen wie HydroxylierunLçsun-gen an aktivierten oder nicht-aktivierten CH-Bindungen zeigt sich bemerkenswert in einer umfangreichen Liste metallab-hngiger Enzyme.[1, 2] Diese Enzyme, wie beispielsweiseRieske-Nicht-Hm-Eisen-Oxygenasen (ROs) aktivieren mo-lekularen Sauerstoff, um reaktive Sauerstoffspezies zu er-zeugen, die Alkylsubstrate hydroxylieren kçnnen, aber auch um weitere oxidative Umsetzungen zu ermçglichen.[3–11]Fr
viele dieser Reaktionen ist kein klassisches chemisches Ge-genstck bekannt. Aufgrund ihrer Abhngigkeit von
kom-plexen Elektronentransportketten[12] sowie der
Notwendig-keit einer effizienten In-situ-Cofaktor-Regenerierung, beru-hen die meisten synthetiscberu-hen Anwendungen von ROs auf rekombinanten Ganzzellkatalysatoren. Im Allgemeinen wurden fr solche Reaktionen verschiedene Konzepte ent-wickelt, die auf der Elektronenbereitstellung ber den Me-tabolismus lebender heterotropher Zellen beruhen.[13–15]Fr
synthetische Anwendungen werden die Nicotinamid-Cofak-toren unter Verwendung energiereicher organischer Mole-kle als Elektronendonoren recycelt. In den meisten Fllen wird nur ein kleiner Teil der von diesen Opfer-Cosubstraten bereitgestellten Elektronen genutzt, was zu einem schlechten Atomwirkungsgrad fhrt.[14]Wenn Glucose als Opfersubstrat
fr das Recycling von NADPH eingesetzt wird, nutzt die hufig verwendete Glucose-Dehydrogenase außerdem nur einen Teil der Elektronenpaare von jedem Glucosemolekl. Um diese Herausforderung zu lçsen, werden derzeit viele alternative Anstze in Betracht gezogen.[16–18] Neben der
Verknpfung der Photochemie mit Enzymen in vitro zur Cofaktor-Regeneration,[18–24] haben autotrophe und
chemo-lithoautotrophe Organismen in jngster Zeit Aufmerksam-keit erhalten, da sie dazu in der Lage sind, anorganische Verbindungen als Elektronendonoren zu nutzen.[25–29]
Licht-getriebene Ganzzellreaktionen in Cyanobakterien zeigen die gleichen Reaktionsgeschwindigkeiten wie E. coli.[26, 27, 29]Die
starke Absorption des Photosyntheseapparats fhrt jedoch zur Selbstbeschattung bei hohen Zelldichten, was in einer geringen Lichtausnutzung und einer verringerten Photosyn-these-Aktivitt resultiert.[30]Andererseits bietet die
Einfh-rung einer knstlichen Photosynthese in heterotrophe Bak-terien wie E. coli den Vorteil, dass ein genetisch einfach zu manipulierender Organismus verwendet werden kann und dass in den Zellen große Mengen lçslichen Proteins produ-ziert werden kçnnen. Außerdem sind diese Systeme weniger anfllig fr inhibierende Effekte durch Selbstbeschattung bei hohen Zelldichten. Derzeit beschriebene knstliche Licht-getriebene Anstze bei heterotrophen Organismen umfassen die Verwendung von anorganisch-biologischen Hybridsyste-men sowie die Kopplung von organischen Photosensibilisa-toren an Biotransformationen in vivo.[31, 32]Eines der
frhes-ten Beispiele fr eine Ganzzellreaktion wurde unter Ver-wendung von rekombinanten E. coli-Zellen beschrieben, und zeigt die Kopplung an eine photokatalytische H2-Produktion
ber einen extrazellulren Photosensibilisator (TiO2) und
Methylviologen als Elektronenmediator.[31] In hnlicher
Weise wurde die Licht-getriebene H2-Entwicklung und die
Hydrierung von C=C- oder C=O-Bindungen durch Shewan-ella oneidensis unter Verwendung von Methylviologen ge-zeigt.[33]Hierbei handelt es sich um interessante Systeme. Die
[*] M. Sc. F. Feyza zgen, Dipl. Ing. M. E. Runda, Dipl. Ing. P. Wied, Prof. Dr. R. Kourist, Dr. S. Schmidt
Institute fr Molekulare Biotechnologie, Technische Universitt Graz Petersgasse 14/1, 8010 Graz (sterreich)
E-Mail: s.schmidt@tugraz.at M. Sc. B. O. Burek, Dr. J. Z. Bloh DECHEMA-Forschungsinstitut
Theodor-Heuss-Allee 25, 60486 Frankfurt am Main (Deutschland) Hintergrundinformationen und die Identifikationsnummern (ORCIDs) zweier Autoren sind unter https://doi.org/10.1002/ange. 201914519 zu finden.
2019 Die Autoren. Verçffentlicht von Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA. Dieser Open Access Beitrag steht unter den Bedingungen der Creative Commons Attribution License, die jede Nutzung des Beitrages in allen Medien gestattet, sofern der ursprngliche Beitrag ordnungsgemß zitiert wird.
Toxizitt von Methylviologen ist jedoch allgemein bekannt und verhindert daher großtechnische Anwendungen. Ein di-rekterer, und der vielleicht am besten geeignete Ansatz wurde von Park und Mitarbeitern beschrieben.[32] Diese
lichtgetriebene Katalyse basiert auf der In-vivo-Photoreduk-tion einer P450-Monooxygenase unter Verwendung ver-schiedener Fluoreszenzfarbstoffe und Elektronendonoren.[32]
Obwohl es bei niedrigen Produktkonzentrationen arbeitet, stellt es ein vielversprechendes System fr die anspruchsvol-len Mehrkomponenten-ROs dar, da diese Enzyme trotz niedriger Expressionslevel normalerweise hohe katalytische Aktivitten und somit ein großes Potenzial fr knstliche Photosynthese-Anstze in E. coli aufweisen (Abbildung 1).
Wir demonstrieren hier die generelle Machbarkeit dieses Licht-induzierten Ansatzes zusammen mit der Charakteri-sierung der entscheidenden Parameter, welche die
katalyti-sche Effizienz der Licht-getriebenen enzymatikatalyti-schen Reaktion in vivo bestimmen.
Wir untersuchten Eosin Y (2,4,5,7-Tetrabromfluorescein, EY) und seine Xanthen-Derivate sowie Safranin O (SO) als effiziente Photosensibilisatoren, um RO-katalysierte Hydro-xylierungsreaktionen durch die Beleuchtung mit LED- oder Leuchtstofflampen anzutreiben. Als Elektronendonoren wurden entweder 3-(N-Morpholino)propansulfonsure (MOPS), 2-(N-Morpholino)ethansulfonsure (MES) oder Ethylendiamin-Tetraessigsure (EDTA) untersucht.[23] Auf
diese Weise reduziert der sukzessive Elektronentransfer das katalytische Eisen und treibt die durch die ROs katalysierte Umsetzung von (R)-Limonen 1 in (1R,5S)-Carveol 1 a, Toluol 2 in Benzylalkohol 2 a oder Inden 3 in 1-Indenol 3 a und cis-oder trans-1,2-Indandiol 3 b unter Bestrahlung mit sichtbarem Licht und ohne die Notwendigkeit von NAD(P)H als Re-doxpartner an (Schema 1).
Cumoldioxygenase (CDO, aus Pseudomonas fluorescens IP01) und Naphthalindioxygenase (NDO, aus Pseudomonas sp. NCIB 9816-4) wurden als Modellenzyme gewhlt (Hin-tergrundinformationen, Abbildung S1, Tabellen S1–S7), da beide Enzyme seit langer Zeit intensiv untersucht und zahl-reiche vernderte Varianten generiert wurden. Wir interes-sierten uns besonders fr zwei Varianten von CDO und NDO, die fr die asymmetrische Dihydroxylierung von Olefinen generiert wurden. Die CDO-Variante M232A setzt 1 fast ausschließlich in 1 a um (ee > 98 %),[34] whrend die
NDO-Variante H295A fr mehrere substituierte Arene ein unterschiedliches Verhltnis zwischen allyli-scher Monohydroxylierung und cis-Dihydroxylie-rung zeigt.[35] Zunchst untersuchten wir die
Ex-pression des gesamten RO-Systems unter verschie-denen Kultivierungsbedingungen (SDS-PAGE, Abbildung S2) und besttigten die RO-Aktivitt durch einen Agarplatten-Assay auf der Basis von Indigo-Bildung (Abbildungen S3 und S4) und konnten eine signifikante Aktivitt gegenber Indol feststellen.[36]
Um die Zelldichte zu bestimmen, die in der CDO-katalysierten Reaktion zur hçchsten Pro-duktbildung fhrt, wurden Biotransformationen mit Zellen, die unter verschiedenen Bedingungen kul-tiviert wurden, im dunklen mit Glukose (20 mm) und 1 (10 mm) durchgefhrt (Tabelle S8). Wie erwartet fhrten die CDO-haltigen ganzen Zellen (100 gWCWL 1), die in
TB-Medium bei 30 8C kultiviert wurden, zur hçchsten Aktivitt gegenber 1 und das Produkt 1 a konnte mit einem ee von >99 % erhalten werden (Abbildung S5). Die erhaltenen Produktkonzentrationen von 1 a und 2 a waren niedriger als zuvor berichtet,[34] was grçßtenteils auf ein gendertes
Ex-pressionsprotokoll (19 Stunden statt 2 Stunden) und eine niedrigere Zelldichte (100 gWCWL 1 statt 200 gWCWL 1)
zu-rckzufhren ist. Allerdings untersuchten wir zunchst das Licht-getriebene System unter Verwendung von CDO-halti-gen ganzen Zellen bei einer Zelldichte von 100 gWCWL 1, die
unter den oben beschriebenen Bedingungen exprimiert wurden (19 Stunden), um Selbstbeschattung bei zu hohen Zelldichten zu vermeiden. Wir interessierten uns fr ver-schiedene Photosensibilisator/Elektronendonor-Kombinatio-nen, um die durch die ROs katalysierte Licht-getriebene Hydroxylierung ganzer Zellen anzutreiben (Abbildungen S6– S12, Tabelle 1, Tabellen S9 und S10). Wir haben zunchst MES untersucht, da MES bereits zuvor erfolgreich als effi-zienter Elektronendonor eingesetzt wurde,[37]nicht toxisch ist
und von E. coli-Zellen aufgenommen werden kann.[38, 39]Dem
hier verwendeten E. coli-Stamm fehlt ein natrliches Auf-nahmesystem fr Flavine,[40] deswegen entschieden wir uns
fr einen Photosensibilisator (PS), der leicht von Zellen aufgenommen werden kann[32] und hnliche
Redoxeigen-Abbildung 1. In-vivo-Photoaktivierung einer Rieske-Nicht-Hm-Eisen Oxygenase durch einen knstlichen Lichtsammelkomplex. Der katalytische Umsatz der Oxyge-nase wird durch den angeregten Photosensibilisator vermittelt, der Elektronen vom Opferelektronendonor auf die Oxygenase im Zytoplasma vonE. coli bertrgt.
Schema 1. Licht-getriebene Ganzzell-Oxyfunktionalisierungsreaktionen katalysiert durch CDO beziehungsweise NDO.
4011
schaften wie Flavine aufweist. 5(6)-Carboxyeosin (CE) wurde als erstes gewhlt, da es hervorragende Photosensibilisator-eigenschaften (Abbildung S8) mit einem ERedoxvon 1.06 V
aufweist, hnlich dem ERedoxvon Proflavin.[22]Die
photoen-zymatische Hydroxylierung von 1 und 2 mit 50 mm MES und 100 mm CE bei einer Zelldichte von 100 gWCWL 1 fhrte zur
Bildung der gewnschten Produkte 1 a (bis zu 360 mm in 24 Stunden) und 2 a (bis zu 200 mm in 24 Stunden) unter Belichtung mit weißem Licht. Die erhaltenen Konzentratio-nen von 1 a und 2 a blieben jedoch immer niedrig ( 360 mm, Tabelle 1). Aufgrund der bekannten Toxizitt von 1 und 1 a auf ganze Zellen wandten wir uns Inden 3 als typisches Sub-strat fr ROs zu. In einer nchsten Reihe von Experimenten untersuchten wir die gleiche Photosensibilisator/Elektronen-donor-Kombination fr beide Modellenzyme (Tabelle 1) und stellten fest, dass mit 3 Umstze von bis zu 85 % erzielt wurden. Da 3 das vielversprechendste Substrat fr eine de-taillierte Charakterisierung unseres Licht-getriebenen Sys-tems darstellte, haben wir unsere Aufmerksamkeit auf die Untersuchung weiterer Photosensibilisator/Elektronendo-nor-Kombinationen gelenkt. Wir untersuchten EY, Rose Bengal (RB) und CE mit EDTA, aber auch mit MOPS und MES als Elektronendonoren, da diese von Zellen aufge-nommen werden kçnnen (Tabelle 2).[22, 39, 41, 42]Der
Elektron-endonor kann ein Hindernis in diesem photobiokatalytischen Ansatz darstellen,[23]da EDTA unter Umstnden
inkompa-tibel mit den ROs sein kann, da es das Fe3+-Ion, dass sich im
aktiven Zentrum der Oxygenase befindet, potentiell binden kann. Wir konnten jedoch weder einen Ak-tivittsverlust von NDO H295A und CDO M232A in Dunkelreaktionen mit EDTA (Abbildung S13), noch Toxizittseffekte von MES/MOPS auf die Zellen feststellen (Abbildung S14). Darber hinaus wurde bei der Durchfhrung der Licht-getriebenen Hydroxylierungen mit lysierten Zellen Produkt-konzentrationen von nur 5.6 mm im Vergleich zu 8.5 mm mit ganzen Zellen erzielt (Tabelle S11), was zeigt, dass die Zellen nicht unter den Elektronen-donoren oder deren Zersetzungsprodukten leiden. Die erhaltenen Produktkonzentrationen mit 3 als Substrat sind in Tabelle 2 zusammengefasst. Reak-tionen mit EDTA fhrten im Allgemeinen zu einer geringeren Produktbildung im Vergleich zu Reak-tionen mit MOPS und MES. Es konnten jedoch auch mit EDTA Produktkonzentrationen von bis zu 7.5 mm erzielt werden, was zu der Annahme fhrt, dass EDTA das katalytische Eisen-Ion nicht vom aktiven Zentrum des Enzyms abzieht. Darber hinaus konnten wir feststellen, dass die Verwendung von 3 als Substrat und die Kombination von CE mit MES die Produktbildung in den mm-Bereich stei-gerte, was zu einem Umsatz von bis zu > 85 % in-nerhalb von 24 Stunden fhrte (Tabellen 1 und 2). Die Bestimmung der einfallenden Photonenfluss-dichte (Abbildung S11 B) ergab, dass die Lichtin-tensitt an jeder Position des Lichtreaktors in einem Bereich zwischen 32 und 112 mE L 1s 1variiert, was
eine Lichtintensitts-abhngige photochemische Hintergrundreaktion verursacht. Diese photoche-mische Hintergrundreaktion wird nur bei Verwendung von 3 als Substrat beobachtet und fhrt innerhalb von 6–20 Stunden zur Akkumulation von trans-3 b (Abbildungen S15–S17). Darber hinaus wurde die Bildung von 1-Indanon beobach-tet, die wir einer Isomerisierungsreaktion von 3 a zuschreiben (Tabelle S12).
Zur Bestimmung des einfallenden Photonenflusses wurde die chemische Aktinometrie mit dem gut beschriebenen Ferrioxalat-Aktinometer durchgefhrt (Tabelle 2 und Tabel-le S10).[42]Obwohl die Zellsuspension eine starke Streuung
und optische Absorption durch andere Zell- oder Lçsungs-komponenten aufwies, konnten wir die Quantenausbeuten abschtzen (QY, Tabelle S10). Zustzlich wurden scheinbare Quantenausbeuten (AQY) als das Verhltnis des Zweifachen der beobachteten Produktbildungsrate zum einfallenden Photonenfluss berechnet, da zwei Photonen pro Umsatz er-forderlich sind (Tabelle 2). Die angegebenen AQYs sind zwar niedriger als die typischen Werte, die bei photochemischen Reaktionen erreicht werden. Diese Werte bilden jedoch eine vielversprechende Grundlage fr die weitere Optimierung dieser knstlichen Photosynthese-Systeme.
Um zu untersuchen, ob die beobachtete Produktbildung streng lichtabhngig ist und nur durch den Photosensibilisator vermittelten Elektronentransfer abluft, fhrten wir Kon-trollreaktionen mit einer Leervektor-Kontrolle durch, die mit und ohne Elektronendonor im hellen und dunkeln durchge-fhrt wurden (Abbildung 2 A, Abbildung S19).
Tabelle 1: Photobiokatalytische Hydroxylierung von (R)-Limonen 1, Toluol 2 and Inden 3 katalysiert durch CDO M232A oder NDO H295A im Dunkeln sowie unter Bestrahlung mit Licht.
Enzym Reaktions- Substrat Produkt
Ganzzell-bedingungen Konz. [mm][a] de oder dr [%][b] aktivitt[c] mU gWCW 1 CDO M232A Dunkel/Glucose 1.1 0.1 >99 8.0 Dunkel/CE/MES 0.1 0.04 n.b. Licht/CE/MES 0.4 0.05 2.5 Leervektor Licht/CE/MES 1 0 n.b. n.b. NDO H295A Dunkel/Glucose 0.6 0.02 n.z. 8.8 Dunkel/CE/MES 0 n.b. Licht/CE/MES 0.2 0.01 2.8 Leervektor Licht/CE/MES 2 0 n.b. CDO M232A Dunkel/Glucose 4.8 0.8 100:0 n.b. Dunkel/CE/MES 1.5 0.2 100:0 n.b. Licht/CE/MES 8.3 0.08 90:10 124 NDO H295A Dunkel/Glucose 2.3 0.17 100:0 n.b. Dunkel/CE/MES 0.5 0.03 n.z. n.b. Licht/CE/MES 8.5 0.4 86:14 107 Leervektor Licht/CE/MES 3 0.7 0.2 18:82 n.b.
Reaktionsbedingungen Dunkel: [Substrat] = 10 mm, [Glucose] = 20 mm, [Ganze Zellen] = 100 gWCWL1(E. coli JM109(DE3)_pDTG141_NDO H295A oder E. coli
JM109_pCDOv1_CDO M232A), Natriumphosphatpuffer (pH 7.2, 50 mm), 24 Stunden. Reaktionsbedingungen Licht: [Substrat] = 10 mm, [Ganze Zel-len] = 100 gWCWL 1(E. coli JM109(DE3)_pDTG141 NDO H295A oder E. coli
JM109_pCDOv1_CDO M232A), MES Puffer (50 mm), Weißlicht Beleuchtung (max. 112 mE L1s 1) 24 Stunden; n.z. nicht zutreffend; n.b. nicht bestimmt.[a] Fr 3
be-ziehen sich die Produktkonzentrationen auf die Summe von 3 a und 3 b; [b] Das Diastereomerenverhltnis wurde nach 4–6 Stunden ermittelt; [c] Bestimmt aus dem linearen Bereich der Produktbildung aus den kinetischen Profilen fr jede Reaktion (Abbildungen S20–S25).
In der Tat waren die erhaltenen Produktbildungen mit den Leervektor-Kontrollen unter dunklen und hellen Bedin-gungen viel geringer. Wir fhren den Umsatz im Dunkeln auf die Produktion von Kohlenhydraten zurck, die unter „Hungerbedingungen“ zur Regeneration von NAD(P)H verbraucht werden.[26, 27, 43, 44] Unter Lichtbedingungen wurde
jedoch eine photochemische Hintergrundreaktion beobach-tet, die je nach angewandter Lichtintensitt zwischen 0.15 und 3.5 mm und je nach angewandter Photosensibilisator/Elek-tronendonor-Kombination variierte (Abbildung 2 A, Abbil-dung S19). Die Hintergrundreaktion trug bis zu 12 % zur gesamten Produktbildung bei, wenn CE/MOPS verwendet wurden, und 35 %, wenn RB/MOPS verwendet wurden (Abbildung 2 A), was darauf hinweist, dass die photochemi-sche Hintergrundreaktion vom Photosensibilisator abhngt. Diese Fhigkeit scheint durch die angewendete Lichtinten-sitt begrenzt zu sein, da die gesamte Hintergrundreaktion in allen Fllen niedrig blieb (< 0.5 mm), wenn niedrigere Lich-tintensitten angewendet wurden, was besttigt, dass die Reaktion tatschlich Licht-getrieben ist. Außerdem unter-suchten wir den Einfluss des Photosensibilisators (Abbil-dung 2 B) und der Elektronendonatorkonzentration sowie der Zelldichten (Abbildung S18) auf die Effizienz der pho-tokatalytischen Aktivierung von NDO H295A.
Unter Lichteinstrahlung ist die RO-katalysierte Hydro-xylierung von 3 am effizientesten, wenn CE-Konzentrationen von 80 bis 100 mm eingesetzt werden. Zwischen 10 mm und 80 mm CE wurde eine Zunahme der Produktbildung beob-achtet (Abbildung 2 B). Wenn jedoch > 100 mm CE verwen-det werden, kann kein weiterer Anstieg beobachtet werden, d. h. dass oberhalb von 100 mm CE entweder die Konzentra-tion nicht mehr limitierend ist oder der Transport des Pho-tosensibilisators in die Zellen vermindert ist (Abbildung 2 B). Wir beobachteten jedoch Photobleaching ber die Zeit. Wenn zustzliche 100 mm CE zu der Licht-getriebenen Hy-droxylierungsreaktion gegeben wurden, beschleunigte sich die Produktbildung erneut und 6 Stunden nach Zugabe von zustzlichem CE wurden bereits 7.2 mm Produkt gebildet, im Gegensatz zu nur 3 mm ohne Zugabe von zustzlichem CE (Abbildung 3 A).
Wir untersuchten weiterhin den Effekt der Erhçhung der Zelldichte auf die Effizienz der Licht-getriebenen Hydroxy-lierungsreaktion (Abbildung S18). Bei Erhçhung der Zell-dichte sowie der Elektronendonorkonzentration (CE kon-stant) ist zu erkennen, dass die Produktbildung bei hçherer Zelldichte durch die Konzentration des Elektronendonors beeinflusst wird, da mehr photoinduzierte Elektronen auf das Enzym bertragen werden.
Tabelle 2: Die Kombination von Photosensibilisator und Elektronendonor ist ein wesentlicher Faktor fr die Effizienz der Licht-getriebenen Reaktion.
Enzym
Photo-sensibilisator
Produkte Ganzzellaktivitt Apparente
Quantenausbeute Elektronen-donor Maximum Konzentration [mm][a] Diastereomeren-verhltnis cis/trans-3 b [%][b] Verhltnis 3 a/3 b [%][c] Spezifische Aktivitt[d] [mU gWCW 1] Produktivitt [mm h1 ] [%]
CDO M232A EY/EDTA 3.7 0.4 100:0 3:97 29 0.18 0.09
EY/ MOPS 6.8 0.03 100:0 0:100 21 0.13 0.06 EY/ MES 4.7 0.2 100:0 4:96 41 0.25 0.12 RB/ EDTA 6.8 0.3 96:4 4:96 265 1.59 0.78 RB/ MOPS 7.3 0.6 95:5 4:96 156 0.94 0.46 RB/ MES 5.8 0.4 95:5 3:97 275 1.65 0.81 CE/ EDTA 4.0 0.01 94:6 2:98 43 0.26 0.13 CE/ MOPS 8.6 0.6 88:12 0:100 102 0.61 0.30 CE/ MES 8.3 0.08 90:10 0:100 124 0.75 0.37
NDO H295A EY/EDTA 4.7 0.2 96:4 4:96 47 0.23 0.11
EY/ MOPS 7.7 0.4 83:17 2:98 61 0.37 0.18 EY/ MES 7.4 0.3 86:14 4:96 87 0.52 0.26 RB/ EDTA 7.5 1.0 97:3 0:100 53 0.32 0.16 RB/ MOPS 7.5 1.2 95:5 2:98 148 0.89 0.44 RB/ MES 7.9 0.6 97:3 3:97 79 0.45 0.22 CE/ EDTA 5.5 0.5 94:6 6:94 50 0.30 0.15 CE/ MOPS 7.3 0.4 95:5 18:82 143 0.86 0.42 CE/ MES 8.5 0.4 86:14 0:100 107 0.64 0.32
Reaktionsbedingungen: [3] = 10 mm; [Ganze Zellen] = 100 gWCWL1(E. coli JM109(DE3)_pDTG141_NDO H295A oder E. coli JM109_pCDOv1_CDO
M232A); Natriumphosphatpuffer (pH 7.2, 50 mm) wenn 25 mm EDTA eingesetzt wurden, ansonsten 50 mm MES/MOPS Puffer; weißes Licht (max. 112 mE L1
s 1
).[a] Summe von 3 a und 3 b; Zeitpunkte der Bestimmung wurden gewhlt, wenn die Produktkonzentration maximal whrend des zeitlichen Verlaufs der Reaktion war; [b] Das Diastereomerenverhltnis wurde nach 4–6 Stunden ermittelt; [c] Bestimmt nach 24 Stunden; [d] Be-stimmt aus dem linearen Bereich der Produktbildung aus den kinetischen Profilen fr jede Reaktion (Abbildungen S19–S24).
4013
Allerdings scheint das System durch die angewendeten Lichtintensitten (max. 112 mE L 1s 1) limitiert zu sein, d. h.
das von einer bestimmten Zelldichte an die Produktkonzen-tration nicht mehr von der KonzenProduktkonzen-tration des Elektronen-donors abhngig ist, sondern dass an diesem Punkt die Lichtintensitt den limitierenden Faktor darstellt.
Die Lichtintensitt spielt eine entscheidende Rolle fr die Effizienz der Licht-getriebenen Katalyse und beeinflusst das Ausmaß der photochemischen Hintergrundreaktion. Bei einer Reduzierung der Lichtintensitt um 75 % sanken die erhaltenen Produktkonzentrationen um nur 20 % (Abbil-dung S10 B).
Schließlich verfolgten wir die Licht-getriebene Reaktion in einem Zeitverlaufsexperiment ber 24 Stunden unter op-timierten Bedingungen (Abbildung 3 B). Die Produktbildung verluft innerhalb von 24 Stunden nach der Reaktion rei-bungslos. Bei NDO H295A/MES/CE und CDO M232A/ MOPS/CE wird jedoch nach 20 Stunden kein signifikanter Produktanstieg mehr beobachtet. Bemerkenswert ist, dass bei Verwendung von SO in Kombination mit MOPS oder EDTA die erhaltenen Produktkonzentrationen im Vergleich zu an-deren Kombinationen aus Photosensibilisator und Elektron-endonor immer niedriger blieben.
Zusammenfassend haben wir die Photoaktivierung von zwei verschiedenen ROs in einem E. coli-basierten Ganz-zellsystem durch Kopplung von Lichtsammelkomplexen an Hydroxylierungsreaktionen in vivo gezeigt. Dies wurde
er-Abbildung 2. A) Kontrollreaktionen mit NDO H295A unter Licht (*) und Dunkel (*) Bedingungen mit (+) oder ohne ( ) 100 mm EY, RB
oder CE in Gegenwart von NDO H295A (rote Balken) oder mit einer Leervektor-Kontrolle (graue Balken) in 50 mm MOPS. Die Werte fr die Leervektor-Kontrolle waren die hçchsten, die erreicht wurden, wenn die max. Lichtintensitt von 112 uE L 1
s 1
genutzt wurde. B) Einfluss der Photosensibilisator-Konzentration auf die Produktausbeute. Unter-schiedliche CE-Konzentrationen in Kombination mit MES als Elektron-endonor in der Licht-getriebenen Ganzzell-Hydroxylierungsreaktion unter Verwendung von NDO H295A. Reaktionsbedingungen: 0– 320 mm Photosensibilisator, 10 mm 3, 50 mm MES, 100 gWCWL 1ganze
Zellen (E. coli JM109(DE3)_pDTG141_NDO H295A, 19 h Expression), 50 mm MES, weißes Licht (max. 112 mE L1
s 1
), 30 8C, 140 rpm.
Abbildung 3. A) Einfluss des Photobleaching von CE auf den zeitlichen Verlauf der durch NDO H295A katalysierten Licht-getriebenen Hydroxy-lierung. Die rote Kurve zeigt die Zugabe von erneut 100 uM CE nach 4 Stunden Biotransformation, whrend die schwarze Kurve die Licht-getriebene Biotransformation ohne Zugabe von zustzlichem CE zeigt. B) Kinetisches Profil ermittelt fr die Licht-getriebene Hydroxylierungs-reaktion ganzer Zellen unter Verwendung von CDO M232A und NDO H295A mit SO, CE und EY in Kombination mit entweder EDTA, MOPS oder MES als Elektronendonoren. Reaktionsbedingungen: 100 mm Pho-tosensibilisator, 10 mm 3, 25 mm EDTA oder 50 mm MOPS/MES, 100 gWCWL 1ganze Zellen (E. coli JM109(DE3)_pDTG141_NDO H295A
oderE. coli JM109_pCDOv1_CDO M232A, 19 h Expression), weißes Licht (max. 112 mE L 1
s 1
folgreich durchgefhrt, indem mehrere Photosensibilisatoren fr die Biokonversion von drei verschiedenen Substraten eingesetzt wurden, und stellt demzufolge das erste Beispiel fr photoinduzierte RO-Systeme dar. Dieses System bietet insbesondere fr solche anspruchsvolle Mehrkomponenten-Enzyme den Vorteil, auf die gut untersuchte genetische Toolbox von E. coli als Wirt zurckgreifen zu kçnnen, wo-durch eine breite Anwendbarkeit der Licht-getriebenen knstlichen Photosynthese ermçglicht wird. Die erhaltenen Produktbildungen von bis zu 1.3 g L 1und Geschwindigkeiten
von bis zu 1.6 mm h 1 zeigen, dass im Vergleich zu
Cyano-bakterien kompetitive Produktivitten erzielt werden konn-ten.[28]
Die Kopplung von artifiziellen Lichtsammelkomplexen an Enzyme innerhalb von Zellen stellt eine vielseitige Mçg-lichkeit dar, um vielfltige und selektive Licht-getriebene chemische Synthesen durchzufhren, insbesondere wenn in-stabile oder Mehrkomponenten Enzyme eingesetzt werden.
Danksagung
Dieses Projekt wurde aus Mitteln des Forschungs- und In-novationsprogramms „Horizont 2020“ der Europischen Union im Rahmen der Marie-Skłodowska-Curie-Finanzhil-fevereinbarung Nr. 764920 finanziert. Wir danken Prof. Dr. Rebecca Parales fr die Bereitstellung des Vektors pDTG141, der die NDO-Gene enthlt, und Prof. Dr. Hideaki Nojiri fr das Plasmid pIP107D, das die CDO-Gene enthlt.
Interessenkonflikt
Die Autoren erklren, dass keine Interessenkonflikte vorlie-gen.
Stichwçrter: Biokatalyse · Oxyfunktionalisierung · Photoinduzierter Elektronentransfer · Photokatalyse · Rieske-Dioxygenasen
Zitierweise: Angew. Chem. Int. Ed. 2020, 59, 3982 – 3987 Angew. Chem. 2020, 132, 4010 – 4016
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Manuskript erhalten: 13. November 2019 Akzeptierte Fassung online: 18. Dezember 2019 Endgltige Fassung online: 24. Januar 2020
