Project 505.0620
Ontwikkeling methoden voor het aantonen en bepalen van hormonen (drs R. Schilt)
Rapport 88.25 Maart 1988
STABILITEIT VAN EEN AANTAL HOIU>100N-ESTERS NA H0t-10GENISATIE VAN DEEL-HONSTERS VAN TOEDIENINGSPLAATSEN
H. Hooijerink en drs R. Schilt
Afdeling: Blofarmaceutische Analyse
Goedgekeurd door: dr F.A. Huf
Rijks-Kwaliteitsinstituut voor land- en tuinbouwprodukten (RIKILT) Bornsesteeg 45, 6708 PD Wageningen
Postbus 230, 6700 AE Wageningen Telefoon 08370-19110
Telex 75180 RIKIL Telefax 08370-17717
VERZENDLIJST
INTERN: Directeur Sectorhoofden
Produktcoördinator Dierlijke Produkten Projectbeheer Circulatie Bibliotheek Afdeling BFA (Sx) EXTERN: CLRVV
Benelux Werkgroep Hormonen
Overname van de inhoud is toegestaan, mits met duidelijke bronvermel-ding.
I
INHOUD
blz
SA!>1ENVATTING I I
1 INLEIDING 1
2 METHODE VAN ONDERZOEK 1
2.1 Apparatuur 1
2.2 Reagentia 2
2. 3 \~erk\-lijze 2
3 RESULTATEN 3
I I
SANENVATTING
In dit inventariserend onderzoek is de mogelijkheid onderzocht tot ho-mogenisatie van spuitplaatsen. Daartoe is de stabiliteit bepaald van een aantal steroidhormoonesters in vleesextracten. Deze extracten zijn gedurende twee perioden (6 en 16 weken) bij verschillende temperaturen bewaard en vervolgens zijn met hogedrukvloeistofchromatografie de con-centraties bepaald.
De onderzochte steroidesters, estradiolbenzoaat, nortestosterondeca-naat en testosteronpropionaat, bleken onder de proefomstandigheden voldoende stabiel. Herkeuring na 3 tot 6 maanden is zonder problemen mogelijk.
-1-1 INLEIDING
Om te voorkomen dat discrepanties optreden in analyseresultaten, b.v. bij een heranalyse, is gezocht naar een manier om spuitplaatsen of
resten van een injectiepreparaat zo homogeen mogelijk te verdelen in een aantal porties. Een van de mogelijkheden om spuitplaatsen te h
omo-geniseren is malen of mengen met behulp van een mixer.
Nadeel hiervan is dat er een kleine mixer beschikbaar moet zijn en die
erg gemakkelijk gereinigd moet kunnen worden.
Deze methode is niet aantrekkelijk omdat injectieplaatsen vrij klein
kunnen zijn en crosscontaminatie niet uitgesloten is. Een andere moge-lijkheid om te homogeniseren is een vloeistofextractie met een
orga-nisch oplosmiddel. Aan dit oplosmiddel wordt een aantal eisen gesteld
zoals, de sterolcl-hormoonesters moeten goed oplosbaar zijn, stabiel
blijven in het oplosmiddel en het oplosmiddel mag niet te vluchtig zijn.
Het doel van dit inventariserend onderzoek is het nagaan van de
stabi-liteit van een aantal steroid-hormoonesters. Met de modelstoffen
testosteronpropionaat, estradiolbenzoaat en nortestosterondecanoaat worden de volgende experimenten uitgevoerd. Aan een methanolisch vleesextract wordt steeds een bekende hoeveelheid hormoonester toe-gevoegd. Een deel wordt bewaard bij kamertemperatuur en een deel bij
0
-20 C. Hiernaast wordt het experiment ook uitgevoerd zonder
vlees-extract. Op verschillende tijdstippen wordt een monster getrokken, dat ,.,ordt onderzocht met hogedrukvloeistofchromatografie met UV-detectie.
2 HETHODEN VAN ONDERZOEK
2.1 Apparatuur
De vloeistofchromatograaf bestond uit twee vloeistofleveringssystemen (Waters model 6000A en Waters model 590), een automatisch
injectie-systeem (Waters WISP 7108) een UV-detector (golflengten: 254 nm en
280 nm) (Waters model 440). De pompen en het injectiesysteem werden bestuurd door een systeemcontroller (Haters model 720). De scheiding
werd verkregen op een voorkolom (LiChrosorb RP 18, 10 }.lln, 30 x 3, 2 mm,
Bro\.,rn Lee) en een analytische kolom (Shandon Hypersil ODS, 5 J.Jm, 250 x 0
-2-kolomoven (Spark model SPH 99). Een integrator (Waters Data Module) werd gebruikt om retentietijd te meten en de piekoppervlakte te berekenen.
Tabel 1 geeft het gradiëntprofiel.
Tabel 1: Gradiëntprofiel
Tijd FloH % A % B Curve
min ml/min initia! 2,0 70 30
*
20,0 2,5 100 0 6 24,0 2,5 100 0 6 25,0 2,0 70 30 11%
A methanol/water (95/5; V /V);%
B methanolholater (5/95; V /V). 2.2 ReagentiaAlle reagentia waren UV-grade produkten. Testosteronpropionaat (CAS:
57-85-2), estradiolbenzoaat (CAS: 50-50-0) en nortestosterondecanoaat (CAS: 360-70-3) waren afkomstig van Sigma.
De twee mobiele fasen waren methanol/water (95/5; V/V) en methanol/ water (5/95; V/V).
De eerste loopvloeistof Herd gefiltreerd door een 0,5 ~m membraan (Hillipore FH) en de laatste door een 0,45 ~m membraan (Millipore HA).
2. 3 Werk1<1ijze
De standaarden werden opgelost in methanol in een concentratie van
1 mg/ml. Als werkoplossing werd een verdunning gebruikt van 0,1 ~g/ml
(in methanol).
Als extractiemiddel is gekozen voor methanol, omdat de meeste
hormoon-esters hierin goed oplosbaar zijn en de vluchtigheid niet te groot is.
Aan 1 gram gehomogeniseerd (moulinette) vlees werd 5 rol methanol
toe-gevoegd en met behulp van een whirlmix 30 sec intensief gemengd. Het
extract werd afgecentrifugeerd en de methanolfase werd overgebracht in
een maatkolf van 10 ml. Van iedere standaardoplossing (100 ng/~1) werd 100 ~1 gepipetteerd (1 standaard per monster).
-3-Vervolgens werd de oplossing in een maatkolf met methanol op volume gebracht.
De beginconcentratie van iedere hormoonester was 1,0 ~g/ml.
Voor iedere HPLC-analyse werd 2,0 ml gepipetteerd, ingedampt tot droog
en opgenomen in 250 ~1 HPLC-eluens. 150 ~1 hiervan werd op het HPLC
-systeem geïnjecteerd.
Van het resterende gedeelte werd een deel op een HPTLC-plaat gebracht.
Tegelijkertijd werden methanolische oplossingen van de standaarden met
dezelfde concentraties gemaakt.
Alle oplossingen en extracten werden in 6-voud gemaakt. Na bereiding
0 0
werd de helft van de monsters bij -20 C en de rest bij +20 C (in het
donker) bewaard.
3 RESULTATEN
Onderstaand schema geeft de codering van de monsters (ieder monster is
in drievoud onderzocht). A: -20°C lAl 1A2 1A3 nr. 1 Standaardmengsel lBl B: kamertemperatuur 1B2 lB3 A: -20°C 2Al 2A2 2A3 nr. 2 Vleesextract + standaaardmengsel 2Bl B: kamertemperatuur 2B2 2B3
Bereiding monsters in week 32, le analyse in week 38, 2e analyse in
-
4-Tabel 2 geeft de analyseresultaten van de le meting na 6 weken, tabel 3 geeft de analyseresultaten van de 2e meting na 16 weken en tabel 4 geeft een vergelijking tussen de le analyse en de 2e analyse.
Tabel 2: Gehalten hormoonesters le analyse na 6 weken
No. Testosteronpropionaat Estradiolbenzoaat Nortestosterondecanoaat x VC(%) lAl 1,15 0,80 1A2 1,21 1,18 2,6 0,88 1A3 1,17 0,63 lBl 1,17 1,01 1B2 1' 13 1' 16 2,3 0,59 1B3 1,18 0,64 2Al 0,84 0,67 2A2 0,81 0,82 2,1 0,66 2A3
-
2Bl 0,81o
,
72 1 '02 0,93 2B2 0,72 0,97 23,6 0,64 2B2 1,17 1,001 karnartemperatuur (in het donker) 2 -20
c
A zonder vleesextract B met vleesextract
VC: variatie-coëfficiënt in procenten
}.lg/ml x 0, 77 0,75 0,68 0,86
Tabel 3: Gehalten hormoonesters in lJg/ml 2e analyse na 16 weken VC(%) 16,6 30,7 4,7 22,3 No. Testosteronpropionaat Estradiolbenzoaat x VC(%) lAl 0,99 0,59 1A2 1' 08 1' 03 4,4 0,54 1A3 1 '02 0,51 lBl 1,20 0,40 1B2 1,22 1,15 9,6 0,36 183 1 '02 0,27 2Al 0,76 0,60 2A2 0,87
o,
83 7,3 0,68 283 0,86 0,76 2Bl 1 '02 0,75 282 0,98 1,00 2,0 0,68 283 1 '00 0, 721 karnartemperatuur (in het donker)
2 -20
c
A zonder vleesextract B met vleesextract
VC: variatie-coëfficiënt in procenten **: niet opgenomen in gemiddelde
}.lg/ml x VC(%) 0,55 7,4 0,34 19,4 0,68 11,8 0, 72 4,9 x VC(%) 0,93 1,00 0,97
~
0,96 0,98 0,93 0,96 2,6 0,96 0,43 0,45 0,46 9,0 0,51 0,62 0,48 0,66 30,8 0,88 Nortestosterondecanoaat x VC(%) 0,78 0,85 0,81 4,5 0,80 0,30** 1,02 0,93 13,7 0,84o
,
28 0,35 0,33 12,4 0,35 0,28 0,29 0,31 15,7 0,37
-5-Tabel 4: Samenvattende tabel van de le en 2e analyseresultaten
No. Testosteronpropionaat Estradiolbenzoaat Nortestosterondecanoaat
J.lg/ml
-le 2e le lA 1,18 1, 03o,
77 lB 1,16 1,15 0,75 2A 0,82 0,83 0,68 2B 0,97 1,00 0,851 kamertemperatuur (in het donker)
2 -20°C A zonder vleesextract B met vleesextract 4 CONCLUSIE/DISCUSSIE 2e le 0,55 0,97 0,34 0,96 0,68 0,46
o,
71 0,66Indien wordt uitgegaan van een algemene toename van reactiesnelheden
0
met een factor 2 per 10 C temperatuurstijging zijn de
kamertempera-a
tuurbewaarperioden, omgerekend naar een bewaring bij -20 C (diep-vries), te beschouwen als:
0 0
1. 6 \-leken 20
c
komen overeen met 6 x 16 96 weken -20 C (bijna 2jaar).
0 0
2. 16 \oJeken 20
c
komen overeen met 16 x 16 256 weken -20 C (ca. 5jaar).
Uit de samenvattende tabel (tabel 4) blijkt dat de respons van de drie stercidesters in de tijd enigszins verschillend is. Tes tosteronpropio-naat blijkt onder de bewaarcondities stabiel. Bij estradiolbenzoaat is
een afname van het gehalte bij bewaring bij kamertemperatuur meetbaar,
terwijl in tegenstelling tot de verwachting bij nortestos terondeca-noaat een toename van het gehalte bij bewaring bij kamertemperatuur optreedt.
Met behulp van dunnelaagchromatografie is aangetoond dat uit
estra-diolbenzoaat extradiol gevormd wordt en dat uit nortestosterondeca -noaat nortestosteron gevormd wordt.
Alhoewel het ten tijde van het experiment niet mogelijk was de
monsters direct na bereiding te onderzoeken, kan op grond van de resultaten worden geconcludeerd dat de stabiliteit van de onderzochte
esters voldoende is, zodat de esters bij heronderzoek na een periode
van ca. 3 tot 6 maanden opnieuw kunnen worden aangetoond.
R8825 Hoo/YL 2e 0,81 0,93 0,33 0,31
