Bepaling van chlooramfenicol in melk met reduktieve LCEC

in melk met reduktieve LCEC Bijlagen: 7

Verzendlijst: direkteur, sektorhoofd (2x), direktie VKA, afd. SERH (10x), afd. Normalisatie (Humme), Projektbeheer, Projektleider (Buizer), afd. Microbiologie, afdeling Diergeneesmiddelen, afd. Organische Contaminanten, afdeling Anorganische Contaminanten, afdeling Toxicologie,

1,:• I I I

.

' I ')! I'•

Projekt: Ontwikkeling methoden voor het aantonen en bepalen van anti-biotica

Onderwerp: Bepaling van chlooramfenicol in melk met reduktieve LCEC

Doel:

Ont\.;rikkelen van een kwantitatieve bepaling van chlooramfenicol in melk op het ~g/1 niveau met behulp van reduktieve LCEC.

Samenvatting:

Het is bekend dat bij het extraheren van lichaamsvloeistoffen, zoals urine en melk, zeer snel emulsies optreden. Door gebruik te maken van Extrelut kolommen is het emulsieprobleem opgelost. Om het eventueel aam.;rezige vet te verwijderen volgt nog een vloeistof/vloeistof extraktie. Uiteindelijk vindt reduktieve elektrochemische detektie plaats na een vloeistofchromatografische scheiding.

Conclusie:

Het is mogelijk met de door ons ontwikkelde analysetechniek chloor-amfenicol in melk te bepalen.

De detektiegrens ligt bij ca. 1 ~g/1, terwijl het terugvindingapercen-tage ongeveer 65% is.

Verantwoordelijk' dr W,G, de Ruig

4Z

:hK:"

Medewerker/Samensteller: H. Hooijerink ~ Projektleider: drs F.G. Buizer ~

I.:! I I ,

•a •• ~ 11 [I

organismen.

In de humane geneeskunde wordt, vanwege zijn toxicologische neven-werkingen, chlooramfenicol nog slechts sporadisch gebruikt. Het

gebruik van chlooramfenicol zou o.a. beenmergbeschadiging kunnen veroorzaken.

De toepassing van chlooramfenicol bij melkvee is in de Verenigde

Staten verboden, maar in Europa \Wrdt het gebruikt voor de behandeling van mastitis. In de Verenigde Staten geldt de zgn. "nul"-tolerantie. In de literatuur worden een aantal analysetechnieken beschreven voor de bepaling van chlooramfenicol in melk. Gaschromatografie (1-3) en

vloeistofchromatografie met UV-detectie (4-6) zijn de meest gebruikte analysetechnieken. Deze analysetechnieken vereisen een intensieve

monstervoorbereiding. Chlooramfenicol is een elektrochemisch aktieve

stof. Van der Lee (7,8) beschrijft de combinatie van electrochemie en

vloeistofchromatografie voor de bepaling van chlooramfenicol in

biolo-gisch materiaal op het residu niveau. De door ons ontwikkelde LCEC methode verschilt in twee opzichten met die van Van der Lee namelijk

een snelle en eenvoudige monstervoorbehandeling en een andere

elektrochemische detectiemethode. Uitgaande van 20 ml monstermateriaal kan een detektiegrens van 1 )Jg/1 gehaald \<lOrden. De

monstervoor-bereiding bestaat uit een kolomchromatografische voorzuivering m.b.v.

een Extrelutkolom (9) en een vloeistof/vloeistofextractie (10).

2. Methoden van onderzoek.

2.1 Monstervoorbereiding 2.2 Vloeistofchromatografie

2.3 Elektrochemische detektie

2.4 Terugvindingsexperimenten.

2.1 Monstervoorbereiding

Uit literatuurgegevens is bekend dat diethylether en ethylacetaat

organische oplosmiddelen zijn \<laar chlooramfenicol goed in oplost. Bij

extraktie van melk treedt met deze oplosmiddelen echter al snel een emulsie op.

-"

Door gebruik te maken van Extrelut kolommen kan chlooramfenicol op een gemakkelijke manier uit de melk-matrix geëxtraheerd worden. Een waterige oplossing van 20 ml kan op de Extrelut kolom gebracht worden. Het monster verdeelt zich op het dragermateriaal, waarna geëlueerd wordt met ethylacetaat. De waterige fase blijft op de kolom, de orga-nische fase loopt door de kolom en kan direkt na elutie worden

ingedampt. Bij indampen van de organische fase blijkt dat er nog wat vet, afkomstig uit de melk, mee is geëxtraheerd. Dit kan verwijderd worden door eerst het residu op te lossen in methanol en een

natriumchloride oplossing en daarna te extraheren met hexaan. De hexaanfase wordt verworpen en het methanol/natriumchloride mengsel wordt geëxtraheerd met ethylacetaat. Deze ethylacetaatfase wordt na indampen en oplossen in de loopvloeistof geanalyseerd.

2.2 Vloeistofchromatografie

De vloeistofchromatograaf is samengesteld uit een Waters 6000A vloeistofleveringssysteem, een Rheodyne injektiekraan en een rever-sedphase kolom. De stationaire fase bestaat uit Hypersil ODS 5 ~m.

Als mobiele fase is gekozen voor een mengsel van methanol en fosfaat -buffer (pH: 5.0). De mobiele fase wordt vlak voor gebruik ontgast en tot vlak voor de analyse wordt er konstant zuurstofvrije stikstof doorheen geleid. Tijdens de analyse wordt er zuurstofvrije stikstof opgeleid i.p.v. doorgeleid in verband met het verlopen van de

retentietijd. Er is een puls-demper in het systeem opgenomen om druk-verschillen zo minimaal mogelijk te maken.

2.3 Elektrochemische detektie

De elektrochemische detektie berust op het reduceren _{van de N0 2} groep van chlooramfenicol.

H PIHCCOCHCt2

"''-@--

j

-

1

-

'

"'

~

OH H

fig. 1 struktuur formule chlooramfenicol

-Voor reduktieve elektrochemische detektie ~vordt gebruik gemaakt van een elektrochemische doorstroomdetektor, PAR model 310, gekoppeld aan een polaragrafische detektor, de PAR model 174 A (11). Bij onderzoek is gebleken dat de signaal/ruisverhouding voor een hangende kwikdrup-pel elektrode (HHDE) beter is dan voor een druppelende k~vikelektrode

(SMDE). Ook heeft de druppelende kwikelektrode het nadeel dat deze soms op de uitstroomopening (Nozzle) van de doorstroomcel valt.

fig. 2 LG adapter 1 cellichaam 2 Nozzle

3 Vloeistofinlet 4 K~vikcapillair.

Er werden twee elektrochemische meettechnieken onderzocht: Direct Current Amperometry (DCA) en Differentlal Pulse Amperometry (DPA). Het verschil tussen deze twee technieken is dat het meetgebied bij DCA groter is dan bij DPA. DPA is selektiever dan DCA. Het elektroche-mische gedrag van chlooramfenicol met deze technieken is te zien in fig. 3 en fig. 4.

Elektrochemische detektie met DPA blijkt gevoeliger te zijn dan met DCA (zie fig. 7 en fig. 8).Bij reduktieve elektrochemische detektie kan de aanwezigheid van zuurstof in de loopvloei~tof en het monster de analyse storen (13). DPA blijkt minder gevoelig te zijn voor zuurstof dan DCA.

Op grond van deze ervaringen heeft Differentlal Pulse Amperometry de voorkeur boven Direct Current Amperometry.

-2.4 Terugvindingsexperimenten

Onderstaande tabel geeft het terugvindingspercentage, bepaald met LCEC,

van chlooramfenicol toegevoegd aan melk in concentraties van 5-50

~g/1. Het terugvindingspercentage op het ~g/1 niveau ligt tussen 57 en

70%.

Aantal rul melk Toevoeging Concentratie Terugvindingspercentage

ng ~g/1 20 100 5 57,9 20 250 12,5 67,2 20 500 25 70,6 20 1000 50 63,4 Gemiddeld 64,1%. Conclusie.

Met de door ons ontwikkelde analysetechniek is l~t mogelijk om op een

snelle, eenvoudige manier chlooramfenicol in melk te bepalen. De detektiegrens ligt bij ca. 1 ~g/1. Het terugvindingspercentage bedraagt op het ~g/1 niveau 64% (variatie-coefficient 9,7%). De methode is vastgelegd in het Interne Analysevoorschrift nr. G 221.

-., I ,,

Literatuur.

1. J.M. Wal, J.C. Peleran enG. Bories, Journal of Chromatography, 168 (1979) 179-185.

2. E. Hollstein, \~. Lane enG. Zapff, Die Nahrung ~, 2 (1981) 143-149. 3. J. Hamann, A. Tolle, A. Blüthgen en

w.

Heeschen. Milclmissenschaft

30, (2) (1975) 68-75.

4. B. Johannes, K.H. KHrfer, J. Schad en I. Ulbrich, Archiv für

Lebensmittelhygiene 34, (1983) 1-28.

5. H. Petz,

z.

Lebensmittel Unters. Forsch (1983) 176, 289-293.

6. J.H. Wal, J.C. Peteran en G. Bories, J. Assoc. Off. Anal. Chem.

63, (1980) 5, 1044-1048.

7. J.J. van der Lee, Proefschrift Rijksuniversiteit Leiden, 1981. 8. J.J. van der Lee, H.B.J. Van der Lee-Rijsbergen, U.R. Tjaden en

W.P. van Bennekom, Analytica Chimica Acta, 149 (1983) 29-38.

9. Extrelut, Neues Verfallren zur Extraktion Lipophiler Stoffe, Diagnostica Merck.

10. A. Gerull, Dissertation T.U. Berlin, 1981.

11. Hodel 310, polarographic detektor, operating and service manual,

Princeton Applied Research.

12. Application Note D-2, Deaeration ••• Why and How, Princeton Applied Research.

13. K. Bratin en P.T. Kissinger, J. Liq. Chromatogr. (1981)

4

(Suppl

2), 321-357.

.. , "I

- - -""") E (mV v.s. Ag/AgCl/3~1 _{LiCl in H20)}

fig. 3: Hydrodynamisch voltammogram chlooramfenicol

Elektro-chemisch gedrag chlooramfenicol Condities Operating mode DC HMDE Drop size Vloeistofsnelheid: Eluens Stationaire fase : large 1 ml/min Methanol/fosfaatbuffer LiChrosorb RP 18, 7 ~ (60/40)

-350 -400 -450 -500 -550 -600 -650

E (mV v.s. Ag/AgCl/3t·1LiClin H 20) fig. 4. I/E diagram chlooramfenicol m.b.v. DPA

Condities zie fig. 3.

25 50 75

--~) ng CAP

fig. 5. Standaardlijn chlooramfenicol Condities zie fig. 3.

.

'

I

. -~:-i---+---+---~-f-·-·-_-_-_-r-·---1- ---+-- -- - --- - -- --- -- - - - -- ·-

--

- - - -

--

-

-1-- - + - - +--co - ---- I---_ --- -- ---

~--~--~-=:_~ ~-=~ -=-=-~

----

-·- ---+----l---r---4----+---_{- - - - -}1---+---~---~--~_{- -} 1--~·---~---- -- -- - - -

-- -- -- -- --- -1---..J - - - -- -- -- --j---e)-- -- - - ---~---_ --+--_-_---l'=._-:=__-_- 1_- , -- --- --- -- - --+·---!-- - --- --- --- ---

-- ---

--

--- --- --- --- ---

- - -- -

-- ---

--- - - -

- -

--

---

---- ·--- - -

-

---- - -

-

- -- -- m-- ---- ----·· - - - - ~- f--' . ~-. 9- -

-=-=

-

~

-=-=

:-:~--

- __

===-

=--

-

~

--=-

- --

=-

==

==-

=-- =--

---

--- - - -- -

--t

-

~---t--=--=-t-:---:---,--~~=-_{· -}

-

±

-

==

-

:±

·

=

-

-

=

·

=

·

r-

f---=--

-

-1

--

::-:=-

f-=_{- - - ·} =--_·---11-4 --+--~---_{- - - -}l-·-_--::::-l w

----~

-- f-- -

-1

Ul - _ -~-:::. ~ - - - - 1\---~/

-=---:-::-_

t:=_

- - 1 - - -11 -·- o -_

~~=

,

~

1

\

--

~- -~

-

+ ---

~

~

-

~--

--

~~

--

t

i

~-

=

~

~

~

--

_-

----

-

~-

~

j\

-

--

~

;

=

- 11 ,\

1

=~""

'r..l'l

_

_

,..

_

---o- ·-~~-~~-v\/\; ~- -~~-- '--T>c-::--~---·-~- -1-- -

~

--

~

\

d-

~

·-- --

-

- -

_

--

_

_

.:_ ___

I

~

-

- -4---4 -- - - ---- --- --- ---- - - -- I I

--

--

-

--

~---

·--

--

~

---

~

~-~~

-·--- -

-

1

- - -1 - - --- --- --- --1- - -t- - -- -- -- -- -- -- - - -- - ---

-- -- -- -- -- -- --r---- - - -- - - - -- -- -- -- -- ---- 1- - - -- -- - -- -f--~--1----l----~·-·--_--_--f--::-=--:__-;-__-_::-.::_+----_-_f-_---4_f-_-_--f---+---1~_

---

-

--

-

-·-- - -

--

-- · -- -- -- - - -1 -- -- -- -- -- -- -- -- -- --1- -- -1-- ---·

-

-- -- ----

--

-- --- --- --

---

- --- --- - - --- --- --- -- -- ---- -- --- - -

---

--- - - -

- - - -

--

- ----+----

--=---=-

-~_-_+_-_-_--~--·1----l---l-t-_ -_-_-__ 1-_-_-_--_;_--_-_-_- t_----t_ ~---- -=---

--_ _ -_-~ ·- ___ -_ ---+----· +---~---~----4---1-. ----+---~---1---t---t

- · __

---== =

-:-

r--:

:.:=.

-=- -__ :-_-

__::

_:__

---

- -

--- - - - --- --- ___ -4----~oo~,_-

_

_

-1-·---~---+-~--__ -__ +_ --___ -+~--__ +-~----~+----__ -t-_=-_--=-~---i-_---_-_-_+----r - --- -- - ---1- f-- - -. --- 1- - 1 - - -- - - -- - - -t--- -- -.--- 1-- -- -- ---~----+--~ ... :)---!- ---+---+---+--+--~---l----t----

---

~

~ -~

--

I

==

-

-

:~

\

I

----

- - ---~- --\

---~1--

-

-==--~~

-==-

-=--

_

_:_

_+

-

_

\

- -

-

--=---

---

-

---c=~

-

-t--- - -- -+-+1-- --tl-- - --- -. - -=-- -

-=-=-

-.:-=====---=

1

--

=-

\

J

--===-

=----

_-_

-~-

---

=

_- _ _ _ -::. --___ 1--- -_::---:=-~-=~=

-

---

L

-

· .::._-

~-=--

-

-- --+---+----+--

---- - -

-

-=--

-

-

~-:-

__

.:_

\

-

=

- - -

--- --

-- --1--- -- - ---- · -1----cl--- -- - ---1---t-·-ic.n~-;-- --itt'·-t- - t---- ---n ----+---!++

-~

\

-

.

-

-- -\ ---- -- - - - -- - - -I -·--11H--t--l-- - --- -- ""'-- - --- 1- t -. -- --

-

,

_('._ . ) - - -

·--- ·---·--- -- -

~

_1

rd\

i

:_

~

~

---~

~

~

-

-

---

1-- 1-- 1---- - -- 1-

I

f1't

----

-

--

- ---

-

-_

_J_JU

_-

=

~--

~-~

r-

---

---~

- -

---1 - - - -- 1-- - - -- - - --- - - - --- ---- - -- - .. - - .

-

--- +- -1----t-- -t----+---r----1--1----+---· - -- - - - . - ___

,

_ -

--- --- - - -- - -- -- -- - --

- - - -

-- -- -- - -

---~

~~

-~

==

t=~=t=E

~

~t=

==

=±

====

t===~F-====t==~t

=

~==--- . - .!-'. 1--- - -1- - -- 1- - - -+ - - - - t - - - -1----1- -- -1---- --l -

--- --- --- --- --- --- ---

- - -

----

--- - -

---

---

=

-=-=-=

---=-

-=~- --~:-=~

----

.:.-~

=

-

-

=

~

.

--=

~~-=--- -- -~-

----

-- ---1---c; _ __ ,_ - - - -1---1 - - -11---J---t

-

-

---

-

---~---,:~--=.:_:=-:_- ~=--=--- ~=--=---- - - -·

___

__._---~-=-=-

:::-::::-

.-C'\-.__=:= __

=:-

t===ll=

=::t-==

j:.:=

=

--

-fig. 7. Chromatovoltammogram 10 ppb chlooramfenicol in melk. Direct Current Detectie.

Condities: E

Time constant: Current Range: Recorder -550 mV 3 0.2 ~A 5 V

--- ___ :+--~ __:_:_ t - -+---+- - f - --+----1--+1---+ - - - -f-- -1

-

--

..

i

.

- -

-

I

--!

-- -

-=-=---=-

·

I

- - --

-

I

---

--

-

---

1

---=-

...j

1

-

=--=

1

- - -

----:-;---

--1

--

--+l-

-

_

-

_~_

-

:

+

_

-

-~

-

-

-

__ -+-__

-

-

-

:-

~0~~

~

-~~-

:- -~--=

'

---~+r--

1

-

~

-

-

-

-

+

--

--

-

+-

-

-

~~-

--

~

--

-

--

-U

-~

~

-

-

-

_

-

+

-~

~

- - -

---

-

-_: :

c:-:e::

-

-

lli

~---

-~~

g

/

-=

~

==-=

-

=1=

_::

_-

_

_

-

-

_t

_-

_-

_-~-

_-

_~-

----=

-=--=-

~-

:-=

1

-=-:--=-~

_-

__

f-- -_

~

-:---::

j

1

--

1

-

---

---

,

·

-

- -

--

-

- - -

-1

·--- · -' - - --

-- -- -- -- l f -- ----; - - -- --i -i - - - 1---- --~ --+---+1 +---1---1 - - - - --- - --~

~

~

~

--=~~3

-f

_-

-

-:--

-·

_

_--__

--

--j

I

-·-1--1-Ho -_ ;

I

.

__:_

-

--=__:

l

·

-- ---

I

-

~..:

:

I -il---'--+-1--4----'-1....4---~- '

- - ' cc

:_

::: --

:

_:-J V\

_I

'

I

j

I

- -_-

----

-

-_

_

--

-~

~-

__

....

y

~

il

-_

-

-

--'

~ _

~

--~_c_

: __

ii

lt:

,)

r

t;

T

__

-·

-

-

-=

---

/

~

~

c_

}

~~~~~-=

~

}

~

~,

-

--,

r

----==

~

-

-=---==-= ..:..:.-

=

'

. -

---=---- -

-

-

---

-.

- -+---++oi---1-l-_{- -}- -4- -- + ---1-- - + - - - - '_{--+---- - -}l- -- - - _ _ _ j _{__ ,} - :__ - -=-

=--=c-

=· - --~--=- ~ -=~-

-

--

-

--- ---

=-..:=

-1 --- --- -1- --- - - . - - - -- -~ -

--=--= _---:-

=:-.::.-:::..:.-__ -1- -- . - --1--- -··- -- . - - . N - . . - · -:..:_=..=-.

-

~

--V

-=·~-

=--==.-

.

-::.

-

-= ---

-~

-=

=

·

-~

-=

·--=:_--_--- ·

=

r

-

-

---

- - - - --+- - -· -- . ---- .:.. -- - - -- - - --- -- - - - - -- ·· ~ -- - - --- -- - - 1- - - i -- - 1 - - - _ 9 - t - - - 11-

-.::_ __ . -=

-_,_-_-_--1-1----+---~---1----_-..:=t=---=-~

- - -

-

-.. 1- --- - - - 1--· 1

-- -- -- --

-

===

l

==

=l===t===j

== - - -

-

---

-

-

-

-- -- - - -- - -- l- ---1·--;:::;;-- - 1 - - - - -· - - - - -- 1 -- -1

-fig. 8. Chromatovoltammogram 10 ppb chlooramfenicol in melk.

Differential Pulse Detection.

Condities: E :-500 mV, pulse amplitude: 100

Time constant: 3

Current Range: 0.2 ~A

' ... . · ... \ ... _ \~. . • .

,

.. ·

.n

~.: •• 1 .:. • i. : : ·. •. , I ':_, . r ;;.n J.

.r ..

r • /·. ... ). ·:•

BEPALING VAN CHLOORAMFENICOL IN MELK MET LCEC

Verzendlijst: Normalisatie/harmonisatie, sektorhoofd, bibliotheek (Sx),

afdeling

EIRR

(Sx).

INTERN ANALYSEVOORSCHRIFT NR.~ G--'221:·: :·:: '')(;" ;::.· : '.v"':ï;:_.~-"-' ' .:·; ·: 1e oplage (1983-69-13) :' ·;. ·•_(' -_~::.:·. ~· .. J:i :l:j·. ·:·. : '· .. ~~ ~ /~· ';·.~ ~- ~· .!~ .• ~-:~-~:. :;,;5),1' ·;

...

_.. . '\.•. ,., l I

·r

1. Inleiding • ' I ' I , I o • ~ o ••! '-: •\\ ! \ r I::.

Het chlooramfenicolgehalte in melk wordt bepaald na eea "clean-up"

met behulp van een extrelutko1om, een vloeistof-~] oe' ·<·::.[ ~t-ractier,

:-een scheiding op .een _r.eversed- phase kolom gevolgd ..,<Jq~,.,:.·.re~ukt~ê~re

elektrochemische detektie. . ; !.·.>.•,, ..

2. Omvang_ r

... . .

Na" centri:~t}geren: .illan de _lP~J.k wordt deze gedurende ,Q.nkele. m1.m,ttm 'bij

, ! • •.; ,· I

-20°C gehcq,Jden. Het vet wor.rl t v<>rwijdm:d en rle ;~»at~r.~B;fH~ ... t:Tprd ~ .

overgebracht op een extrelutkolom. Chlóoramfenicol wordt geëluef-~l'd

met ethylacetaat. De ethylacetaatfase wordt droogg,

_-

y~~P.t • ... H~,t. ~esidu

- . . \ ;. ., . , . ~ .

wordt opgenomen in methanol/4% natriumchloride opÏé)ssin·g~"beze fase

wordt tweemaal uitgeschud met hexaan. De waterfase wordt daarna

tweemaal uitgeschud met ethylacetaat ~ De vei~~.am~l_( )\ ethylacetaatfase

- ; I : ~

wordt drooggedampt en het extrakt wordt opgenomer1 --~~n d~ loopvloeistof

van de vloeistofchromatograa.f en ge'lnjekteer·do

De vloeistofchromatografische scheiding bestaat. ui t een vloeis

tofleve-; •. \ , -• • : .. • • 6

ripgssyste~m, een ~n~~ktie~lok en twee C 18 revërsedphásë.kö.torumen:

• - . . I I -" • . . • • ' -~ ' •, ·' • • .

een voorko).om. en een analytische kolom. · - ·•· · · ·

' • • , '••• :, ~- . . :•! f ·.;').' • • t ' 1'.::;,1 ,,~::' ... - .~: • ~:I l;

Het elektrochemische detektiesysteem bes.taat uit t~,f~e delen:

, )J< I I ., ···~ .;.·! i . . .

A. Het nat-chemische gedeelte: de mee teel',' wa~r .. z{ch .de èlektröden

be-vinden.

' ·~. (. ,..! ;:. • ·~ ) ~ ~ • • • • I • '

B. Het elektronische gedeelte: de appar<.'ten vóor ·de. 'levering vaxi de

gewenste polal:'isatieGpann:tng en voor het meten van dP. stroomo

. ' • • • ". ,· • t'r : '') •• r f .. • : ·~- • • .... - • " · •

Voor de meting wordt·. gebruik gemaakt van drie· ·er.~ktrodeiu .. éÈhl·. hángénde

kwikdruppel als werkelektrode, een plat:lna-elektr.ode als hulpelektrode

en een

Ag/

AgCl-elektrode,'

g~

$

~1c\

~et

'-'

3i

·

l

'

:t::i.{i

;

::ln

H

~

b\

.;

~'

l

s

~

·

i=~f

~

{

:

èiitfe

detektor, dat er een koostante polarisatiespanning is. De werkpotentiaal is - 500 mV tegen

As/

AgCl/3M L1Cl in H

2

o.

De techniek die gebruikt::Jwr.d:t · ~.:, di{-f~r~ntial pul se ampe~.Ç>mE7~ry en

-~~ .. puls_a_mplitude is 100 mV. _-·...

_-

_·

_--

-....

·--

·

-

... _, __ ....

De bepaling van chlooramfenicol is gebaseerd op de reduktie van de n_itrogroep aan een kwikelektrode.

' I, _r.

5 .:• ..

3, 9Toepä~sln'k<df·~~è'(j:- ~ ·~-· ' .. :.:-">1.:. -.. · r:.-) :,;

Er wotéh· ·Wé;_,'.).mèthcreé'~e·éë.hreV'en :voor ~de bepal-illg van h~ dh:l.oor amf.e:

-nicolgehalte in melk op het ~g/1 niveau. .J

4. De fini tie ·· ··

Chi~ói-'-~11Îf7Îniéb!J:

<:

rfs

·

·

'

~t:!n

···arlti bioticuû)' en

"\.>~{'r'à

t."! gebr'ui kt M.:j :de

behande-ling vá~.; itt'fe~i-fës·l\1i!rö3r-zàa

kt

:;

·(i'o~r ~:bac t-e·dën

·

;·

en

:v:trussèR"I.

.

.

. ( : ·• r . • .

.

; ... :. . . ..., _·.:J:; >}0. : .. ·:. •-.

.

.

~--

.

:

.. 'I

....

·. ~ ~,.) r;. ~ ·. :.. . ' ! ·.) :t .i:.u J i •: : . . . . ., .· .. " .:.' ~ 0.. '.

6.

;

Re~

-

%1~~i~

_

~n. f:

.

~

;

~:.

~

~~o

:

.

.

.

,-

..

·

. . _

·.

.;;:'.

~

~

l ·, ... : .. I-Alle reagentia moeten van zodanige kwaliteit zijn, dat er geen

inter-f erenties Oftreden. Gebruik

g

.

e

:

ife

~

lo

1

nis~e.fd'

~

water

(6.

i

i)

:.

~

-

!

'

witt0

lr

a.van

{.·.. - ,.);.r_ .:.J.!J J ,:.:.'?. . -~9-:; -~· 'J { ·~ • .

ten ~inste.gelijke zuiverheid.

· · :..r .. .· 'L i!.-. .:. : :u,..,;~. , .t !:1 :> !-J•T: _{·L.-· ,,_(} ,JJ':.: ~-:.:·. ~.(1 ;t;r: nej~r:: ~:;rl 1v0'1 ;!~ '·"'i:n ... ';! ,, ._ '·•rs.

-

~

1

!.)

.

·

1:

Sh~Pdfl

_.

!.l:f[il

_

Pf..);plfl~~

:

r

:

~h

₁

~

,

~~r-~~~~~ico~:

.

u

(l_

ng(~l~

• . . . . 0 .

'

'(

.

6.3 Kaliumdiwaterstoffosfaat (Merck, nr. 4873). G221..2~ .. 3.~ ~ ·.l..

3 -6.4 Loopvloeistof: Los 8,2 gram KH 2

ro

4 nol (6.2). 6.5 Ethylacetaat (Merck nr. 9623). 6.6 Natriumchloride (Merck nr. 6404). ) ... 6.6.1 4% Natriumchlorideoploss:i.ngo 6.7 Hexaan (Merck nr. 4391). 6.8 Lithiumchloride (Merck nr. 5679). 6.8.1 3 M LiCl in H20 (6o2). ; .:re .i ~:1 ~:~ ~>'L:: _, ·-· · ! :. . . t) ·: ) • \I i : l !3 ; ~ . ;;

.

.

• I • : : ;~ 'I ..

!-6.9 1 m1 disposable injectiespuit ('rcrumo) of. 100 }.11 inJcl~i:h.s'puït.

6

·

~

··

;0

;,

Solvent

~

cl;ar-iflcat .. ion kit

(l-til{ipor~) me~

-

o

~/

~~

,:

f

i

~

-

~er'

G

VWP

• ', 1.1.1 (_; !( 1.: .. LICI.

047

oo.

6

.u

'

.Milli~Q, Reagent:::Gr~d~ Water Systems (M:U.1/ .: -~~·)·:··: .. :~ r:" :r~ ·.· ·

r ... , . - . . lJ(. . . . • ... "· .• ~t;.~·J· ;...-~: n

... "" : .. . .... : . . ' .·. :c:

N.B. Oplossing 6.l1 moet iedere dag ontg:tst ~;,)rd1 .. m roet behulp van de

•.1 ~

Solvent clarification kit (6.10).

:) ,

.,

' _' ' : , i" . ~: I ·- ~, .. L ( .. ,.J ·\',, . . ;:i;.' 7. Appa~atuur:.

s.

~~'~(. .. ~~· ..

.

·

-7.1 Vloeistof leveringssysteem 6000 A (Waters Asso~iates).

..L f , ' .. I . Î~ ' 1 , . ~ ' .:.. , 7.2 ~njektiekraan (Rheodyne n~e 7125). .l .· .;- .. .1'' • :-( -;'. . >.· :~ · .. · '! .. :J () / , ·. , \

.

(.

..

f.. .,_,_

.

, } \ l ;f1.1:r. ·.: . _. 1 •. ~· .. "•} -2~ •. ·: '( l_t1' ( ·;.J·"':t ,rcj:f.dh'"!:';·.:.> :.~·: .:. ·>'-;-'"~'i· ';'

7.3 Polarografische detectol.' 174 (EG en G, PARC) •

. · ·· '-P .• • • '~ ::;: • ··. ·--~• _;. ·• :.-:~ ,.": : ~~~~.''·::·)J:'.f.·,:~1J~ .~.r ;· .;; -+

" . .'),:,' • ' ~ ', :' •: ~ \·,:, ~:, ~•·:• ~·j:!'(· •·~;-:)•.:, ,"·:· ~(:;!"'•J·.',I•,; :i.>J : ::

:,j.

7.4 Elektrochemische doorstroomdetel·.tor 310 (EG en G, PARC).

:::..\ ~.. J .. ; l ) (i·' . ~ !' .:..' · . , . ~ . . . ... : ; , ; · •• \.·~~~-: ~ ;--)_) i..:.: • .. :· -~

'. ·•

,

.

7.5 Voorkolom:

r ·"' ., , • •

Lichrosorb RP 18, 10 ll, lengte 30

~

,

'/ 4

irin~

'

·

'

(nf

o

-

~

i

~

~/

(

,

.

•

.,

•' J -: •. •.·

-:.

7.6 Analytische kolom:

.

1Iy

'

I;erli

~

i

0

8tis

_:-

₅

_"

_\.t

,t'

:

î~ngte

_'

₂₅

.

~

Em;

u

i~

:

~.

_:-·

_4,

_i;

_·

_mm.

_·

;'. .!

·' . 7.7 Extrelutkolom (Merck 11738). 'I. .. ·1'' I I 7.8 Recorder. • · .. ,!.' :; . ·.n :i.:· ;~'· c:l- • • :·:~" 7.9 Centrifuge (10.000 rpm)

+

toebehoren • • ~. l:~8 \,),tli _; 7.10 Rotavapor (40°C). 7.11 _Laboratoriumglaswerk. . , ( 7.12 Zuurstofvrij stikstof.

,.

.

.

~ · ..

.

.. • . . ....~.,\ : \' ~ '~ . ·'-

.

.

8. Werkwi~ze ' . f' ,~ .... ,.1 ·!)!,, , "'(. l '. - ~ .·

,,

8.1 Breng 20 ml melk in een centrifugebuis en centrifugeer gedurende 25 m·~~~t~~~ trj l~ebb~ l·~C~r,en'.' ., . ,' -~, '. ~ -" ·,: .7! > ' '·I .:.,\(~ ·" '

8.2 Breng de water.fase₁ via een trechter·met een propje glaswol, over

.• I,. '.teql L. .. !'.' ~ '.· .. : . : .. '<t ' . 'I~.-- . • '·V I..' . . ,

op een extrelutkoleo111 (7.7) en spoel de centrifugehuis en trechter na met enkele ml water.

~

-8. 3 Elueer na 20 minuten met 15b' ml

-

~t'

ti~lacetaat

· (6

.

~

5)

-;,

~Jn d~p

deze

fase met behulp van de t'otavapor in tot ca. 5 ml. Breng met 5 ml

ethy-"'T

!acetaat over in een reageerbuis van 20 ml en damp vercfei·

!ti

:.

,

·

onder stikstof, tot droog.

_.

j 31 :)0 .3 2,1 :~ ; :..·, :1 ,ë, ~~ ~- \.

uv

,gt . ' io: ' . ',.~,

.

' .. . I~~

8.4 Los het residu op in 0,5 ml methanol (6.2) en 4 ml 4% NaCl

.. -.~~: Ç ."1;1 uî.' .. J'. . ·1 :·n .•

oplossing (6.6.1). Verwijder het vet door de waterige vloeistof .

.

. tweemaal te extraheren met 3 ml hexaan (6.7). Verwerp de hexaanfase.

,(J>lAq· 1;) " j D'i,' l.d 'l\ :J!'•;;,:. (:··:~·-~ ·<u· ·,lc ~- .

Voeg toe 4 ml ethylacetaat en extraheer, pipetteer de ethylacetaat-fase af in een andere reageerbuis en voeg nogmaals 4 ml ethylacetaat

• (~)}'\": ._~) ii.!'l ;);i) '{~ "1.-)i:>f() ::··.,Til.··'· :1.:: ~r,. ·!··. :.: -. 'Î"l.~ . . . . , .

toe. Verzamel de ethylacetaat en damp in, onder stikstof, tot droog. Los op in 400 ~1 loopvloeistof (6.4). Leid gedurende 10 minuten

~: ~ . ·. f) f

stikstof door en injekteer 100 ~1 •

.' ·)~.1. i.W . vff) Ir.v. ' \ '::!t ''!f :' ,~IJ. :

G221.4

' fl

-s 1 <!:i ; .. ~ '':•1 . •

- 5

9. Instelling apparatuur

J t- ---r' :i: ... :.:. . .. _. { t; :') ;:; . : . .< L ::. ~ . 1 . '=? , L. :, J: :> •· .; 9.1 Vloeistofchromatograaf • i'.i , -~-= ·

Loopvloeistof · ruëtha:noi/fösfà'àtLuffêr'"(litY/6try. :-;.~_;::,~--i: ·" · >·

Injektievolume 100 )..llo '·_. i ' -- .. J · ·· ,N L ·.:..; · ~ ·.J ·· J··: :! Vloeistofsnelheid: 1 ml/min. Reco~der Papiersnelheid 1

v.

1 cm/min.

N. B. Vervang alle teflon leidingen door mettiJ.'en 'Jl[:fiài'ngen.:-· ; ·.:<·

9.2 Elektrochemisch detektiesysteem (PAR

174)

.

Operating Mode Diff. Pulse.

Initia! Potential -500 mV vs Ag/AgCl/3 M LiCl in H 2

o.

Modulation Amplitude: 100.

Current range Lew pass filter

0.5 l-IA•

3 sec. Hanging Mercury Drop Elektrode. Drop Size Large.

10. Berekening

Vergelijk de gevonden piekhoogte met die van een standaard.

Formule: p1 x s x 01 x 1 ~ lJg/1 P2

o

2 20 waarin: P1

=

piekhoogte monster in mm. P2

=

piekhoogte standaard in mm. s

=

hoeveelheid standaard in ng.

01

=

aantal lJl waarin het residu is opgelosto

o

₂

=

aantal l-Il geinjekteerd.

11. Literstuur

- Application Note, Princeton Applied Research.

- Model 310, polai:ographic detektor, eperating and service manual, Princeton Applied Research.

G221.5 ₆

-J.J.

van der Lee, Determination of chloramphe~i~?l and its applica-tion to residues in milk and dairy cows, Proefschrift

Rijksuniversi-teit Leiden, 1981. .~

A. Gerull: Nachweis . '{cm\ 0)).~or:,~Jll~'è'a~~Ç.~2t~ -,~~R~~l?W~t teln

Herkunft. Dissertation T.U. Berlin, 1981.

tierischer _v

-~,.:o

..

, .. L ·' .i ... "!

.V

Verantwoordeli,j~t

:4.~

1

~

-

~

G.

,.

..

_,qe

·

~uig

(

.

~

.:.

. I· _{.L- .L} ' _{: :') . . .;\ • ~· J. [.:}

Samensteller G221.6 .. : H. Hooyerink

~

.(i.· .. ~ )J..I,:I.' .1 ë .: : ·• :I,' I~ , • .• ..,; ~I ' • ') .<.; .. ,.':.1" · I I _,r; . [. . (~l. • I • #"•• ~ ·-.· ... ~

.

c

:· F; '.;i:· . . .. ,, =~ i:::ï .. .::.J iG r · ... r ~ 'i!' ~ r ~~. . . . .... J ~~'('-. .:•. i. f'. .-.. I • .j . Yf ." ·' ~·~ . , " (.' . Ho/W ·

:

(.· •) f -I