Een organisch - chemische beschouwing van enige theorieen voor humusvorming

Rapport E E N O R G A N I S C H - C H E M 1 S C H E B E S C H O U W I N G V A E N I G E T H E O R l E E N O V E R H U M U S V O R M I N G door H. van Dijk •O O

o-C 5J4Ö

Een organisch-chemische beschouwing van enige theorieën over humusvorming

door

H. van Di .ik '

inleiding

Men kan zich moeilijk een meer ingewikkeld -reactievat i n ­ denken dan de grond? waar een mengsel van stoffen van o r ­

ganische en anorganische aard, van de meest uiteenlopende samen­ s t e l l i n g , sommige i n vaste, andere i n opgeloste en weer andere i n gasvormige toestand, met moleculaire afmetingen variërend

van die van eenvoudige verbindingen t o t die van hoogpolymeren, i n onderlinge'wisselwerking staan en onderhevig z i j n aan a l l e r ­ l e i chemische, biologische en microbiologische omzettingen, die gedeeltelijk naast elkaar verlopen, maar ook gedeeltelijk i n elkaar grijpen. Het zal dus duidelijk z i j n , dat men voor het verkrijgen van inzicht in de processen die zich i n de grond afspelen; meestal i s aangewezen op onderzoek aan de afzonder­ l i j k e bestanddelen of ook, a l s deze moeilijk u i t de grond z i j n t e isoleren,(wat b i j humusstoffen gedeeltelijk het geval

• i s ) op onderzoek aan modelstoffen. Uiteraard kan men op grond

van de resultaten van dergelijk detailonderzoek (en vergelijkend onderzoek) nog niet exact voorspellen, wat in werkelijkheid i n de grond a l s geheel zal gebeuren, aangezien er onderlinge beïn­ vloeding i s van verschillende processen, maar zo kan men toch de

problemen reeël benaderen.

Het humusonderzoek i s van organisch-chemisch standpunt bekeken, nog, of liever nog stêêdsTwant de eerste onderzoekingen dateren reeds van ruim 150 jaar terug) i n het a l l e r e e r s t e

stadium n l . van het proberen de organische stoffen u i t de grond t e isoleren en hun structuur op t e helderen. Dat het onderzoek nog niet verder i s} vindt z i j n verklaring i n de volgende ver­

schijnselen:

1) De isolering van de afzonderlijke componenten i s zeer moeilijk, aangezien er gedeeltelijk een binding aan de kleideeltjes be­

s t a a t , die moeilijk t e verbreken i s , zonder ook de organische s t o f zelf aan t e t a s t e n .

2) We hebben hier niet t e maken met enkele eenvoudige

ver-1 bindingen, maar met een mengsel van grotendeels macromoleculaire

stoffen van ingewikkelde opbouw.

3) Dit mengsel heeft geen constante samenstelling, maar de humus­ vorming i s afhankelijk van aard en samenstelling van de u i t ­

gangsstoffen, klimatologische omstandigheden, bezetting met micro-organismen, vochtigheidstoestand, aard van de minerale bestanddelen, pH enz.

-Vandaar dan ook, dat het n i e t 'mogelijk i s een goede

chemische d e f i n i t i e t e geven van wat humus i s . Het begrip humus i s een v r i j vage aanduiding, waaraan verschillende onderzoekers ook een verschillende inhoud geven, met a l s gevolg een aanzien­ l i j k e verwarring en veel misverstand in de l i t e r a t u u r . Sommigen «

(b.v.Waksman en Scheffer) verstaan ónder humus het totaal'van a l l e organische stoffen in de grond, andere meer dat deel, dat

na een zekere verrotting van de plantaardige en d i e r l i j k e resten " achter b l i j f t en tamelijk bestendig i s tegen verdere omzettingen. In het l a a t s t e geval i s het koolstofgehalte ongeveer 50 % en het stikstofgehalte ongeveer 5-6 %, de C/N-verhouding i s dan dus

ongeveer 0-10:1. Deze verhouding b l i j k t min of meer een constante t e z i j n . Op het voor en tegen van de verschillende definities z a l hier niet nader worden ingegaan. In verband met het doel van deze. s c r i p t i e zal alleen de volgende d e f i n i t i e van Schuffelen (69) worden vermeld: "Humus i s een i n de grond door condensatie en polymerisatie van de ontledingsproducten van d i e r l i j k e en plantaardige resten gevormde s t o f " .

Colloid-chemisch behoren cfe humusstoffen t o t hydrophiele collöiden met electrolytkarakter en wel b i j inbouw van weinig s t i k s t o f i n de macromoleculen t o t de zwakke zuren, terwijl' de

eigenschappen b i j hoger stikstofgehalte meer amphoteer z i j n . Het colloid-chemisch gedrag i s dus afhankelijk van de samenstel­ l i n g en de opbouw van het macromolecule,' maar ook van de pH en de kationenbezetting.

Het doel van deze s c r i p t i e i s enkele theorieën over de vorming van humusstoffen, i n de zin van t e r plaatse meer be­

stendige omzettingsproducten, ontstaan u i t plantaardige en t

d i e r l i j k e resten en microbiologische stofwisselingsproducten organisch-chemisch t e toetsen.

Om enkele i n de humuschemie gebruikelijke namen en begrip­ pen t e verstaan', moet echter vooraf nog even kort worden inge­ gaan op methoden voor fractionering en karakterisering van hu­ mus stoffen.

I . Methoden voor fractionering en karakterisering van humus-stoffen

Door Scheffer(63) wordt de volgende, reeds voornamelijk door 0den(5?J ontworpen fractioneringsmethode gegeven:

organische stof i n de grond

li 4"

donker gekleurde humusstoffen . nog niet ontlede plantaardige en

behandelen met loog d i e r l i j k e resten; kleurloos

ijiy"*'!"™ ' l i l 1 1 M . 1 . l i 1 '

oplosbare f r a c t i e in koude loog on- zelfs i n hete loog onoplosbare

overmaat zuur toe- oplosbare, in hete humuskool

voegen loog oplosbare

hü-minen

ook in zuur milieu in zuur milieu onoplosbare f r a c t i e

oplosbare f ulvozuren behandelenj met alcohol

>J/ ... n.,„..d 1 . ^

i n al'cohol oplosbare i n alcohol onoplosbare

3

-De huminezuren vormen slechts eèn r e l a t i e f klein deel van het t o t a a l van de organische s t o f , waar worden algemeen

beschouwd a l s de meest karakteristieke bestanddelen van dé humus. Het meeste onderzoek i s dan ook hieraan verricht.

•Van de f r a c t i e s fulvozuren en hymatomelaanzuren i s n i e t precies t e zeggen i n hoeverre deze mengsels van stoffen u i t echte humusstoffen bestaan. Zeker i s , dat d i t slechts voor een gering deel van'de fulvozuren geldt. Deze f r a c t i e bevat n l . öok a l l e eenvoudige, in a l k a l i , zuur en water oplosbare suikers, aminozuren, sommige Polysacchariden e . d . , die zeer goed aan-'

tastbaar zijn voor micro-organismen (zie o . a . Forsyth(31.32). De hymatomelaanzuren worden wel beschouwd a l s lagerpolymere huminezuren!Jodl(42),¥elte(ê5). waaruit door voortgezette con­ densatie of polymerisatie huminezuren kunnen ontstaan. Dit geldt volgens Forsvtht 30) ook voor sommige bestanddelen van de ffaLvo-zuurfractie b.v. de phenolische glucosiden, waaruit na hydro­ l y s e met verdund zoutzuur en polymerisatie van de phenolen i n alkalisch milieu (zie hoofdstuk IV) huminezuren kunnen ontstaan. Volgens Laatsch(45) i s de scheiding van hymatomelaanzuren en huminezuren het doelmatigst t e bewerkstelligen door uitschudden met een mengsel van amyl- of isobutylalcohol en. zoutzuur.

Vermoedelijk ontstaan huminen en tenslotte humuskool door ver­ l i e s van carbcxylgroepen en verdere condensatie u i t huminezuren. Deze f r a c t i e s zijn landbouwkundig vrijwel waardeloost o . a . geen uitwisselingscapaciteit meer).

Men dacht aanvankelijk met deze fractionering een che­ mische aantasting van het materiaal t e hebben vermeden. Naderhand bleek echter, dat e r onder invloed van a l k a l i en zuurstof van de lucht veranderingen plaatsgrijpen. Hierop wordt i n hoofdstuk I I I en IV nog nader ingegaan. Om deze aantasting t e vermijden, werd door Simon(72) e . a . t e r isolering van huminezuren extractie met oplossingen' van zouten vàn kalkn eer slaande zuren a l s Na F, Na-oxalaat e . d . voorgesteld, t e r w i j l Bream er c . s . ( 6 ) extractie met oplossingen van zouten, die complexen vormen met verschil­

lende metaalionen aanbevelen b i j v . Na^PpOy. De v r i j e huminezuren, de zouten hiervan met aardalkalimetalen (waarvan Ca' met meest i n de grond .voorkomt) en met metalen a l s Fe zijn n l . zeer slecht of i n het geheel n i e t i n water oplosbaar, t e r w i j l de alkalizouten i n het algemeen wel oplceb^ar z i j n .

Veel onderzoek naar de chemische en physische eigenschappen van de humusstoffen i s verricht aan chemisch aangetast materiaal, t e r ­ w i j l b i j de hieruit getrokken conclusies voor de werking van de organische stoffen in de grond n i e t het, op grond van deze aan­ t a s t i n g nodige, voorbehoud werd gemaakt. Om een indruk t e krijgen van de samenstelling van de organische stof i n de grond a l s geheel, i s een analysemethodiek voorgesteld door Waksman(#3). die h i e r , gewijzigd en aangevuld door Spring er ( 74,7 J J e . a . zal worden weer­ gegeven. Deze 'methode berust gedeeltelijk ot> een gefractioneerde hydrolyse van het materiaal. Hier i s du§ sprake van een onver­ anderd isoleren van de stoffen, waarvan, dan structuur en eigen­ schappen kunnen worden bestudeerd.

De methode i s a l s volgt:

1 ) het luchtdroge materiaal wordt i n een soxhlet geëxtraheerd met a e t h e r , waarbij voornamelijk harsen en vetten oplossen.

2) het residu van (1) wordt evenzo geëxtraheerd met alcohol, waar­ b i j naast wassen, looistoffen(taruaine), alkaloïden e#d. ook

s t i j f s e l , sommige pertinestoffen, aminozuren en proteïnen, "ligninezuren" en zelfs een gedeelte van de echte huminezuren oplossen. Dit i s dus een zeer inhomogeen mengsel. Om hierin het gehalte aan huminezuren t e "bepalen adviseert Springer t o t be­ handelingvan het t o t droog ingedampte filfcraatmet acetylbromide, waarover, straks meer. Verder kan natuurlijk een suiker- en s t i k ­ stofbepaling, eventueel na hydrolyse met zoutzuur i n d i t extract gedaan worden.

4 ) het residu van (3) wordt 5 uur lang op 100° verhit met 2%.-ig zoutzuur. Hierbij worden de meeste hemicellulosen(pentosanen, hexos§,nen, polyuroniden e . d . ) en verschillende eiwitten, voorzo­ ver nog niet door voorafgaande behandelingen verwijderd, gehydro-lyseerd. Uit een suikerbepaling i n het f i l t r a a t wordt dan het gehalte aan "hemicellulosen" berekend. Dit i s een minimumwaarde, daar sommige hemicellulosen moeilijk t e hydrolyseren „zijn, t e r ­ w i j l andere ontleden door koken met verdund zuur (zie hoofdstuk I I ) . Door Bremner ( 7 ) i s de samenstelling van dè verschillende eiwitten onderzocht door chromatografische adsorptie van het

hydrolysaat.

5) het residu van (4-) wordt enige t i j d met koud Ö0%-ig zwavelzuur behandeld, waarna verdund xvordt met water en aan de terugvloei-koeler wordt gekookt. De koolhydraten, die h i e r b i j gehydrolyseerd worden, b e t i t e l t Waksman a l s cellulose, maar h i e r b i j moeten

aanhalingstekens geplaatst worden, aangezien d i t geen zuivere katoencellulosé i s (zie over het begrip cellulose b i j v . Norman ( 5 4 ) . Ook d i t , u i t een suikerbepaling berekende "cellulose"-g e h a l t e , i s waarschijnlijk een minimumwaarde.

Verder worden door deze behandeling nog moeilijk hydrolyseerbare, eventueel aan andere bestanddelen gebonden Polypeptiden gehydro­ lyseerd (zie hoofdstuk I I l b ) .

6) Het residu van 5 bevat voornamelijk de lignine, de humine­ zuren, huminen en humuskool en eventuele tussenproducten van de omzetting' van lignine i n humusstoffen en verder minerale be­ standdelen. Met behulp van acetylbromide kan hierin nog het ge­ h a l t e aan huminestoffen afzonderlijk worden bepaald.

Om het gehalte aan uronzuren en polyuroniden(een groep

s t o f f e n , waaraan de l a a t s t e t i j d steeds meer aandacht wordt besteed en die apart i n hoofdstuk I I l a worden behandeld) •.afzonderlijk

t e bepalen, gaat men het oorspronkelijke materiaal met ongeveer . 12 % -ig zoutzuur verhitten, waarbij de uronzuren CO2 afsplitsen.

Uit een bepaling van deze hoeveelheid CO2 berekent men dan het uronzuurgehalte. Bij.deze bepaling wordt dus aangenomen, dat de CO- vrijwel uitsluitend afkomstig i s van uronzuren (carbönaten z i j n vooraf verwijderd)* Volgens Mattson (53 ) wordt u i t ge-autoxydeerde lignine door koken met 12 % i g zoutzuur een gróte hoeveelheid COg a f g e s p l i t s t . Een nauwkeurig systematisch fouten-, onderzoek i s voor deze bepaling dus noodzakelijk en ook reeds gedeeltelijk uitgevoerd (Fuller c.s.(33,35)). Door de afbraak van vers plantenmateriaal i n de grond met behulp van deze groepen-analyse t e vervolgen, bleek dat bestendigheid ten opzichte van de gebruikte chemische reagentia min of meer p a r a l l e l verloopt aan bestendigheid ten opzichte van microbiologische aantasting. Met behulp van deze'methodiek kan men dus een indruk krijgen van het humificatiestadium, waarin zich het materiaal bevindt.

Eenvoudig 5 Eenvoudig

-heidshalve wordt d i t ook wel bepaald, door slechts de behande­ l i n g met geconcentreerd zwavelzuur a l s in punt 5 genoemd, toe t e passen.

Hierbij moet echter opgemerkt worden, dat onveranderd l i g ­ nine ook niet oplost in geconcentreerd zwavelzuur, zodat het

residu na hydrolyse met zwavelzuur nog niet zonder meer gelijk gesteld »kan worden aan huminestoffen. Volgens Springer( 75 ) gaat onder aerobe omstandigheden de omzetting van lignine in humine­ stoffen -wel min of meer gelijk op met de vertering van het ge­ makkelijker aantastbare materiaal, maar kan onder anaorobe om­ standigheden ophoping van onveranderd of slechts gedeeltelijk omgezet lignine plaatsvinden. Daarom i s door verschillende onderzoekers, vooral door Springer, voorgesteld het materiaal met acetylbromide t e behandelen, waarin behalve koolhydraten en andere stoffen ook lignine en nog maar weinig omgezet l i g ­

nine oplost.+^angezien bleek, dat anorganische bestanddelen a l s

kleien en Ca -ionen sterk van invloed zijn op de oplosbaarheid i n acetylbromide, stelde Springer voor het materiaal vooraf

30 min. met 5 %-ig zoutzuur b i j ongeveer 50°C t e behandelen om het praéparaat a s v r i j t e maken. Door LaatschC 45) werd echter aangetoond, dat deze voorbehandeling lang niet a l t i j d voldoende i s , om minerale bestanddelen t e verwijderen. Verondersteld wordt, dat de werking van acetylbromide voornamelijk berust op een

acetylering, waardoor verschillende verbindingen oplosbaar worden. In plaats van acetylbromide wordt door Springer(77) ook wel een behandeling met een mengsel van i j s a z i j n , azijnzuuranhydride en geconcentreerd zwavelzuur voorgesteld. Dit acetyleringsmengsel werkt nog rigoureuzer dan acetylbromide en heeft het voordeel gemakkelijker t e maken en t e hanteren t e z i j n .

Het verloop van de humificatie wordt ook wel colorimetrisch nagegaan(Springerl 76), Scheffer(63).

Vervolgens moet nog even nader worden ingegaan op de functie van de stikstof i n humus. Reeds vroeg werden a l l e r l e i pogingen gedaan om stikstofhoudend materiaal (dat a l s veront­ reiniging werd beschouwd) t e scheiden van de "zuivere humus-zuren". Dit mislukte steeds en tegenwoordig i s men dan ook van mening, dat deze stikstof gedeeltelijk heterocyclisch i n het macromolecuul van de huminezuren i s ingebouwd. Hierop zal b i j de behandeling van verschillende theorieën wê"l nader worden inge­ gaan.

De meestal gevolgde methode voor het onderzoek naar de vorm, waarin stikstof i s gebonden, bestaat h i e r u i t , dat men N-to-t a a l bepaalN-to-t volgens Kjeldahl 'en de hoeveelheid a l s NH, vrij*-komende stikstof b i j verhitting met MgO. ('Volgens Flaigf 25 ) worden b i j de l a a t s t e bepaling niet a l t i j d juiste waarden ver­ kregen en i s verhitting met natronloog misschien meer aan t e bevelen^ Het verschil tussen de zo verkregen waarden voor N-t o N-t a a l en voor NH,-N beschouwN-t men dan a l s heN-terocyclisch ge­

bonden s t i k s t o f . •

-De bepaling van het gehalte aan aminozuren in een hydroly-s a a t wordt meehydroly-stal uitgevoerd volgenhydroly-s de methode van Slvke (be­ handeling met salpeterigzuur, waarbij u i t de hoeveelheid v r i j ­

komende hct/SSn aminozuren berekend wordt). Helaas heeft men

ook hier geen systematisch onderzoek ingesteld naar storende i n ­ vloeden van andere stoffen, zodat de waarde van deze bepalingen nog maar betrekkelijk i s . Dit wordt gedemonstreerd door het

onderzoek van Bremner('Ö ) , 'die aantoonde dat er ook b i j behande­ l i n g van lignine en andere phenolische verbindingen met salpeterig­

zuur ^-ontwikkeling optrad. Reeds b i j de hydrolyse kunnen er complicaties optreden naar bleek u i t een onderzoek van Laatsch

v r i jkwam, Vermoedelijk vrorden dan door vorming van HCl en HC10 de aminozuren aangetast tijdens de hydrolyse.

: Door verschillende onderzoekers wordt nog onderscheid

gemaakt tussen z.g. "Grau"- en "Braan, ,«h.uminezuren.

"Grau"-huminezuren- vertonen een hogere lichtabsorptie, grotere be­ stendigheid ten opzichte van loog, grotere electrolytgevoelig-heid, sterkere binding aan kleien en andere adsorbentia en hoger stikstofgehalté dan de "Braun"huminezuren. In de meeste

gronden zou een mengsel van beide typen voorkomen. Als karakteris-t i e k e eigenschappen van de huminezuren worden v/el de volgende

genoemd:

1) ze zijn onoplosbaar in acetylbromide ( d i t gaat overigens volgens Laatsch(45) n i e t geheel op).

2) i n droge toestand zijn het donkerbruine t o t zwarte metaal­ achtig glanzende stoffen.

. + + +++

3} De Ca - en Fe -zouten zijn onoplosbaar(ook d i t moet men niet a l t e absoluut zien. De calciumhumaten zijn soms beter oplosbaar dan de v r i j e zuren). .

4) Ze zijn i n a l k a l i oplosbaar en met overmaat zuur (pH <3.0,) • weer neer t e slaan.

5) Volgens Laatsch(45) hebben huminezuren een looistofkarakter (De bepaling geschiedt a l s volgt: De huminezuren worden opge­ l o s t i n een 1%-ige NaF-oplossing en op pH 5-6 gebracht waar-• na een 1 % - l g e verse gelatine-oplossing, waarin 10 % NaCl

aanwezig i s , wordt bijgedruppeld, tótdat een neerslag ont­ staat ) .

6) Bij oxydatie met chloordioxyde i n een waterige oplossing volgens Schmidt en Atterer(67) wordt o . a . maleïnezuur ge­ vormd.

7) De chlor eringsproduct en zijn volgens Laatsch( 45 ) „^.oplos­ baar i n aether.

ê) De extinctiecoëfficiënt en dergelijke colorimetrische groot­ heden.

9) Het absorptiespectrum i n ultra-violet l i c h t . .10) Het basenuitwisselingsvermogen.

11) Het Röntgenspectrum, het electronen-microscopisch beeld, het gedrag a l s redoxsysteem, de viscositeit, de loopsnelheid b i j electrophorese e . d .

Het i s wel zeker, dat men b i j vergelijking van ver­ schillende huminezuren niet kan'volstaan met het onderzoeken van één of enkele eigenschappen, maar dat een hele reeks eigenschappen moet worden onderzocht om gefundeerde u i t ­ spraken t e kunnen doen.

I I Theorieën over vorming van humus u i t koolhydraten en eiwitten Ongetwijfeld spelen koolhydraten en eiwitten een be­ langrijke r o l b i j de.humusvorming. In de l i t e r a t u u r wórden daar­ b i j twee mogelijkheden onderscheiden.

7

-1 ) Ze kunnen a l s zodanig, eventueel gebonden aan andere

stoffen, integrerende bestanddelen van humus vormen, i n die

zin dat ze i n het milieu waarin ze aanwezig z i j n , betrekke­ l i j k r e s i s t e n t z i j n ten opzichte v a n microbiologische aan­ t a s t i n g .

2) Uit splitsingsproducten zoals aminozuren en monosaccharide^

die zijn ontstaan door fermentatievö hydrolyse of u i t s t o f -wisselingsproducten (speciaal chinoide verbindingen) van micro-órganismen, die koolhydraten en eiwitten hebben benut a l s voedingsbron, ontstaan door chemische of enzymatische omzettingen humusstoffen.

l a Wat betreft.de koolhydraten a l s zodanig

Bij toepassing van de groepenanâlyse volgens Waksman op plantaardige resten i n verschillende stadia van ontleding, bleek dat de inhoud van de. plantencellen n l . eiwitten, suikers en andere i n water oplosbare celstoffen, snel wordt aangetast en dat daarna de celwandstoffen aan de beurt komen, die langzamer • ontleden. Hiertoe behoort het grootste deel van de koolhydraten. Daarbij kwam- echter een merkwaardig f e i t aan het l i c h t . Het

"cellulose"-gehalte bleek n l . in het algemeen regelmatig af t e nemen t o t vrijwel a l l e s verteerd was, maar het "hemicellulose"-gehalte bereikte na een aanvankelijk soms snellere afname titan de "cellulose! ,-fractie een soort evenwichtstoestand of nam

z e l f s r e l a t i e f toe. Bij nader onderzoek bleek het polyuronzuur-gehalte i n deze f r a c t i e t e gaan overheersen (zie o.a.Springer + Lehner(27Ö) ) . Zo werd door Forsvth(31) i n de oppervlaktelaag van de minerale gronden i n Noord-Oost Schotland gemiddeld 5-20 % "hemicellulose" (waarvan 5-15 % "u/onzuuranhydride") en slßchts 0-5 % "cellulose" gevonden. Ook Fuller(35) merkt op, dat de ver­ houding uronzuur C: t o t a a l C b i j planten veel lager i s dan b i j de organische stof i n de grond en dat er een werkelijke op­ hoping i s b i j voortgaande ontleding.

Het uronzuur G-gehalte van een groot aantal gronden bleek t e variëren van 1/10-1/3 van de t o t a l e hoeveelheid koolstof. Norman en Bartholemew l56) geven de verdeling van uronzuur-C i n twintig grondprofielen en komen t o t de conclusie, dat ongeveer 10-15 % van de organisch gebonden koolstof u i t de

oppervlakte-laag i n de vorm van uroniden aanwezig i s , t e r w i j l d i t gehalte nog s t i j g t met de diepte, vooral b i j gronden waar gemakkelijk uitspoeling optreedt.

Zoals b i j de bespreking van de bepalingsmethodiek voor uronzuur i n hoofdstuk I reeds i s opgemerkt, s t a a t de betrouwbaarheid van de opgegeven c i j f e r s nog n i e t vast, maar er zijn toch duide­ l i j k e (ook indirecte) aanwijzingen, dat een algemene tendens t o t ophoping van polyuroniden wel bestaat. Hoe moet d i t ver­ klaard worden?

Norman(: 55 ) merkt op, dat accumulatie van onveranderde hemicel-lulosen u i t de plant onwaarschijnlijk i s , "want deze zijn gemak­ k e l i j k microbiologisch aantastbaar. Dit hoeft echter niet a l t i j d het geval t e z i j n . Volgens Tennev en Waksman (Öl) zijn de hemicel.-lulosen u i t sphagnum zeer resistent ten opzichte van micro­

organismen. .

Door Anderson en Sands(1 ) wordt opgemerkt, dat extractie van plantenuroniden met a l k a l i soms moeilijkheden oplevert, doordat ze door lignine afgeschermd worden of hieraan gebonden z i j n . Hiermee i s echtpr nog niet gezegd, dat ze daardoor ook micro­ biologisch onaantastbaar z i j n . a l zal een eventuele binding

vân de carboxylgroepen, t e r w i j l een pyranoside binding tussen de eenheden ook veel moeilijker t e verbreken i s dan een furano-s i d e .

Op grond van de v r i j algemeen aanvaarde hypothese, dat micro­ biologische bestendigheid min of meer p a r a l l e l loopt met be­ stendigheid ten opzichte van chemische hydrolyse, zou deze

moeilijke aantastbaarheid dus misschien gedeeltelijk verklaard ' kunnen worden u i t de structurele opbouw van sommige polyuroniden. De i n de grond aanwezige koolhydraten zijn echter zeker niet

a l l e van plantaardige oorsprong. Een groot aantal micro-organismen i s i n s t a a t Polysacchariden t e synthetiseren, waarin dikwijls

uronzuurgroepen voorkomen (slijraontwikkelingj. Volgens Fuller (34) zijn de polyuroniden in de grond zelfs voornamelijk van microbiologische oorsprong. Deze uitspraak baseert h i j op de volgende waarnemingen:

1) Er vond een werkelijke synthese van uronideri plaats tijdens een l a t e r stadium van ontleding van gecomponeerde a l f a l f a . 2) Naarmate de ontleding van plantenuroniden verder gaat en

de gesynthetiseerde uroniden zich ophopen, nadert de decar-boxylatiesnelheid (weer bepaald door koken met 12 %-ig zout­ zuur) meer die van uroniden u i t grond.

3) geïsoleerde bacteri'êle polyuroniden decarboxyleren met een snelheid, die meer overeenkomt met die van grond, dan met die van planten.ODe meningen zijn nog verdeeld over de vraag of deze microbi'êle polyuroniden ontstaan door een beperkte oxy­ dât i eve afbraak van de plantaardige koolhydraten of dat ze volledig worden opgebouwd door de micro-organismen. Het ' l a a t s t e kan i n ieder geval voorkomen, want men heeft poly­ uroniden geïsoleerd u i t een voedingsbodem waarin slechts

f

lucose a l s C-bron aanwezig was, maar dat het eerste niet <5k kan optreden i s nog niet uitgesloten (zie .o.a. het over­ zicht van Q.v.Pk)tho(60j ) . Nader onderzoek naar de structurele opbouw van deze relatiefbestendige koolhydraten i s zeker ge­ wenst, mede in verband met het f e i t . dat volgens verschillen­ de onderzoekers(Geoghegan en Brian (36). Swabv (80) Polysaccha­ riden en -uroniden invloed uitoefenen op de

aggregatietoe-stand van de grond (er zijn structuurregelaars gemaakt op carboxymethylcellulose b a s i s ) .

1b Wat betreft de eiwitten a l s zodanig

Een ophoping van v r i j e eiwitten in' de grond, vindt voor­ zover bekend, n i e t plaats, maar eiwitten worden i . h . a . snel a f ­ gebroken, (voorzover niet aanwezig in levende organismen) t e n z i j

ze door binding aan andere bestanddelen microbiologisch min of meer onaantastbaar worden.

Ensminger en Gieseking(22) gingen de enzymatische hydrolyse van alDumine en haemoglobine na in zuur en alkalisch milieu i n aanwezigheid van verschillende kleien. Daarbij bleek, dat deze eiwitstoffen i n sterke mate geconserveerd werden door binding aan sommige kleien (afhankelijk vàn de uitwisselingscapaciteit. Montmorilloniet bleek zeer a c t i e f , t e r w i j l kaoliniet slechts

een gering effect uitoefende). Ensminger en Gieseking zien twee verklaringsmogelijkheden n l . adsorptie van het eiwitmolecuul i n zodanige o r i ë n t a t i e , dat de actieve groepen onbereikbaar zijn voor het enzym of een adsorptie van het enzym, maar ze geven aan

9

-de eerste verklaring -de voorkeur. Volgens Pinck en Alli.gqrp. i s er echter een derde verklaring n l . dat het eiwitmolecuul tussen de roostervlakken van het montmorilloniet schuift. Ook d i t wordt echter: yjfer door anderen ontkend. Het werkelijke mecha­ nisme i s dus'nog niet definitief opgehelderd.

Waksman en IverT#4 )maakt,p>n ligno-pröteïne complexen door a l ­ kalische oplossingen van lignine en eiwit (caseïne) t e mengen i n verhoudingen : van 3 : 1 t o t 6 : 1 , waarna de mengsels ôf met mineraal zuur b i j pH 4.Ö ôf met zouten a l s CaC^, FeCl, en A1G.1, b i j pH 7.0 werden neergeslagen. Na f i l t r e r e n , wassen en drogen werden complexen verkregen die wat betreft kleur, oplos­ baarheid in water en in a l k a l i , chemische reactiviteit, (basen uitwisselingsvermogen) en weerstand tegen microbiologische af­

braak overeenkwamen met de in loog oplosbare en met zuur t e pre­ c i p i t e r e n f r a c t i e van humus. Op g&pnd hiervan veronderstelde Waksman, dat het grootste deel "variiiumus i n grond, venen en com-posten bestaat u i t een dergelijk- of overeenkomstig

ligno-proteïnecomplex.

Wat betreft het reactiemechanisme tussen lignine en eiwit bë-spreekt Waksman(84) de volgende mogelijkheden:

a zoutvorming door reactie van carboxylgroepen u i t lignine met aminogroepen u i t het eiwit.

b r e a c t i e tussen phenolische' hydroxylgroepen u i t lignine en aminogroepen u i t het eiwit.

Het bezwaar van Waksman tegen deze twee"mogelijkheden i s , dat de complexen moeilijk' waren t e hydrolyseren, wat niet geldt

van deze bindingen. :

ç r e a c t i e tussen een carbonylgroep van lignine en een amino-groep van het eiwit, waarbij een schiffse base zou ontstaan,

door Waksman a l s volgt geformuleerd:

C52. H46 010(0CH^)(C00H)(0H)4 CO + HgN.R.COOH

= C52 H46 010(0CH3)(C00H)(0H)40:N.R.C00H + H20

Deze l a a t s t e verklaring acht Waksman de meest waarschijnlijke op grond van de' s t a b i l i t e i t en de basénuitwisselingscapaciteit van hét complex. Naar Mattson(zie hoofdstuk I I I ) aantoont, komen de mogelijkheden a en b wel degelijk i n aanmerking. Op een

vierde bindingsmogelijkheid wordt aan het eind van hoofdstuk IV nog gewezen.

Nieuwere onderzoekingen o . a . die aan actinomyceten-huminezuren, waarover straks meer, hebben aangetoond, dat WaksmaiB.ligno-pro­ t e ï n e theorie wel een zekere kern van waarheid bevat, maar i n

z i j n algemeenheid zeker niet opgaat. '

Uit het f e i t , dat b i j hydrolyse Van humus :(i. c. i n a l k a l i op­ losbare en met. zuur t e precipiteren f r a c t i e van de organische s t o f u i t de grond) slechts een kléin gedeelte van de hierin aan­ wezige stikstof wordt a f g e s p l i t s t , concluderen Sowden en Atkinson

(73), dat e r van een eenvoudige band tussen een groot lignine-molecuul en een groot eiwitlignine-molecuul geen sprake kan z i j n , maar dat de beidé moleculen dan wel zeer intiem met elkaar verbonden moeten z i j n .

Laatsch en S c h l i c h t i n g ( 4g) maakten verschillende koppelings­ pro anc'E"ën~irrr~g^Ia?ET^ en looistoffen ( o . a . een

-r a a t u i t -roggest-ro, dat zó voo-rzichtig mogelijk was .geëxt-rahee-rd om het karakter van de lignine niet aan t e tasten) in de ver­ houding 2:1. Hét bleek hun, dat d i t gelooide eiwit nog volledig was t e hydrolyseren met 6 n.zoutzuur. Vermoedelijk zullen de complexen ,dus ook biologisch niet resistent z i j n , maar hierover wordt door Laatsch en Schlichting n i e t s vermeld. Z i j merken wel op, dat deze complexen misschien wel moeilijker t e hydrolyseren z i j n , naarmate ze meer "verouderen". De veronderstelling, dat looien 'de verteerbaarheid van eiwit ongunstig beïnvloedt, l i g t

overigens_wel voor de hand (daarop berust tenslotte de leerbe

-r e i d i n g ' , alhoewel daa-r ande-re looistoffen wo-rden-geb-ruikt* Volgens Laat sc h( 45 ) i s de looiende werking van humme zuren b i j pH 5-6 het gevolg van een binding tussen phenolische QH-groepen u i t huminezuren en aminogroepen u i t gelatine. Reactie met car-boxylgroepen kon blijkens proeven met verschillende huminezuren pas eventueel optreden b i j een pH lager dan 4 d . i . beneden het

iscvielectrische punt van gelatine maar daar huminezuren b i j die pH o-p zich zelf reeds onoplosbaar zijn, kan reactie met carboxyl-groepen n i e t experimenteel worden aangetoond. Uit verschillende voedingsmedia, waarop enige maanden bepaalde schimmels en a c t i -nomyceten waren gegroeid, konden Laatsch en medewerkers (4-6,47) stoffen met huminezuurkarakter isoleren. Deze "huminezuren" bleken polypeptideketens t e bevatten. Uit het f e i t , dat deze polypeptideketens ook werden aangetoond i n "huminezuren", geïso­ leerd u i t een voedingsbodem, waarin glycerine en asparagine a l s enige C- resp. N-bron aanwezig waren, bleek dat deze' ketens, althans in d i t geval, van microbiële oorsprong waren. Deze ketens kunnen echter, zoals aan het eind van hoofdstuk IV zal worden uiteengezet, ook wel op andere wijze gebonden zijn dan v i a OH-, C00H- of CO-groepen van de huminezuren.

Dat de stikstof i n huminezuren niet voll'edig ontoegankelijk i s voor micro-organismen bewijst Küster(44). Hij kweekt© ver­

schillende schimmels op voedingsbodems, waarin slechts humine­ zuren a l s N-bron aanwezig waren. Voor een goede groei bleek wel een aparte C-bron, maar geen aparte N-bron nodig t e z i j n . Deze proeven werden zowel met natuurlijke huminezuren uitgevoerd a l s met synthetische, ontstaan door artjoxydatie van chinon i n am-moniakaal milieu (zie hierover hoofdstuk. IV). Het i s landbouw­ kundig van grote betekenis, dat we i n de huminezuren een langzaam werkende stikstofbron hebben.

2 Humusstoffen u i t fermentatieve hvdrolvseproducten van eiwitten en koolhydraten en u i t andere stofwisselingsproducten

a . Het i s een sinds lang.bekend verschijnsel, dat er door ver­ hitten van suikers en Polysacchariden, vooral fructose, i n e e n waterige oplossing, die enigszins i s aangezuurd, donkerbruine amorphe stoffen ontstaan. Deze stoffen noemt men dikwijls humine-s t o f r e n , waarmee een verband met de humuhumine-svorniing i n de grond gesuggereerd wordt.

Hierbij veronderstelt men intermediair, vorming van furfural u i t pentosen en hydrexymethylfurfural u i t hexosen, die dan verder condenseren t o t harsachtige producten. Door Wolfrom«Schuetz en Cavalieri( 86 ) werd de omzetting vàn d-glucos'e i n 5-hydroxymethyl-f u r 5-hydroxymethyl-f u r a l in zure en neutrale waterige oplossing spectroscopisch vervolgd op grond waarvan z i j hiervoor een reactieschema op­ s t e l d e n . In zuur milieu kan de reactie b i j hexosen verder gaan onder vorming van laevulinezuur en mierenzuur, maar over het verdere" reactiemechanisme b i j de vorming van de bruine producten i s nietsbekend. De vraag of deze stoffen echte "huminezuren" z i j n , overeenkomstig met die u i t grond, wordt door Scheffer en

11

-Weitet64) o . a . op grond van ultra-violetspectrametingen be­ vestigend beantwoord. Aan deze absorptiebepalingen i n u l t r a -v i o l e ï1w r d t echter een overdreven waarde gehecht. De

absorptie-curven voor "Grau"-, "Braun"- en "koolhydraat"-huminezuren heb­ ben i n het geheel geen karakteristieke extremen, alleen heeft de ehe een i e t s s t e i l e r verloop dan de andere. Het i s een zeer

hachelijke zaak om u i t dergelijke absorptiespectra verantwoorde' conclusies t e trekken voor de structuur van de monomere groepen. De vorming van "koolhydraathuminezuren" i n de natuur wordt door Welte(ä5) a l s volgt beredeneerd: onder perhumide omstandigheden ^reecft zuurstofgebrek op. De biologische a c t i v i t e i t wordt daar-' door geremd, waardoor cellulose veel langzamer wordt afgebroken. Hierbij ontstaan door hydrolyse reactieve tussenproducten, waar­ u i t i n zuur milieu huminezuren met furanoide structuur kunnen ontstaan door condensatie.

Welte s t e l t zich dus een condensatie;langs ehemische weg voor. Als men dan weet, dat voor de vorming van

"glucosehumine-zuren" i n zuur of neutraal milieu uren lang koken nodig i s (de omzetting van ketosen i n bruine producten verloopt s n e l l e r ) , en dat volgens Waksman(#2) anaerobe bacteriën, die cellulose ont­ leden in a l l e r l e i organische zuren, zeer t a l r i j k zijn i n

moerassige grond, dan l i j k t deze theorie toch wel zeer onwaar­ s c h i j n l i j k . Verder vermelden Scheffer en Welte nog ovèreenkomst met natuurlijke huminezuren wat betreft oplosbaarheid, maar ook d i t i s op zichzelf een onvoldoende criterium. Waar Eller(13) i n 1923 reeds aantoont, dat "koolhydraathuminezuren" verschillen van de natuurlijke wat betreft hun chlorerings- en nitrerings-producten, wekt het verbazingfdat Scheffer en Welte n i e t meer

moeite doen hun conclusies waar t e maken door ook andere eigen­ schappen t e onderzoeken.

b. Ook Hahn en Schalest39) veronderstellen, dat er in de natuur huminezuren gevormd'worden u i t koolhydraten, maar dan n i e t via' furfuralderivaten, maar door polymerisatie van methyl -glyoxaal. Dioxyacetonphospnorzuur(I) en glycerinealdehyde

phosphorzuur(II) zijn n l , aangetoond a l s primaire splitsings­ producten b i j suikerafbraak i n vivo en hieruit kan i n een secundair reactie methylglyoxaal onstaan.

i

CH

2

OH .

co .

CH

2

OPO

3

H

2

LI CHO .

CHOH .

CH

2

OPO

?

H

2

Woor het verdere reactieverloop geven Hahn en Schales de volgende hypothese: «

A

H, 0*1 î / CH-î

L Y

ci«/ H -> 0 3C, ko H «OH / \ CH _{3 —} Fi} 0 HC COH \c/ XC/ H OH H OH —^ huraïnezuron

Y

Dat èen dergelijke omzetting i n de natuur optreedt i s niet onmogelijk, a l heeft men het nog n i e t i n v i t r o kunnen aantonen b i j methylglyoxaal. Wel heeft men i n vitro volgens hetzelfde schema dimethylchinon verkregen u i t diacetyl onder invloed van a l k a l i (Karrer 3e druk pg 565). Hahn en Schalés verkregen

een-donkerbruine stof. door methylglyoxaal te verwarmen in een

2 11«

zure oplossing. De door hen vermelde eigenschappen van het ver­

kregen product komen niet? overeen met die van natuurlijke

humine-zuren en dû eigenschappen, waaruit volg'ens de onderzoekers de overeenkomst b l i j k t , vermelden z i j n i e t . Hier kan echter opge­ merkt worden, dat het door hen verkregen product niet via chinon a l s tussenstap kan' zijn ontstaan, aangezien chinon i n zuur milieu n i e t polymeriseert. Dat optimale vorming van deze producten op­ t r e e d t b i j pH 5.9;(zoals Hahn en Schales opgeven) wordt trouwens door Enders (14) ontkent. Volgens Enders i s vorming van bruine producten pas merkbaar na het neutraalpunt en maximaal b i j pH 11-1 2 . Bij nog hogere, pH ontstaat melkzuur(Cannizzaro). Deze theorie

van Hahn en Schales behoort dus niet t o t de onmogelijkheden, ge­ zien ook wat in hoofdstuk IV wordt vermeld.

c_. Een andere hypothese over dë vorming van huminezuren u i t koolhydraten i n de natuur i s die, waarbij men zich cycliserin

van hexosen voorstelt, waarbij i n o s i t o l ontstaat, een stof die_ zeer verspreid i n het plantenrijk voorkomt. Door waterafsplitsing u i t inositol zouden dan weer chinonderivaten kunnen ontstaan, die i n alkalisch milieu kunnen polymeriseren t o t huminezuren.

Ook deze cyclisering i s i n vitro nog niet gelukt, maar wel met een nitroderivaat.

Grossheintz en Fischer(3&) verkregen u i t 6-nitro-6-desoxy-d-glucose in waterige oplossing, onder invloed van zeer kleine hoeveelheden a l k a l i een mengsel van stereoisomeren, dat geen optische, a c t i v i t e i t meer vertoonde. Na acetyleringmet a z i j n -zuuranhydride werd'hieruit het penta-acetaàt van nitrodesoxy-i n o s nitrodesoxy-i t o l verkregen, dat b nitrodesoxy-i j oplossen nitrodesoxy-i n w a r m e pyridine, onmiddel­

l i j k en quantits1:jk|oi : aSe z e't : w e r <i in. diacetyl-5 nitroresorcinol.

Grossheintz en Fischer geven, mede op grond- van verdere experi­ mentele bijzonderheden het volgende reactieschema:. •

°f r HflH H ft

t-~c a c ) c ~0

Ö C H2N 02 / "/HNO, ,( CH-NO

'W

2

' V_/

2 2

6-nitro-6-desoxy-d-glucose 6-ni tro-6-desoxy-l—î dose

u

n

n

JOH ! __H0H . I

"V_/

ni trodesoxyinositol

i

HO 1 HOH / \ / \ CH.

V.

— Cs-Q 2 2 * ,, 5-nitroresorcinol

13

-Het f e i t , dat deze ringsluiting gemakkelijk en onder milde omstandigheden plaats vindt, doet vermoeden, dat door' een enzy­ matisch proces hetzelfde gebeurt in de natuur met de hexosen

z e l f .

Flaig(25 ) merkt op, dat men zich zo niet alleen vorming van phloroglucinol, maar ook van 1 , 2, 4-trihydroxybenzeenkan voor­ s t e l l e n , waaruit door oxydatie hydroxychinon kan ontstaan, wat a l s tussenproduct i s aangetoond b i j de synthese van huminezuren u i t hydrochinon (zie hoofdstuk IV).

d. B i j de stofwisselingsproducten van micro-organismen, d i e op eiwitten z i j n gegroeid, vindt men dikwijls bruine t o t

zwarte macromoleculaire kleurstoffen, de z.g. melaninen, waarin 7-13 % N.

Door Raper(62) werd het reactieverloop b i j inwerking van het enzym tyrosinase op tyrosine opgehelderd:

! ij §H-£00H

J

i

2

tyrosine tyrosinase • 02 van dé lucht -CH2 l

R

1 ,| CH-COOH NH„ -JS ' 2 dioxyphenylalamine 0 _ / CH2 I I fcH_£00H K

X

/

CH

2 H-eOOH 0 CH 2 —COOH

VN

CH ^J-COOH H 5.6-dioxindool-2-carbonzuur 0 = 0=: -CH "melanine" H indool-5-6-ch i non Om destructuur van.het.mql

reactie van eenvou n.het.melaninepolymeer op te.helderen bestudeerden Su'Lock en Harley-Mason (10)de dl ge ïnoolen met cmnonen, 'die volgens nun als vo 1 g%- vemep«- g

il + 2 iLCH3 in al cohol H 2-methylindool sterke kata

lyse van zuur

^,A^

C

"

3

\

Zonder de methyl groep was de opbrengst gering en ontstonden er bijproducten. 2-methylindool gaf géén reactie met 2,5- of 2,6-dimethylchinon

orthochinonen bleken nog reactiever te zijn dan parachinonen. Hierbij ontstonden producten als:

y\,

L

Y/V V/"

-Met 4.5-dimethylorthochinon trad geen reactie'op.

B i j de polymerisatie van indoolchinon zal dus, volgens deze onderzoekers, waarschijnlijk de 3-positie van het ene mole­ cuul en de 7-positie van het andere molecuul, betrokken zijjl. Reactie op positie 4 is., theoretisch ook mogelijk,maar dan zou het ontstane product geen coplanaire structuur kunnen hebben,

zoals melanine wel heeft. Als mogelijke formule voor het melanine-polymeer werd daarom door Bu'Lock en Harley-ifeson voorgesteld:

Zo i s bovendien een goede conjugatie van dubbele bindingen verkregen, wat de intense lichtabsorptie over een groot golflengtegebied verklaart. Om de extreme onoplosbaarheid van melaninen t e verklaren, veronderstel­ len z i j enkele "cross-linkings" tussen een v r i j e 2-plaats en een 4- of 7-plaats van een ander molecuul.

Horner(40) ging de reactie tussen O.tetrachloorchinon en N-aethylindool na, waarvan h i j het volgende schema

geeft(dieën-synthese) : CV Cl •7. 0

L

Cl _{p Hf} / v 1*2 o Cl Cl Cl C20 isc /V/' C^ •;

Op grond hiervan veronderstelt Flaig(25) voor de melanine-vor ming u i t tyrosine het volgende rëactieschema:

Hieruit i s niet zo goed de diepe kleur verklaarbaar, maar' deze formule geeft ook zonder cross-linkings wel een verklaring voor de extreme onoplosbaarheid van melaninen. Uit het t o t dusver verrichte onderzoek i s nog geen definitieve conclusie omtrent de structuur vàn melaninen t e trekken.

15

-De melaninevorming i s niet t o t tyrosine beperkt. Ook b i j andere aminozuren a l s tryptophaan heeft men dergelijke producten verkregen.

Laatscm 45) toonde aan, dat huminezuren niet identiek zijn met zuivere melaninen. De oplosbaarheid van beide verbindingen bleek n i e t g e l i j k t e z i j n , t e r w i j l de melaninen bovendien ontkleurd werdén b i j behandeling met een 3$-ige wat er st'ofperoxyde oplos­ sing, wat b i j huminezuren n i e t ' h e t geval i s .

Het l i j k t ook weinig plausibel, dat er i n de grond een zuivere melanine-vorming zal optreden, aangezien er b i j de afbraak vân koolhydraten ook a l l e r l e i reactieve tussenproducten ontstaan, die op een of andere manier met de •. eiwitstofwisselingsproducten "kunnen reageren, zodat vorming van een soort mengpolymeer dan

waarschijnlijker l i j k t . Ook lignine heeft na ontmethylering en oxydatie reactieve chinoide structuur-elementen, waardoor het' op de een of andere manier in de reactie kan worden betrokken,

• e . vonElotho( 59 ) onderzocht u i t bosgrond geïsoleerde schim­ mels, a.ctinomyceten en bacteriën op hun vermogen stoffen "te

vormen met de karakteristieke kentekenen van huminezuren, door ze t e kweken op verschillende voedingsbodems. Door Laatsch(45)

werd reeds aangetoond, dat de aara van de koolstofbron m het voedingpmediu© van invloed.is op de oplosbaarheid van de. u i t d i t meaium geïsoleerde actinomyeetenhuminezuren m acetyl-bromide.

Uit het onderzoek van vonPlotho bleek bovendien de aard van de stikstofbron zeer belangrijk t e z i j n . Actinomvceten gaven de hoogste opbrengst aan "huminezuren" b i j gebruik van aminozuren a l s N-bron, t e r w i j l aspergilli en fusaria hieruit geen humine­

zuren vormden. Aspergilli gaven het beste resultaat met n i ­ t r a t e n en p e n i c i l l i a met ammoniumzouten a l s N-bron. Als b i j de actinomycetencultures het aminozuur dienst moest doen a l s C-en a l s N-bron (dus geC-en aparte C-bron toegevoegd)', dan hield de groei na enige dagen op. In het substraat waren dan hydroay-benzearderivaten aan t e tonen (roodkleuring met FeCl, i n alkalisch milieu,overgaand i n groen b i j aanzuren; met gediazoteerd s u l -fanilzuur werden bruinrode azokleurstoffen gevormd). B i j t o e ­ voeging van een aparte C-bron a l s glycerine waren na enige dagen groei geen phenolen meer aan t e tonen.

Werd a l s N-bron glutaminezuur of trypisphaan gebruikt, dan was de r e a c t i e op indoölverbindingen ook positief(roodkleuring van de amylalcoholläag b i j toevoeging van de zure amylalcoholische oplossing van p.dimethylamino-benzaldehyde aan het substraat). Voor een goede groei en optimale huminezuurvorming bleek een C/N-verhouding van ongeveer 30 : 1 i n het oorspronkelijke voe­ dingsmedium het beste t e r w i j l de aanwezigheid van luchtzuurstof noodzakelijk was. In een vervolg op d i t onderzoek vermeldt von tëLotho(60) de i s o l a t i e van verschillende chinonderivaten u i t de substraten en tevens u i t grond. Deze chinonen polymeriseerden i n alkalisch milieu onder invloed van zuurstof u i t de lucht t o t stoffen met het karakter van huminezuren. Mede op grond van absorptiespectra i n het u l t r a v i o l e t t e gebied(! ! ) komen Scheffer« Von Kotho en Welte(65) t o t de volgende uitspraak: "Die Bildung natürlicher HuminsSuren vom Grauhuminsäuretyp i s t eine im Boden selbständig ablaufende mikrobiell bedingte Synthese, Sie nimmt i h r e n Ausgang Von chinoiden Stoffwechselprodukten der mikro­ organismenweit, aus denen bei schwach alkalischer Reaktion durch Autoxydation mit nachfolgenden Kondensations -bzw. Polymeri­

sationsprozessen das Makromolekül der GrauhùminsSure aufgebaut wird"è Ook Laatseh c.s.(47) veronderstellen, mede op grond.van

onderzoekingen van Schlichting(66) aan heidehumus, dat i n de grond naast elkaar voorkomen N-arme "ligninehuminezuren" en N-rijkq, u i t het.mycelium van schimmels en actinomyceten ont­ s t a n e huminezur en. Hiermee in tegenspraak i s de conclusie van Springer en Wagner (79), gebaseerd op colorimetrisch onderzoek,

oplosbaarheid in acetylbromide, gedrag b i j hydrolyse met sterk zuur en b i j oxydatie i n alkalisch milieu van verschillende 'hu­ minezur en (merkwaardig genoeg zijn i n d i t onderzoek geen natuur­ l i j k e "Grau"-huminezuren betrokken). Volgens hen worden schimmel-huminezuren n l . betrekkelijk snel afgebroken i n de grond en ont­ staan "echte" huminezuren alleen u i t lignine, waarmee in wisse­ lende hoeveelheden aminozuren of eiwitresten en eventueel

.chinoide stoffen gekoppeld z i j n .

Het hangt er ma;ar van a f , wat men "echte" huminezuren noemt.

Zoals reeds opgemerkt, toonde Küster(4 4 ) aan, dat ook de stikstof i n z . g . "ligninehuminezuren" niet ontoegankelijk i s voor schim­ mels. Bovendien isoleert Springer zijn "echte" ligninehumine­ zuren o . a . u i t sphagnumveen, t e r w i j l sphagnum volgens een r e ­ cente uitspraak van Freudenberg in tegenstelling.tot de algemeen gangbare mening geen lignine bevat.

Ook doör Flaig en medewerkers( 26a), waarvan vooral Kilster( 4J>) ge­ noemd moet worden, werd de vorming van huminezuren door micro-organismen- bestudeerd en. werden chinoide tüssenproducteh aange­ toond, die in alkalisch milieu onder opname van zuurstof u i t de lucht polymeri'geren t o t huminezuurachtige verbindingen, . eventu­ e e l onder f i x a t i e van aminoverbind.ingen of NH,.

De structuur van vele van deze pheno3.ische of chinoide s t o f ­ wisselingsproducten' i s ,opgehelderd(zie Raistrick c . s . ( 6 l ) en Flaig en Otto (27)). Hiertoe behoren ook verschillende a n t i ­ b i o t i c a .

In verband met de door verschillende onderzoekers beweerde

groeistöfwerking van humus, hebben Flaig en Otto een onderzoek ingesteld naar de groeistof werking van verschillende chinonen, waaruit huminezuren kunnen zijn gevormd. Z i j komen.tot de con­ c l u s i e , dat chinoide systemen inderdaad de wortelgroei „beïn­ vloeden, en dat humus het dus ook wel zal doen.

f . Tenslotte moet hier nog de theorie van Enders(14-21)

besproken worden. Volgens Enders on1:staan de huminezuren,

door een niet-enzymatische reactie van methylglyoxaal met aminozuren, En-<iers noemt-dit melanoïdinen.

Voraing van methylglyoxaal:(zie d i t hoofdstuk onder 2b) zou optreden a l s de organismen in ongunstige levensomstandigheden komen t e verkeren met a l s gevolg autolyse of -plasmolyse van de organismenlichamen. Deze ongunstige levensomstandigheden ont­ staan döor periodieke schommelingen in de temperatuur, het vocht-gehalte, de pH, de samenstelling van de voedingsoplossing (groei­ stofgebrek), de redoxpotentiaal, door osmotische effecten,

heterolyse e . d . Hierdoor zou dus de humusvorming begunstigd worden. Als resultaten van onderzoek aan de grond deelt Enders a l l e e n maar c i j f e r s over het gehalte aan methylglyoxaal mee. Enders en Sigurdsson(15) bepaalden het gehalte aan methyl­ glyoxaal in.bosgrond, door die t e gaan stoomdestilleren en het d e s t i l l a a t met 2.4-dinitrophenylhydrazine..te behandelen. ..Hierbij werd u i t I5OO g grond een hoeve'elheid osazon verkregen overeen­ komend mét 10 mg methylglyoxaal. Z i j schatten echter het

werkelijke gehalte op ongeveer 20 mg per 1500 g grond. Verder merkten z i j op, dat de in de grond aanwezige hoeveelheid methyl­

micro 17 micro

-organismen.

(17) Enders entte een voedingsoplossing, waarin cellulose a l s koolstofbron aanwezig was met micro-organismen die deze cellu­ l o s e konden afbreken en huminezuren konden vormen. Bij het aan -brengen van ongunstige levensomstandigheden kon Enders methyl-glyoxaal aantonen, t e r w i j l huminezuurvorming t e verhinderen was door calciumsulfiet, semicarbar;ide, dimedonTl.l-

dimethyl-cyclohexadion -3.5) of 2.4-dinitrophenylhydrazineiwaardoor methylglyojsâal wórdt vastgelegd) toe t e voegen. Als Enders heeft aangetoond, dat deze stoffen alleen methylglyoxaal vast-legden(wat niet uitdrukkelijk wordt meegedeeld), i s d i t een interessante bevestiging van zijn theorie, dat methylglyo^al a l s tussenproduct kan' optreden b i j de omzetting van koolhy­ draten i n huminezuren. Er'moet anders ook rekening worden ge­ houden met'de mogelijkheid, dat de celluloseafbraak b i j een ander staditun (bv.hexosen) wordt stilgelegd. De proeven van Enders om i n v i t r o huminezuren t e synthetiseren u i t methylglyoxaal en aminozuren hebben geen bevestiging opgeleverd van zijn theorie. Enders bereidde zijn "melanoîdinen" o . a . door methylglyoxaal' t e verhitten met verschillende aminozuren i n waterige oplossing. Reactie bleek op t e treden i n het "physiologische pH-gebied" van pH 4-7 (tussentijdse vorming van chinon l i j k t dus onwaar­ s c h i j n l i j k ; zie 2b). De reactiesnelheid nam toe met stijgende pH en was verder afhankelijk van concentratie en temperatuur. De structuur van het aminozuur bleek n i e t van invloed t e zijn op de reactiesnelheid, mits de ami'nogroep maar niet gesubstitueerd was. B i j proeven met methylglyoxaal en glycocoll bleek de groot­ s t e reactiesnelheid en de hoogste opbrengst t e worden verkregen' b i j een oplossing, waarin 10 % methylglyoxaal en 20 fo gsLycocoll. Enders geeft geen enkele reactievergelijking, maar hierover

wordt opheldering gegeven door SchSnberg.Moubashêr en Mostafa (6Ö).'Zij delen mee, dat de meeste verbindingen waarin de groepe­ r i n g . CO . (CH : CH)n . CO . (waarin n = 0 , l , 2 . . . ) voorkomt in

s t a a t z i j n alpha-aminozuren af t e breken t o t aldehyden met 1 C-atoom minder.

Dit wordt door hen de "Strecker-reactie" genoemd.

De groep kan h i e r b i j

1 ) worden geëlimineerd i n de vorm van NH, bïjv.

H

T

R- C - COOH

'

I

NH

2 perlnaphtindaantrion

R - 'c - o •

NH

3

• co

2

•

dlhydroxy-perinaphtindenon i-j.

2) gebonden worden aan de carbonylverbinding, die de afbraak bewerkstelligt, waarbij een aminoverbinding van

overeen-, komstige structuur ontstaat (transaminering).

-?H3 \ H V c -/ É C-sO V

r

COOH

pyrodruivenzuur phenyl glycine 2

/

2

;OOH

al anine < h ° ^ C°2 bertzaldehyde

3) reageren met de carboffyIverbinding,' waarbij N-verbindingen van ingewikkelde structuur ontstaan. '

bijv. \ cat-ami nozuur C - 0 • — ^ 0 . C=0NH, ^ V4 / • Y- N - C o = G. ninhydrine

De r e a c t i e s werden door Schö'nberg c .s.uitgevoerd, door het

aminozuur 15 min. t e laten reageren met de in kokend water opge'-l o s t e of gesuspendeerde carborïyopge'-lverbinding in een CO^-atmosfeer Als algemeen reactieschema geven z i j het volgende:

--Ç - 0 + H„

"C

R

H

COOH

H

2

0

- JC — N

-C •= 0

CCOH

-C0

2 -C -c R

-"CH

2 -> li"

R

CH

OH

,C ~'NHO

II

C—OH

i~

BIJ

de carbofTylverbindingen, die deze afbraak kunnen bewerk­

s t e l l i g e n worden o . a . methylglyoxaal en ortho- en parachinon vermeld.

Wat e r u i t het methylglyoxaal zelf ontstaat en waarom een COg" ' atmosfeer vereist i s , wordt door Schönberg c . s . niet aangegeven Gezien de resultaten van Enders zal onder invloed van zuurstof van de lucht het eindproduct of een tussenproduct van deze om­

z e t t i n g polymeriseren. De eerste stap zal echter ook hier wel z i j n de vorming van een schiff se base' i . e . een df-iminozuur die, zoals bekend, gemakkelijk CC>2 afstaan. Een duidelijke aanwij­ zing hiervoor i s , dat volgens Enders geen reactie met N-gesub-stitueerde aminozuren optreedt.

Het heeft weinig zin, zich zonder nader experimenteel onderzoek t e verdiepen i n het'mechanisme van deze'polymerisatiereactie. Het l i j k t wel zeker, dat eventueel gevormde ringsystemen

19

-heterocyclisch zullen z i j n .

In d i t verband kan nog de reactie van Windaus(Karrer 3°- dr.pg

7 7 4 ) vermeld worden. Windaus verkreeg n l . door verhitting van

glucose i n een aminoniakale zinkhydroxydeoplossing 4-methyl-imi^dazol. Hierbij denkt men zich tussentijds formaldehyde en methylglyoxaal gevormd die a l s volgt met NH^ reageren:

NH

3

0 = C -

CH

3

H —

C - CH

3

H,C-0

0= CH

HT

CH

\H /

3 !

4-methyl-i midazol

De aanwezigheid van çhinoîde structuurelementen, zoals i n humi-nezuren ( zie-hoofdstuk IV) l i j k t niet waarschijnlijk b i j deze

melanoïdinen. . ,

Laatsch(45) toonde trouwens reeds aan, dat de melanoïdinen van Enders n i e t voldoen aan de b i j de karakterisering van

humine-zuren vermelde eigenschappen 3 , 5} 6 en 7(zie hoofdstuk I ) .

Er kan in dit verband dan ook weinig waarde worden gehecht aan de door Schuffelen en bolt(70) vermelde overeenkomst tussen"deze melanoïdinen en huminezuren, wat betreft hun C/N-verhouding, uitwissëLingscapaciteit en titratiecurven.

Enders bereidde ookf ïmelanoi'dinenf' door van glucose zelf

u i t t e gaan. Op grond van het feit., dat de reactiesnelheid in d i t geval veel kleiner i s dan b i j methylglyoxaal en dat er b i j verhitten van glucose i n alkalisch, zuur of neutraal milieu ge­ ringe hoeveelheden methylglyoxaal worden gevormd, veronderstelt Enders b i j deze "melanoidinevorming" u i t suikers ook methyl­ glyoxaal a l s tussenproduct.

Dit i s echter volgens een onderzoek van Wolfrom.Schuetz en Cavalieri(B6) onjuist. Door deze onderzoekers werd n l . aange­

toond, dat b i j de vorming van bruine producten b i j verhitting van pentosen,' resp. hexosen en glycine i n waterige oplossing

f u r f u r a l resp. hydroxymethyl-furfural a l s tussenproduct optreden. Inderdaad bleken er ook bepaalde verschillen t e bestaan tussen m3lanoidinen u i t methylglyoxaal bereid en die u i t hexosen, I I I De betekenis van lignine voor de humusvorming

"Lignine" i s evenals "huminezuren" meer een collectieve term voor ae groep macromoleculaire, amorphe verbindingen, die

chemisch zeer nauw verwant z i j n . Ook b i j lignine levert de

isolering u i t het oorspronkelijke plantenmateriaal, waar het in combinatie met cellulose, hemicelluiosen, chemisch enigszins verwante taminen, phlobaphenen e t c . voorkomt, bijna onover­ komelijke moeilijkheden op. Totaal inerte oplosmiddelen lossen l i g n i n e n i e t op. Vrijwel iedere extractie i s t e beschouwen a l s een reactie van lignine, waarbij oplosbare producten ontstaan. De eigenschappen van het geïsoleerde product zijn dus x>ok a f ­ hankelijk van de methode van isolering. Er i s in natuurlijke toestand reeds een grote verscheidenheid i n soorten lignine, èvenals dat het geval i s b i j Polysacchariden, t e r w i j l door het grote aantal verschillende isolatiemethoden, die ieder hun eigen

-stempel drukken op het geïsoleerde product? de s i t u a t i e hele­

maal ingewikkeld wordt. Het valt'dan ook niet ,te verwonderen, dat Brauns(5) verzucht: "The lignin l i t e r a t u r e i s f u l l of „ contradictions, not only in the work of different chemists,

but often i n the work of the same investigator.".

... Ir5r Hier zal geen opsomming worden gegeven van de vele struc­

tuurformules, die in de loop der t i j d zijn opgesteld voor l i g ­ n i n e , aangezien ze a l l e hypothetisch zijn en de juistheid van

nog geen enkele onomstotelijk bewezen i s . Mede doordat er b i j een goede verwerking van lignine, dat i n enorme hoeveelheden a l s afvalstof b i j de chemische hout- en stroverwerking t e r besshikking komt, grote industriële belangen gemoeid zijn, • wordt aan de opheldering van de structuur intensief gewerkt. Waar lignine een van de belangrijkste uitgangsstoffen i s voor de humusvorming,(de overblijfselen van de oogst i n de grond bestaan voor ongeveer 20 % u i t lignine) i s het humusonderzoek ook zeer gebaat b i j de opheldering van de structuur van lignine. Een moeilijkheid i s echter, dat het lignineonderzoek voorname­ l i j k plaats vindt aan houtlignine en niet aan materiaal waar­ u i t i n de cultuurgronden humus gevormd wordt. Volgens Mattson

(51) i s lignine u i t hout of stro-veel minder reactief ten opzichte van autoxydatie in alkalisch milieu dan lignine u i t assimilatieorganen a l s boombladeren. De lignine u i t 'bladeren zou een' hoger basenbindend vermogen hebben dan die u i t hout of s t r o . De lignine u i t bladeren gedraagt zich volgens Mattson meer a l s phenolische zuren, t e r w i j l die u i t hout of s t r o meer overeenkomt met de lager geoxydeerde phenolen. Op grond h i e r ­ van onderscheidt Mattson "structureel" lignine (verleent s t e ­ vigheid aan het materiaal) en "functioneel" ligriineCdat een r o l zou spelen b i j de regeling van de base-zuurtoestand en b i j de osmotische -en dergelijke verschijnselen.) Al i s het dan nog niet mogelijk een structuurformule voor "lignine"'op t e s t e l l e n , men kent toch al'verschillende kwalificaties, waaraan deze formule moet voldoen. Brauns(5) geeft er de volgende op­ somming van: Zuivere lignine bestaat alleen u i t de elementen C,H en 0 . Uit het f e i t , dat b i j hydrogenering van lignine t o t

50 cyclohexylpropaanderivaten worden verkregen, b l i j k t dat

lignine vóór een groot deel i s opgebouwd u i t phenylpropaan-derivaten, aangezien vaststaat dat de cyclohexylring ontstaat door hydrogenering van de benzggring. Dit b l i j k t u i t het, waterstofverbruik b i j de hydrogenering; u i t de elemontairana­ l y s e , die op sterk onverzadigd karakter wijst n l . een hoog C-gehalte(tussen 62 en 60 % afhankelijk van herkomst en methode van isolering), een r e l a t i e f laag H-gehalte (ongeveer 5-6%), gecombineerd met het f e i t , dat de meeste zuurstofatomen in l i g n i n e a l s OH en OCH, groepen voorkomen (15-23 % OCH,) en in

de derde plaats u i t het f e i t , dat b i j milde alkalische oxydatie t o t 25 % vanilline werd verkregen.

OH

OCH

3

V'

_{H-C =0}

21

-Ook werd dikwijls.(in geringere hoeveelheden) syringalde-hyde verkregen u i t lignine.

De vorming: van vanilline u i t lignine bewijst verder, dat t e n ­ minste in een deel van de lignine, de phenylring een OCH,-groep meta en een OH of OC^H^ OCH,-groep para ten opzichte van de

zijketen bevat. Er kan vrijwel geen t w i j f e l meer aan bestaan, dat lignine een hoögpolymeer i s , gevormd voor tenminste 75

indien n i e t geheel, u i t phenylpropaan.bouwstenen. Hoe deze bouw­ stenen met elkaar zijn verbonden en of z i j volgens één patroon

dan wel op verschillende manieren zijn verbonden i s nog niet d e f i n i t i e f vastgesteld.- Het l i j k t niet onwaarschijnlijk, dat het a a n t a l verschillende bouwstenen helemaal n i e t zo groot i s , maar dat de soort lignine voornamelijk bepaald wordt door de rang­ schikking en de koppeling van deze bouwstenen.

Na 20 jaar studie van physische en chemische eigenschappen van l i g n i n e en op grond van vergelijkend onderzoek aan modelstoffen,

beschouwt. Freuaenberg nu het grootste deel van sparrenlignine, a l s een hoogpolymeer pioduct van bifunctioneel gecombineerde bouwstenen van guajacylpropaanderivaten met een zijketen waarin gemiddeld 3 zuurstofaequivalenten. De bouwstenen kunnen met elkaar reageren door afsplitsen van water, waarbij een aether gevormd wordt, gevolgd door p a r t i e l e nucleaire condensatie onder vorming van benzopyraan- en benzofuraannngen a l s volgt:

Dit i s slechts een schema. Het aantal typen en de volgorde van de bouwstenen en de aard van de condensatie i s willekeurig ge­ kozen, alleen zijn de verschillende mogelijkheden aangegeven, d i e volgens Freudenberg waarschijnlijk voorkomen. De isolering van isonemlpinezuur b i j milde behandeling met a l k a l i , gevolgd door oxydatie, wijst er op dat, tenminste i n een deel van het ligninemolecuul het C-atoom 5 van de benzeenring verbonden i s met de zijketen van een andere bouwsteen door een C-C*-binding.

Aan de andere kant i s i n een ander dool van hot 'ligninemolecuul de 5-plaats v r i j , aangezien er 5-jood-vanilline u i t gejodeerd lignine tea worden geïsoleerd. De 5-plaats i s ongetwijfeld v r i j i n een eindgroep

en misschien i s h i j ook v r i j i n een centrale bouwsteen, die met de volgende slechts door een phenol-aetherbinding i s verbonden. Verder i s i n lignine>ongeveer 2 % phenolische OH aanwezig.

Bij reactie van lignine met alcoholen in aanwezigheid van een

22

-HOOC

4

(IOOH