Cover Page
The following handle holds various files of this Leiden University dissertation:
http://hdl.handle.net/1887/78473
Author: Busemann, A.
Title: Imaging of alkyne-functionalized ruthenium complexes for photoactivated
chemotherapy
SAMENVATTING
PACT als selectieve behandeling tegen kankercellen
Chemotherapie gaat vaak gepaard met bijwerkingen die worden veroorzaakt door de slechte selectiviteit van het medicijn: naast de kankercellen worden ook gezonde cellen aangevallen. Om deze bijwerkingen tegen te gaan is het belangrijk om de toxiciteit van het medicijn specifiek op het tumorweefsel te richten. Dat kan bijvoorbeeld door het medicijn aan een eiwit te laten binden dat alleen in de kankercellen voorkomt. In een andere aanpak wordt het medicijn in inactieve vorm (de zogenoemde prodrug) toegediend. Het verspreidt zich door het hele lichaam en vervolgens wordt het alleen rond de tumor geactiveerd. Activatie kan onder andere met zichtbaar licht. Van deze zogenoemde fototherapie bestaan twee varianten. Bij fotodynamische therapie (photodynamic therapy, PDT) resulteert de bestraling van de
prodrug in de vorming van reactieve zuurstofdeeltjes (reactive oxygen species) die
toxisch zijn voor cellen. Bij de zuurstofonafhankelijke foto-activeerbare chemotherapie (photoactivated chemotherapy, PACT) leidt de interactie met licht tot het verbreken van een binding in de prodrug wat leidt tot de vorming van het actieve medicijn. Deze actieve stof bindt aan specifieke onderdelen van de cel waardoor verschillende mechanismen in werking gezet worden die uiteindelijk tot de dood van de cel leiden. Voor dit proefschrift zijn verschillende foto-actieve metaalcomplexen op basis van ruthenium onderzocht om erachter te komen of ze geschikt zijn als PACT-medicijn.
Het gedrag van metaalcomplexen in de cel
Samenvatting
PACT-medicijn onderzocht met behulp van een fluorofoorlabeling. Dit label is gekoppeld aan de rutheniumverbinding via een door koper gekatalyseerde azide-alkyncycloadditie (CuAAC).
Alkynfunctionalisering van foto-activeerbare rutheniumcomplexen
Om een label zoals een fluorofoor door middel van CuAAC aan een rutheniumcomplex te koppelen is het noodzakelijk om aan het complex eerst een zogenoemde “klikgroep” aan te brengen, waaraan later het label gekoppeld kan worden. Wij hebben besloten om het kleinst mogelijke handvat te gebruiken, een alkyngroep. Het aanbrengen van een alkyn blijkt doorgaans een lage opbrengst te hebben vanwege nevenreacties. Bovendien vindt de reactie plaats in aanwezigheid van zilverionen. Echter, zelfs zeer lage concentraties zilverionen in een medicijn kunnen dodelijk zijn voor de mens, waardoor deze vermeden moeten worden bij het synthetiseren van stoffen die bedoeld zijn voor therapeutisch doeleinden. Zoals beschreven in hoofdstuk 2 hebben wij een nieuwe syntheseroute ontwikkeld om metaalcomplexen met een alkyngroep te functionaliseren. We hebben de alkynbeschermgroep tert-butyldimetylsilyl (TBDMS) geïntroduceerd. Deze is zowel bestand tegen de eventuele nevenreacties van het alkyn met het rutheniumion als ook tegen de reactiecondities gedurende het syntheseproces. Terwijl het dus wel een sterke beschermgroep is, is TBDMS makkelijk van het alkyn te splitsen door middel van een reactie met fluorideionen. Het gebruik van zilverionen is in deze nieuwe syntheseroute niet nodig.
Verbeterde PACT-medicijnen gebaseerd op ruthenium
Om als PACT-medicijn in aanmerking te komen moet een verbinding stabiel zijn in het donker, geactiveerd worden door bestraling met licht en op dat moment cytotoxisch worden. Van het complex [Ru(tpy)(bpy)(Hmte)](PF6)2 is bekend dat het
PACT-eigenschappen van het complex kunnen worden afgesteld door de liganden aan te passen.
Het effect van de klikgroep op het rutheniumcomplex
Via de alkyngroep kunnen labels aan het rutheniumcomplex gebonden worden die het complex bijvoorbeeld zichtbaar maken in de cel, of waarmee het complex geïsoleerd kan worden. Om de werking van het originele rutheniumcomplex te onderzoeken via een complex mét een alkyngroep moeten de fotofysische en biologische eigenschappen van de complexen met elkaar vergeleken worden (hoofdstuk 2 en 4). De vergelijking van de kristalstructuren, de mate van lichtactivatie en de vorming van singletzuurstof laten zien dat de klikgroep geen significant effect heeft op de geometrie en de eigenschappen van het complex. Alle complexen zijn zeer slechte kandidaten voor fotodynamische therapie omdat ze maar in beperkte mate zorgen voor de vorming van singletzuurstof. Toch resulteert de aanwezigheid van de alkyngroep in een verdubbeling van de rutheniumconcentratie in de cel wat kan worden toegeschreven aan de verhoogde lipofiliciteit van het complex. Het kan geconcludeerd worden dat het toevoegen van een alkyngroep maar een minimale invloed heeft op de eigenschappen van het complex.
Het zichtbaar maken van niet-lichtuitzendende PACT-medicijnen
Doorgaans zijn PACT-medicijnen niet emissief door het doven van de thermisch gegenereerde 3MC-toestand. Daardoor is het niet mogelijk deze complexen in de cel
Samenvatting
met gelelektroforese daarentegen is zacht genoeg om de zwakke interactie tussen het metaal gebaseerde medicijn en het eiwit intact te houden.
Nadat de interactie tussen het rutheniumcomplex met geïsoleerde eiwitten was bestudeerd (hoofdstuk 2) gingen we de interactie met kankercellen onderzoeken (hoofdstuk 4). Het labelen van het complex werd wederom via CuAAC gedaan, deze keer in gefixeerde cellen. Door het fluorofoor pas in de cel aan het complex met alkyngroep te koppelen, en niet al daarvoor, kan de biologische activiteit van het complex behouden worden: de opname, verspreiding en interactie in de cellen wordt niet door de fluorofoorgroep beïnvloed waardoor het gedrag van het complex zonder alkyngroep zoveel mogelijk wordt benaderd.
Na het binden van de fluorofoor werd een fluorescentiesignaal in de fixeerde cellen waargenomen, maar alleen als het complex voor de koppeling met licht was geactiveerd. Zonder activatie kan het complex niet binden aan eiwitten of andere celonderdelen en wordt het na de koppeling uit de cel gewassen. Dit experiment vormt opnieuw bewijs dat de interactie van het complex met eiwitten via licht kan worden aangestuurd. De resultaten laten bovendien zien dat de complexen de kern van de cel niet binnengaan. De complexen blijven in het cytoplasma in de buurt van de kern. Kleuring van de celonderdelen buiten de kern laat zien dat de complexen niet in de mitochondria of het endoplasmatisch reticulum terechtkomen. De verdeling van fluorescentiesignalen geeft aan dat de complexen zich 24 uur na activering in het Golgicomplex bevinden.
Algemene toepassing van de methode met klikgroep
