Van antibioticum naar probioticum : mijn reis door bacterieland

(1)

Van antibioticum naar probioticum : mijn reis door bacterieland

Lugtenberg, E.J.J.

Citation

Lugtenberg, E. J. J. (2008). Van antibioticum naar probioticum : mijn reis door bacterieland. In . Leiden. Retrieved from https://hdl.handle.net/1887/19707

Version: Not Applicable (or Unknown)

License: Leiden University Non-exclusive license

Downloaded from: https://hdl.handle.net/1887/19707

(2)

Prof.dr. E.J.J. Lugtenberg

Van antibioticum naar probioticum:

mijn reis door bacterieland

Universiteit Leiden. Universiteit om te ontdekken.

(3)

(4)

Van antibioticum naar probioticum:

mijn reis door bacterieland

rede uitgesproken door

Prof.dr. E.J.J. Lugtenberg

Ter gelegenheid van zijn afscheid als hoogleraar in de Botanische Microbiologie

aan de Universiteit Leiden

op donderdag 28 augustus 2008

(5)

4

Meneer de Decaan, dames en heren,

Onderwijs

In het tweede jaar van mijn studie moest ik op het practicum organische scheikunde nieuwe stoffen maken in een grote zaal met zo’n 50 andere studenten. Na enkele maanden kwam meneer Hans de Gier, toen promovendus in het lab van Van Deenen, langs met de vraag of ik zijn “assistent”

wilde worden. In Utrecht was Van Deenen toen net gestart met een onderzoeksgroep die bepaalde vetten, fosfolipiden genaamd, bestudeerde. Ik werd door de Gier naar de universiteitsbibliotheek gestuurd om een artikel op te zoeken waarin stond hoe je fosfolipiden kon kwantificeren. Het feit dat ik vervolgens als 19-jarig broekie voor een korte tijd in Utrecht de enige was die fosfolipiden van elkaar kon scheiden en daarna kwantificeren gaf me een gevoel van trots. Mijn liefde voor de biochemie was geboren. Ik ging dat dan ook als hoofdvak doen. De colleges van Van Deenen waren buiten- gewoon interessant: dit was een wereld die ik erg uitdagend vond. Achteraf realiseer ik me dat Hans de Gier met zijn verzoek de basis voor mijn wetenschappelijke carrière heeft gelegd. Persoonlijk contact met de begeleider kan erg motiverend werken.

Als bijvak koos ik microbiologie, omdat de colleges van De Haan en Stouthamer een fascinerende wereld van kleine organismen voor me openden.

Het voorgaande ging over het onderwijs zoals ik dat heb ervaren. Op de kwaliteit van onderwijs is de laatste jaren veel kritiek geweest. Ik heb daar weinig aan toe te voegen.

De politiek heeft bepaald dat studenten met te weinig bagage mogen binnenkomen en dat een hoog percentage daarvan moet slagen. Als dat niet lukt, krijgen de docenten de schuld.

Ik denk dat nogal wat studenten het slachtoffer zijn geworden van dit zwakke beleid.

Laat ik zeggen hoe ik denk dat het wél moet.

1. Bepaal welke vakken je wilt geven en zorg dat je daarvoor docenten hebt of inhuurt.

2. Bepaal, op voorstel van de docent, welke principes van dat vak de student moet kennen. Bedenk ook dat je niet ontkomt aan een portie feitenkennis.

3. Stel eisen aan zowel docent als student. Geef niet automatisch de docent de schuld als de resultaten niet goed zijn. Het spreekt me erg aan dat er eindelijk een politicus is die dit ook vindt. Minister Plasterk wil van de docent weer een ster maken in plaats van het piespaaltje van politici en managers.

4. Er moet een compromis worden gevonden tussen de economische noodzaak om hoog opgeleide, ambitieuze studenten af te leveren en het idee dat iedere student een ster is. Het is onontkoombaar om de studenten in twee groepen in te delen, vooral op basis van ambitieniveau. Pogingen daartoe worden zo hier en daar ondernomen.

Onderzoek

Door het goede onderwijs leek onderzoek in de biochemie en de microbiologie me geweldig. Microbiologie is later mijn vak geworden. Ik wil U daar graag over vertellen.

Als U hier rondkijkt zult U zich realiseren dat deze prachtige Lorentzzaal, waar Albert Einstein nog ooit colleges gaf, plaats biedt aan een paar honderd mensen. Weinigen van U zullen kunnen schatten hoeveel bacteriën er in deze zaal aanwezig zijn. En nog minder mensen weten dat dit in hoge mate wordt bepaald door U, mijn gehoor. Elke mens heeft namelijk gezelschap van een zeer groot aantal kleine makkertjes, bacteriën geheten. Naar schatting brengt ieder van U straks

(6)

Van antibioticum naar probioticum: mijn reis door bacterieland

5 gemiddeld een triljoen bacteriën mee naar de receptie. Een

triljoen is een 1 met 12 nullen erachter. Schrikt U niet. Dit is normaal. Zoals ik in mijn eerste college aan eerstejaars vertelde: afgezien van enkele uitzonderingen, zijn bacteriën onschadelijk of zelfs goed voor ons. Ze zijn onder andere nodig voor onze spijsvertering, ze helpen bij de opbouw van ons afweersysteem, ze breken de olie op onze wegen af, ze helpen planten beter te groeien, en ze beschermen onze huid tegen ziekteverwekkers.

In de meer dan 40 jaar die ik aan wetenschap heb mogen besteden, ben ik betrokken geweest bij ruwweg vier onder- werpen. Terugkijkend op mijn wetenschappelijke loopbaan heb ik geconstateerd dat een rode draad daarin een strijd tegen ziekteverwekkers was, in het bijzonder de rol die antibiotica en probiotica daarin spelen. Antibiotica zijn verbindingen die microbiële infecties bestrijden. Probiotica moeten zulke infecties, bv bij planten, voorkómen.

Promotieonderzoek aan peptidoglycaansynthese en antibiotica Voor mijn promotiewerk, in het laboratorium van prof. De Haan, bestudeerde ik het mechanisme van celdeling bij de Gram-negatieve modelbacterie Escherichia coli - K12. Achteraf gezien was dit een onderwerp waaraan je, gezien de daarvoor benodigde technieken, twintig jaar later had moeten beginnen.

Tegenwoordig zou je zeggen dat ik veel kostbare tijd heb verspeeld. Ik heb die verloren tijd echter achteraf ervaren als een fantastische leerschool. Ik heb namelijk mogen leren hoe je onderzoek NIET moet doen.

Op basis van de opgedane ervaring heb ik een nieuw onderzoek opgezet over de synthese van peptidoglycaan. Dat vormt een zakje om de bacterie heen, bestaande uit slechts één molecule, dat bacteriën hun stevigheid geeft. Aangezien peptidoglycaan uniek is voor bacteriën en essentieel is voor

hun leven, is de synthese ervan aangrijpingspunt voor veel van de beschikbare antibiotica, waaronder penicilline.

Jack Strominger op Harvard had net celvrije systemen opgezet waarmee hij bijna alle ongeveer 17 individuele stappen van de peptidoglycaansynthese kon analyseren. Ik leerde deze technieken in Cambridge, waar ik met een EMBO beurs een maand bij Peter Reynolds in de leer mocht. Drie jaar later had ik stof voor tien publicaties. Ik karakteriseerde een groep conditioneel letale mutanten gemaakt in de groep van Piet van der Putte en Arthur Rörsch, toen beiden werkend bij TNO in Rijswijk. Het meest trots was ik op het feit dat we het werkingsmechanisme van een nieuw antibioticum van een Frans farmaceutisch bedrijf hadden opgelost.

Buitenmembraanonderzoek

De basis voor de tweede fase van mijn onderzoek, aan celoppervlakken van bacteriën, legde ik door een verblijf in de Verenigde Staten aan de Medical School van de University of Connecticut waar Mary Jane Osborn, Larry Rothfield en Henry Wu baanbrekend werk deden aan de samenstelling, structuur en synthese van het bacterieceloppervlak en haar individuele componenten. Dat werk was niet alleen fundamenteel interessant maar gaf ook inzicht in aspecten die voor de volksgezondheid van belang zijn zoals hoe antibiotica een bacterie binnendringen, en welke moleculen gebruikt kunnen worden voor de productie van vaccins. Dat was in de periode waarin men begon membraaneiwitten van elkaar te scheiden.

Terug in Utrecht kreeg ik de kans een nieuwe groep te starten die zich bezig ging houden met buitenmembraaneiwitten en lipopolysaccharides van de bacterie Escherichia coli. Alle concurrerende groepen hadden gelsystemen ontwikkeld waarmee één of twee mysterieuze dominante buitenmembraaneiwitten met onbrekende functies, zichtbaar

(7)

6

werden gemaakt. Hoewel wij een beetje laat aan dit onderzoek waren begonnen, hadden we wel het beste scheidingssysteem ontwikkeld: wij vonden namelijk vier in plaats van twee van deze major outer membrane proteins (Lugtenberg et al., 1975).

En wat nog belangrijker was: elk bandje was zuiver.

Door dit superieure scheidingssysteem kregen we een vooraanstaande positie. Het was een decennium waarin het werk aan de buitenmembraan hot was. De concurrentie was moordend. Tien jaar later was de structuur van de buitenmembraan bekend: een asymmetrische lipidenbilaag waar doorheen eiwitten de membraan overspannen en veelal functioneren als porie voor voedingsstoffen, zoals aminozuren en suikers. De meeste antibiotica kunnen er echter niet doorheen. Dit verklaart de vuistregel dat Gram-negatieve bacteriën resistent zijn tegen antibiotica. Let wel, er zijn ook antibiotica die wél door die poriën kunnen en dus tegen Gram-negatieve bacteriën wél actief zijn.

Mede door een voortreffelijke analiste, Ria van Boxtel, en veel enthousiaste promovendi was dit een fascinerende tijd.

Het werk vond plaats in het net opgerichte Instituut voor Moleculaire Biologie, waarvan Harry Voorma de inspirerende directeur was. Er werd nauw en plezierig samengewerkt met o.a. Arie Verkley aan freeze etch electronenmicroscopie en met Ben de Kruyff aan NMR van gezuiverde membranen.

Voor mijn gevoel werd mijn aandeel aan het buitenmembraanonderzoek afgesloten met een review in BBA Reviews in Biomembranes, geschreven samen met Loek van Alphen (Lugtenberg en Van Alphen, 1983) op uitnodiging van de hoofdredacteur, prof. Van Deenen. We hadden flink bijgedragen aan inzicht in samenstelling, structuur, biogenese en functie van de buitenmembraan. Toen ik in 1983 naar Leiden ging heeft Jan Tommassen de leiding van de membraangroep overgenomen en het werk op een

voortreffelijke manier uitgebouwd.

Als ik tegenwoordig lees over plannen om een bacterie te synthetiseren denk ik vaak terug aan mijn Utrechtse tijd.

Synthetisch biologen krijgen geld om een bacteriecel te synthetiseren. DNA synthetiseren lukt nog wel. En dan moet er alleen nog een simpel zakje omheen. Dat zakje is echter ongelofelijk complex. Allereerst moet je het DNA in een functionerende cytoplasmatische membraan in zien te pakken.

Dit aspect heeft nog weinig aandacht gehad. En vervolgens moet je er een complexe, functionerende peptidoglycaan sacculus omheen bouwen die een druk van 6 à 20 atmosfeer moet tegenhouden. Voorlopig onbegonnen werk. Om maar te zwijgen over Gramnegatieve bacteriën waar ten slotte nog een asymmetrisch buitenmembraan om heen moet.

Naar Leiden voor bacterie-plant-interacties

De Rijksuniversiteit Leiden had een vacature voor een hoogleraar microbiologie. In Leiden was onder leiding van prof. Anton Quispel en dr Carel Wijffelman een groep opgezet die het mechanisme van wortelknolvorming door de Rhizobium bacterie ging bestuderen. In de betreffende vakgroep zat bovendien de beroemde prof. Rob Schilperoort die, samen met de even bekende dr. Paul Hooykaas, aan interacties tussen Agrobacterium en planten werkte. Ze waren daarmee in staat planten genetisch te modificeren. Dit leek me een mooie setting om interacties tussen bacteriën en hogere organismen te bestuderen. Hoewel ik niets van Rhizobium of planten wist, solliciteerde ik en kreeg de baan.

Gunstige bacteriën op de plantenwortel

In Leiden heeft mijn groep zich bezig gehouden met voor de mens gunstige bacteriën, meer specifiek met goede bacteriën

(8)

7 die leven op de plantewortel onder de grond (Bloemberg

en Lugtenberg, 2001). Om het gedrag van deze en andere bacteriën te begrijpen moet ik U eerst drie dingen duidelijk maken.

Allereerst dat bacteriën in veel opzichten op mensen lijken:

ze willen eten, ze moeten vechten om aan voedsel te komen, ze moeten zich kunnen verdedigen, en ze hebben zo nu en dan sex, bij voorkeur op de wortel (Van Elsas et al., 1988).

Sommigen houden van sport, waarbij zwemmen het meest populair is. Een bijzondere vorm daarvan is zwemmen over vaste oppervlakken, een soort tijgeren.

Ten tweede moet U weten onder welke omstandigheden bacteriën op de wortel leven. De pH is daar 5,5 en de hoeveelheid beschikbaar voedsel is minimaal, zo’n 100 à 1000 keer minder dan ze in het laboratorium gewend zijn. Hun voedsel bestaat vooral uit componenten die door de wortel worden uitgescheiden, als zgn. wortelexudaat (Uren, 2007).

Bacteriën zwemmem naar de wortel omdat ze exudaat- componenten herkennen (De Weert et al., 2002). Van alle door de plant als CO2 opgenomen koolstof kan tot wel 25%

via de wortel weer worden uitgescheiden (Meharg en Kilham, 1995). De belangrijkste componenten in wortelexudaat zijn organische zuren, zoals citraat en malaat, suikers, zoals glucose en lactose, en aminozuren, zoals tryptofaan (Lugtenberg et al., 2001). Baanbrekend werk op dit gebied is gedaan door een Russische groep uit Sint-Petersburg onder leiding van Igor Tikhonovich en Lev Kravchenko, met wie we al meer dan 15 jaar intensief samenwerken. Deze samenwerking is ook voor de komende jaren gegarandeerd door het toekennen van een Center of Excellence door Nederlandse en Russische onderzoeksorganisaties, en waarvan Ton Bisseling en Igor Tikhonovich de leiders zijn.

Het leven op de wortel mag dan weliswaar armoedig zijn, het

kan altijd nog slechter. In de grond die zich wat verder van de wortel bevindt, de zgn. bulk soil, is de bacterieconcentratie zelfs 10 tot 1000 keer minder dan op de wortel (Hiltner, 1904).

Opvallend is dat we meer dan 99% van deze bacteriën niet kunnen kweken in het lab. Over deze bacteriën weten we dus nagenoeg niets.

Ten derde, het is mogelijk de plantengroei te beïnvloeden door bacteriën aan de plant, liefst aan zaad, toe te voegen (Schroth en Hancock, 1983). Dit laatste heet bacterisatie van zaad. Aangezien commercieel zaad weinig bacteriën bevat is de op zaad gecoate bacterie na kieming van het zaad dominant op de wortel aanwezig en heeft daarom de beste kans om de wortel te koloniseren en daar effect te hebben. Inzicht in het mechanisme van kolonisatie en kennis om goede wortelkoloniseerders te isoleren bestond niet. Wij hebben daar enige tijd ons hoofdonderwerp van gemaakt, wat resulteerde in het identificeren van een groot aantal voor kolonisatie benodigde eigenschappen (Lugtenberg en Dekkers, 1999;

Lugtenberg et al., 2001) en methoden om goede koloniseerders op te sporen (Kuiper et al., 2001; Kamilova et al., 2005; Validov et al., 2007).

Voor welke doeleinden kunnen wortelbacteriën door de mens worden ingezet?

Gunstige wortelbacteriën zijn in vier groepen in te delen op basis van wat ze voor ons mensen kunnen betekenen. De eerste groep is in staat planten van voedingsstoffen te voorzien:

de zgn. biofertilisers of biologische bemesters. Groep twee bestaat uit de plantengroeibevorderaars. Een derde groep wortelbacteriën, de rhizoremediators, breekt milieugevaarlijke stoffen af. De vierde en laatste groep beschermt de plant tegen ziekteverwekkers.

In de volgende minuten zal ik proberen U te schetsen hoe we

(9)

8

deze vier groepen goede bacteriën voor de mens nuttig kunnen maken.

a. Rhizobium bacteriën als bemesters van planten

Allereerst zijn er dus de bacteriën die planten van voedingsstoffen, zoals stikstof, fosfor en ijzer, kunnen voorzien.

Ik zal me hier tot stikstofbemesters beperken. Rhizobium bacteriën bevinden zich in knolletjes op de wortel van vlinderbloemige planten en halen gasvormige stikstof uit de lucht en zetten dit om in ammonia. Dat geven ze aan de plant in ruil voor koolstofrijke verbindingen zoals malaat.

Chemische stikstofkunstmest kan geheel of gedeeltelijk door bacteriën worden vervangen. Omdat veel chemische stikstof in grondwater en lucht terecht komt, en Rhizobium alleen maar op de wortel stikstof produceert, heeft het gebruik van Rhizobium duidelijk de voorkeur. Het bemesten met Rhizobium wordt wereldwijd toegepast, bv. bij soja, pinda, alfalfa en erwt.

Toen ik in Leiden kwam was er binnen de groep al enig inzicht verworven over de grote lijnen van het ontstaan van wortelknollen: dat begint met een chemische communicatie tussen plant en bacterie. De plant zendt een signaal uit dat de bacteriële genen voor wortelknolvorming aanzet. Het bacteriële product van deze nod-genen, de Nod-factor, wordt naar de plant gestuurd met de boodschap: hier zijn voldoende goede bacteriën om een knolletje te vormen. De plant reageert daar weer op met de productie van de eerder genoemde wortelknollen. Het principe van deze bacterie-plant interactie was o.a. door Ton van Brussel (Van Brussel et al., 1986) blootgelegd. Nu de moleculaire basis nog.

Promovendus Herman Spaink construeerde stammen die konden worden gebruikt om de eerder genoemde inducer uit het wortelexudaat van de plant te detecteren. Op een

zaterdagmiddag belde Carel Wijffelman me op met de fantastische mededeling dat het flavonoïde naringenine in een zeer lage concentratie de nodulatiegenen van de bacterie aanzet (Spaink et al., 1987).

Nu het signaal van de plant bekend was, werd de volgende uitdaging om het moleculaire antwoord van de bacterie, de Nod factor, te identificeren. Herman Spaink, in samenwerking met de Amerikaanse groepen van Eugene Kennedy aan de Harvard Universiteit en Peter Albersheim in Athens, Georgia, maakte duidelijk dat de Nod-factor van de plant een lipo-oligosaccharide molecule is, een chitine fragment met een verzuurstaart. Toen we het werk hadden ingestuurd voor publicatie werd soortgelijk werk aan een andere Rhizobium bacterie door de groep van Jean Dénarié gepubliceerd.

Beide artikelen haalden Nature (Lerouge et al., 1990;

Spaink et al., 1991).

Het was toen duidelijk dat het vervolg van het wortelknol- onderzoek in de plant zou plaatsvinden, zoals de isolatie van de receptor van de Nod-factor. Aangezien mijn leeropdracht microbiologie was, gingen we dat niet proberen. Het werd weer tijd om te switchen. Zoals gezegd, wortelbacteriën kunnen nog drie andere goede dingen doen. Deze hebben we bestudeerd aan bacteriën die allemaal als voornaam Pseudomonas hebben.

b. Pseudomonas bacteriën als bevorderaars van plantengroei Sommige wortelbacteriën produceren plantenhormonen, bijv.

auxine. Dit stimuleert de groei van het wortelstelsel waardoor een plantje zich makkelijker vestigt. Om auxine te maken gebruiken bacteriën meestal het aminozuur tryptofaan, dat door plantenwortels wordt uitgescheiden. Als de plant veel tryptofaan uitscheidt, en als er voldoende auxineproducerende bacteriën op de wortel aanwezig zijn, kan dit leiden tot een zódanig hoog auxineniveau dat de plant sneller groeit, en zich

(10)

9 dus gemakkelijk vestigt, hetgeen bv. in droge grond beslissend

kan zijn voor het al of niet aanslaan van de plant.

Een duidelijk voorbeeld van groeiversnelling door auxine is te zien bij radijs (Kamilova et al., 2006).

c. Pseudomonas bacteriën als schoonmakers van verontreinigde grond

Sommige gronden zijn zodanig verontreinigd met schadelijke stoffen dat plantengroei onmogelijk wordt. Er zijn bacteriën die de schadelijke stoffen in de grond kunnen afbreken en daardoor de grond weer schoon maken, waardoor planten er weer goed op kunnen groeien. Een voorbeeld daarvan is de met olie bedekte woestijngrond in Kuweit, waar Saddam Hoessein - voor hij zijn troepen terugtrok - de oliekranen open liet zetten. Ook in Nederland hebben we vele gronden die zijn verontreinigd met gevaarlijke stoffen.

In ons onderzoek hebben we als voorbeeld van een dergelijke stof naftaleen gebruikt. Het is gemakkelijk om bacteriën te selecteren die zulke stoffen kunnen afbreken. Het probleem dient zich aan als je zulke bacteriën met grond mengt: de bacteriën verhongeren en voeren dan hun schoonmakende taak niet uit. In een STW project, in samenwerking met de groepen van Dick Janssen en Peter Weisbeek, hebben we geprobeerd dit probleem op te lossen door een bacterie te selecteren die niet alleen in staat is naftaleen af te breken, maar ook nog in grond kan groeien. Dit laatste bereikten we door de meest voorkomende voedselbron uit grond toegankelijk te maken voor de bacterie, namelijk het eerder genoemde wortelexudaat (Lugtenberg et al., 2001).

Uitgaande van alle duizenden bacteriën die aanwezig zijn op de wortel heeft Irene Kuiper een bacterie geselecteerd die zowel op naftaleen kan groeien als graswortels kan koloniseren.

Deze bleek in staat om met naftaleen verontreinigde grond

schoon te maken waardoor kieming van graszaden weer mogelijk werd (Kuiper et al., 2001). In principe is het met deze nieuwe methode mogelijk om vele, misschien zelfs alle, verontreinigingen op te ruimen (Kuiper et al., 2004).

d. Pseudomonas bacteriën als probioticum voor het bestrijden van plantenziekten

Plantenziekten worden vaak veroorzaakt door schimmels en kunnen lang niet altijd worden voorkómen met resistente planten of chemische pesticiden. Het toepassen van bacteriën als probioticum op bv. zaad, al of niet samen met chemische middelen, kan een oplossing zijn voor dit probleem (Haas en Défago, 2005). Aan Bob Schippers komt de eer toe deze vorm van ziektebestrijding in Nederland te hebben geïntroduceerd.

Wij zijn bij dit werk betrokken geraakt via een STW project waarbij ook Peter Weisbeek, Letty de Weger en Peter Bakker betrokken waren.

Later hebben we, vaak samen met Fergal O’Gara in Ierland en Ruud Scheffer en Bernadette Kroon van het zaadbedrijf Syngenta, een behoorlijk aantal EU projecten binnengehaald die de basis vormden voor ons biocontrole-onderzoek.

Ook STW heeft flink bijgedragen. In een latere fase, waarin samenwerking met de eerder genoemde Russische groepen belangrijk was, heb ik dit onderzoek samen met Guido Bloemberg geleid. Tenslotte wil ik de rol van de milieulobby noemen. Zij hebben politici ervan overtuigd dat alles wat chemisch is per definitie fout is en dat alles wat natuurlijk is per definitie goed is. Dit misverstand heeft deze keer in ons voordeel gewerkt.

Ons modelsysteem is tomaten voet- en wortelrot, een ziekte die wordt veroorzaakt door de schimmel Fusarium. Bij ons werk wordt de pathogeen in de vorm van sporen gemengd

(11)

10

met de grond, terwijl de biocontrolebacterie op het zaad wordt aangebracht. Na drie weken wordt gekeken hoeveel planten ziek zijn. Als planten die met de testbacterie waren behandeld statistisch beter overleven dan niet gebacteriseerde controleplanten, dan hebben we te maken met een bacterie die de ziekte onderdrukt. We vonden vele bacteriën die dit inderdaad kunnen, vaak ook bij andere planten dan tomaat en bij andere ziekteverwekkers dan Fusarium.

Zó hebben we een groot aantal bacteriën geïsoleerd die, toegepast op zaad, plantenziektes voorkómen, ook onder praktijkomstandigheden. Deze varieerden van hightech kassen in Nederland waarin tomaten groeien op steenwol, tot komkommers die groeien in de volle grond van Oezbekistan die sterk is verontreinigd met zout, landbouwchemicaliën, en pathogene schimmels.

In de laatste minuten van dit verhaal wil ik het hebben over de verschillende mechanismen die biocontrole-pseudomonaden kunnen gebruiken om wortelziektes te onderdrukken.

(i). Het best bekende mechanisme om schimmels te bestrijden heet antibiose (Tomashow en Weller, 1995; Chin-A-Woeng et al., 1998; Cazorla et al., 2006; Kaur et al., 2006; Raaijmakers et al., 2006). Hierbij produceert de bacterie op de wortel een antibioticum dat de schimmel bestrijdt. In onze groep heeft Thomas Chin-A-Woeng bewezen dat kolonisatie van het hele wortelstelsel door de antibioticumproducerende bacterie cruciaal is voor deze bescherming (Chin-A-Woeng et al., 2000). We stellen ons daarbij voor dat de wortelkoloniserende bacterie een mijnenveld van antibioticummoleculen om de wortel legt waar schimmels niet levend doorheen komen.

Francisco Cazorla heeft een stam geïsoleerd die zelfs een nieuw antibioticum maakt (Cazorla et al., 2006).

Critici onder U zullen zich afvragen waarom de door bacteriën geproduceerde fungiciden beter zouden zijn dan de zo gehate chemische fungiciden. Dat heeft te maken met de mate waarin het milieu belast wordt.

De biologische antibiotica worden alleen geproduceerd op de wortel, de plaats waar ze nodig zijn. Chemische fungiciden worden over het hele veld verspreid en het overgrote deel van deze moleculen zal nooit de doelschimmel bereiken.

Ten tweede zijn de door de bacterie geproduceerde antibiotica afbreekbaar. Chemische fungiciden worden echter juist ontworpen om lang te werken en worden dus opzettelijk moeilijk afbreekbaar gemaakt. Weer belastend voor het milieu.

(ii). Een tweede mechanisme dat door sommige Pseudomonas bacteriën kan worden gebruikt om planten te beschermen tegen ziekteverwekkers is systemische inductie van resistentie, in het Engels Induced Systemic Resistance genoemd, en dus afgekort als ISR (Van Loon en Bakker, 2006; Van Loon, 2007).

In dit geval hoeft de bacterie niet het hele wortelstelsel te koloniseren, maar is lokale aanwezigheid voldoende voor bescherming (Dekkers et al., 2000). Vanuit de plaats waar de bacteriën zitten verspreidt zich een signaal door het hele systeem van de plant.

ISR is ontdekt in het lab van Bob Schippers (Van Peer et al., 1991) in Baarn en ongeveer gelijktijdig door de groep van Joe Kloepper (Wei et al., 1991). Het onderzoek van Schippers werd verplaatst naar Utrecht en daar met succes voortgezet door Peter Bakker, Kees van Loon en Corné Pieterse.

ISR kan een brede resistentie geven want het kan de plant beschermen tegen virussen, bacteriën, schimmels, nematoden en insecten. Of een bacterie beschermt via ISR, en zo ja tegen welke ziekteverwekkers, hangt o.a. af van de bacterie-plant combinatie.

Om ISR te bewerkstelligen zijn geen levende bacteriën nodig.

(12)

11 Een groot aantal componenten van de bacterie, die chemisch

gezien totaal onverwant zijn, kunnen ISR veroorzaken. Het betreft onder meer flagellen, lipopolysaccharide, sommige antibiotica zoals 2,4 diacetyl phloroglucinol en cyclische lipopeptiden, de vluchtige verbinding 2,3 butaandiol en de beroemde signaalmoleculen N-acyl homoserine lactonen (Van Loon, 2007; Ryu et al., 2004; Ongena et al., 2007) . De Utrechtse groep is bezig de latere stappen, die in de plant plaatsvinden, op te lossen (Van Wees et al., 2000).

(iii). Een in de literatuur vaak genoemd mechanisme is competitie met de ziekteverwekker voor voedingsstoffen en voor vestigingsplaatsen op de wortel. In het Engels heet dat

“competition for nutrients and niches”, door ons afgekort als CNN. Hoewel CNN als bestrijdingsmechanisme aannemelijk leek, was er nooit een bewijs voor geleverd. Faina Kamilova redeneerde dat, als CNN bestaat, wij CNN bacteriën kunnen isoleren via de door ons ontwikkelde selectie van goede wortelkoloniseerders. Dit idee werd door Faina samen met Shamil Validov getest en bleek correct. Ze bleken de schimmel niet alleen te verslaan in de competitie om voedingsstoffen en plekken op de wortel, ze remden bovendien de kieming van sporen en de terugkeer van hyfen naar sporen als overlevingsvorm (Kamilova et al., 2008).

CNN bacteriën bleken niet alleen in het lab maar ook onder praktijkomstandigheden te werken (Kamilova et al., 2005; Validov et al., 2007; Validov, 2007). Ik beschouw CNN bacteriën als de beste klasse van biologische bestrijders. Ze hebben niet de nadelen van antibioticumproducenten, die bij registratie problemen hebben, of van ISR bacterien, waarop niet te selecteren is. CNN bacteriën zijn alleskunners: het zijn superzwemmers, ze eten en delen onder het zwemmen, en winnen de stoelendans om de goede plekken op de wortel

van de ziekteverwekkers. Ze zijn gemakkelijk te isoleren en bij isolatie kun je de omstandigheden kiezen waaronder ze moeten werken. Dit is weer een mooi voorbeeld van waar selectie in de microbiologie toe kan leiden.

(iv). Bij het vierde en laatste mechanisme hecht de bacterie zich fysiek aan de schimmel in een poging om haar als voedsel te gebruiken. Fusarium hyfen scheiden een stofje uit, fusaarzuur geheten (Notz et al., 2004), dat door de bacterie wordt herkend en een signaal is dat er hyfen als potentieel voedsel in de buurt zijn. De bacterie zwemt naar het fusaarzuur (De Weert et al., 2003) - dus naar de hyfen - toe, hecht zich eraan (Bolwerk et al., 2003), en gebruikt waarschijnlijk voedsel uit de hyfe via het type drie secretiesysteem (De Weert et al., 2007). De schimmel wordt daardoor ernstig verzwakt: hij deelt niet meer, en vormt geen sporen meer (Kamilova et al., 2008).

De toekomst van bacterisatie

Terugkijkend op onze gunstige bacteriën, is de huidige realiteit dat bacteriën veel nuttigs kunnen doen maar dat hun nuttige eigenschappen niet onder alle omstandigheden tot uiting komen. Dit is logisch, omdat voor een gunstig effect minstens drie levende partners moeten meewerken, namelijk de bacterie, de plant, en de ziekteverwekker. Deze drie zullen verschillend reageren op verandering van omgevingsfactoren zoals temperatuur, pH, en op chemische componenten in hun omgeving.

Voor de toekomst ben ik optimistisch omdat door fundamenteel werk een veel beter begrip van fysiologie en werkingsmechanismen van de bacterie is verkregen waardoor steeds meer variabelen bekend, en dus vaak beheersbaar, zijn geworden. Ik zie dan ook een grote toekomst voor toepassing van bacteriën in plaats van, en naast, chemicaliën.

(13)

12

Een handicap is echter dat veel zaadbedrijven in handen zijn van chemische multinationals die chemicaliën willen blijven verkopen. Daarom zijn de kansen voor toepassing van bacteriën misschien wel beter in ontwikkelingslanden, waar chemicaliën duur zijn, bacteriën gemakkelijk te kweken zijn, en de noodzaak voor meer en gezonder voedsel een politiek sterker argument is dan de angst die vooral in Europa bestaat voor nieuwe technieken. In een door Brussel betaalde samenwerking met groepen uit Oezbekistan, Oostenrijk en Rusland hebben we gevonden dat in de arme Oezbeekse woestijngrond de bacterieconcentratie heel laag is en het percentage potentiële ziekteverwekkers heel hoog. Dit leidt tot een laag kiemingspercentage, veel zieke planten, en een lage opbrengst. Ook is de ziekte onder agrarische werkers daar hoog.

Door bacterisatie van het zaad met gunstige bacteriën steeg hun kieming spectaculair, groeien de planten veel beter, en gaat ook de opbrengst spectaculair omhoog (zie o.a.

Egamberdiyeva et al., 2008). Ook hebben we gezien dat de resistentie van planten tegen stress door zout, droogte en hitte sterk kan worden verbeterd door bacterisatie. Zoutstress is nu ook al relevant in Zuid-Europa en zal, met het stijgen van de zeespiegel, steeds belangrijker worden voor Europa, inclusief voor Nederland.

Maar biocontrole heeft ook goede mogelijkheden in de moderne tuinbouw. Steeds vaker worden tomaten, komkommers en paprika’s niet in grond maar op steenwol gekweekt. Nieuwe steenwol is praktisch steriel, waardoor een vroege infectie met een pathogeen alle planten kan vernietigen.

Onder die omstandigheden werken biocontrolebacteriën erg goed in de kas, zoals we recent in praktijkkassen hebben bewezen (Validov, 2007).

De toekomst van Pseudomonas onderzoek in Leiden

is onzeker. Zeker is dat microbiologie in de vorm van schimmelonderzoek doorgaat. Ik wens mijn opvolger en vriend Kees van den Hondel daarmee veel succes.

Dankwoord

Bijna aan het einde van dit college gekomen wil ik iedereen bedanken die heeft bijgedragen aan het plezier dat ik beleefd heb aan mijn wetenschappelijke werk. Daartoe behoren o.a.

analisten, wetenschappers, de ICT boys, de medium-makers in de keuken, plantenverzorgers, portiers, schoonmakers, secretaresses en - last but not least - de geldschieters. Een speciaal dankwoord wil ik richten tot de mensen die ook uiterst loyaal geweest zijn onder moeilijke omstandigheden.

Allereerst mijn ouders, die de oudste van hun grote gezin lieten studeren. Beide zijn helaas overleden. Verder mijn kinderen Anneliek, Martijn en Marjolein. Kids, jullie betekenen heel veel voor me, waarschijnlijk meer dan jullie beseffen. Dan onze onvolprezen secretaresse Sonja Wijfjes-Chang. Sonja, bijna 25 jaar lang kon ik altijd op je rekenen. Tenslotte mijn collega en later mijn echtgenote Faina Kamilova. Faina, de laatste zes jaar waren we partners, op het werk en thuis. Dat waren geweldige jaren.

Ik heb gezegd.

(14)

13

Literatuur

Bloemberg G.V. and Lugtenberg B.J.J. (2001). Molecular basis of plant growth promotion and biocontrol by rhizobacteria. Curr. Opin.

Plant Biol. 4:343-350.

Bolwerk, A., Lagopodi, A.. L., Wijfjes, A.H.M., Lamers, G.E.M., Chin- A-Woeng, T.F.C., Lugtenberg, B.J.J. and Bloemberg, G.V. (2003) Interactions in the tomato rhizosphere of two Pseudomonas biocontrol strains with the phytopathogenic fungus Fusarium oxysporum f. sp radicis-lycopersici. Mol. Plant-Microbe Interact.

16:983-993.

Cazorla, F.M., Duckett, S.B., Bergström, E.T., Noreen, S., Odijk, R., Lugtenberg, B.J.J., Thomas-Oates, J.E. and Bloemberg G.V. (2006).

Biocontrol of avocado Dematophora root rot by the antagonistic Pseudomonas fluorescens PCL1606 correlates with the production of 2-hexyl 5-propyl resorcinol. Mol. Plant-Microbe Interact.

19:418-28.

Chin-A-Woeng, T.F.C., Bloemberg, G.V., Van der Bij, A.J., Van der Drift, K.M.G.M., Schripsema, J., Kroon, B., Scheffer, R.J., Keel, C., Bakker, P.A.H.M., Tichy, H.-V., De Bruijn, F.J., Thomas-Oates, J.E. and Lugtenberg, B.J.J. (1998) Biocontrol by phenazine-1- carboxamide-producing Pseudomonas chlororaphis PCL1391 of tomato root rot caused by Fusarium oxysporum f.sp. radicis- lycopersici. Mol. Plant-Microbe Interact. 11:1069-1077.

Chin-A-Woeng, T.F.C., Bloemberg, G.V., Mulders, I.H.M., Dekkers, L.C. and Lugtenberg, B.J.J. (2000) Root colonization by phenazine- 1-carboxamide-producing bacterium Pseudomonas chlororaphis PCL1391 is essential for biocontrol of tomato foot and root rot.

Mol. Plant-Microbe Interact. 13:1340-1345.

Dekkers, L.C., Mulders, I.H.M., Phoelich, C.C., Chin-A-Woeng, T.F.C., Wijfjes, A.H.M. and Lugtenberg, B.J.J. (2000) The sss colonization gene of the tomato-Fusarium oxysporum f.sp. radicis-lycopersici biocontrol strain Pseudomonas fluorescens WCS365 can improve root colonization of other wild-type Pseudomonasspp. Bacteria.

Molec. Plant-Microbe Interact. 13:1177-1183.

De Weert, S., Vermeiren, H., Mulders, I.H.M., Kuiper, I., Hendrickx, N., Bloemberg, G.V., Vanderleyden, J., De Mot, R. and Lugtenberg, B.J.J. (2002) Flagella-driven chemotaxis towards exudate

components is an important trait for tomato root colonization by Pseudomonas fluorescens. Mol.. Plant-Microbe. Interact.

15:1173–1180.

De Weert, S., Kuiper, I., Lagendijk, E.L., Lamers, G.E.M. and Lugtenberg, B.J.J. (2003) Role of chemotaxis toward fusaric acid in colonization of hyphae of Fusarium oxysporum f.sp. radicis- lycopersici by Pseudomonas fluorescens WCS365. Mol. Plant- Microbe Interact. 16:1185-1191.

De Weert, S., Kuiper, I., Kamilova, F., Mulders, I.H.M., Bloemberg, G.V., Kravchenko, L., Azarova, T., Eijkemans, K., Preston, G.M., Rainey, P., Tikhonovich, I., Wijfjes, A.H.M. and Lugtenberg, B. (2007) The role of competitive root tip colonization in the biological control of tomato foot and root rot. In: Biological control of plant diseases. Chincolkar, S.B. and Mukerji, K.G. (eds), pp. 103-122. The Haworth Press, Inc., New York, London, Oxford.

Egamberdiyeva, D., Kamilova, F., Validov, S., Gafurova, L., Kucharova, Z. and Lugtenberg, B. (2008) High incidence of plant growth- stimulating bacteria associated with the rhizosphere of wheat grown in salinated soil in Uzbekistan. Environmental Microbiol., 10:1-9.

Haas, D. and Défago, G. (2005) Biological control of soil-borne pathogens by fluorescent pseudomonads. Nat. Rev. Microbiol.

3:307-319.

Hiltner, L. (1904) Über neuere Erfahrungen und Probleme auf dem Gebiete der Bodenbakteriologie unter besonderer Berücksichtigung der Gründung und Brache. Arb. Dtsch.

Landwirtsch. Ges. Berl., 98:59–78.

Kamilova, F., Validov, S., Azarova, T., Mulders, I and Lugtenberg, B. (2005) Enrichment for enhanced competitive plant root tip colonizers selects for a new class of biocontrol bacteria. Environ.

Microbiol. 7:1809-1817.

Kamilova, F., Kravchenko, L.V., Shaposhnikov, A.I., Azarova, T., Makarova, N. and Lugtenberg, B.J.J. (2006) Organic acids, sugars, and L-tryptophane in exudates of vegetables growing on stonewool and their effects on activities of rhizosphere bacteria.

19:250-256.

Kamilova, F., Lamers, G. and Lugtenberg, B. (2008) Biocontrol

(15)

14

strain Pseudomonasfluorescens WCS365 inhibits germination of Fusarium oxysporum spores as well as subsequent formation of new spores. Environ. Microbiol. 10:2455-2461.

Kaur, R., Macleod, J., Foley, W. and Nayudu, M. (2006) Gluconic acid: an antifungal agent produced by Pseudomonas species in biological control of take-all. Phytochemistry 67:595-604 Kuiper, I., Bloemberg, G. V. and Lugtenberg, B.J.J. (2001) Selection

of a plant-bacterium pair as a novel tool for rhizostimulation of polycyclic aromatic hydrocarbon degrading bacteria. Mol. Plant- Microbe Interact. 14:1197-1205.

Kuiper, I., Lagendijk, E.L., Bloemberg, G.V., and Lugtenberg, B.J.J.

(2004) Rhizoremediation: A beneficial plant-microbe interaction.

Mol. Plant-Microbe Interact. 17:6-15.

Lerouge, P., Roche, P., Faucher, C., Maillet, F., Truchet, G., Promé, J.C.

and Dénarié, J. (1990) Symbiotic host-specificity of Rhizobium meliloti is determined by a sulphated and acylated glucosamine oligosaccharide signal. Nature, 344:781-784.

Lugtenberg, B., Meijers, J., Peters, R., Van der Hoek, P. and Van Alphen, L. (1975) Electrophoretic resolution of major outer membrane protein of Escherichia coli K12 into four bands. FEBS Letters 58:254-258.

Lugtenberg, B. and van Alphen, L. (1983) Molecular architecture and functioning of the outer membrane of Escherichia coli and other Gram-negative bacteria. Biochim. Biophys. Acta 737:51-115.

Lugtenberg, B.J.J. and Dekkers, L.C. (1999) What makes Pseudomonas bacteria rhizosphere competent? Environ. Microbiol. 1:9-13.

Lugtenberg, B.J.J., Dekkers, L.C. and Bloemberg, G.V. (2001) Molecular determinants of rhizosphere colonization by Pseudomonas. Annu.

Rev. Phytopathol. 39:461-490.

Meharg, A.A. and Killham, K. (1995) Loss of exudates from the roots of perennial ryegrass inoculated with a range of microorganisms.

Plant Soil, 170:345-349.

Notz, R., Maurhofer, M., Dubach, H., Haas, D. and Défago, G.

(2002) Fusaric acid producing strains of Fusarium oxysporum alter 2,4-diacetylphloroglucinol biosynthetic gene expression in Pseudomonas fluorescens CHA0 in vitro and in the rhizosphere of wheat. Appl. Environ. Microbiol. 68:2229–2235.

Ongena, M., Jourdan, E., Adam, A., Paquot, M., Brans, A., Joris, B., Arpigy,J.-L. and Thonart, P. (2007) Surfactin and fengycin lipopeptides of Bacillus subtilis as elicitors of induced systemic resistance in plants. Environm. Microbiol. 9:1084-1090.

Raaijmakers, J.M., De Bruijn, I. and De Kock, M.J.D. (2006) Cyclic lipopeptide production by plant-associated Pseudomonas spp.:

diversity, activity, biosynthesis and regulation. Mol. Plant-Microbe Interact. 19:699-710.

Ryu, C. M., Farag, M. A., Hu, C. H., Reddy, M.S., Kloepper, J. and Pare, P.W. (2004) Bacterial volatiles induce systemic resistance in Arabidopsis. Plant Physiol. 134:1017-1026.

Schroth, M.N. and Hancock, J.G. (1982) Disease-suppressive soil and root-colonizing bacteria. Science 216:1376-1381.

Spaink, H.S., Wijffelman, C.A., Pees, E., Okker, R.J.H. and Lugtenberg, B.J.J. (1987) Rhizobium nodulation gene nodD as a determinant of host-specificity. Nature 328:337-340.

Spaink, H.P., Sheeley, D.M., Van Brussel, A.A.N., Glushka, J., Tak, T., Geiger, O., Kennedy, E.P., Reinhold, V. N. and Lugtenberg, B. J.

J. (1991) A novel highly unsaturated fatty acid moiety of lipo- oligosaccharide signals determines host specificity of Rhizobium.

Nature 354:125-130.

Thomashow, L.S. and Weller, D.M. (1996) Current concepts in the use of introduced bacteria for biological disease control: Mechanisms and antifungal metabolites. In: Stacey, G. and Keen, N.T. (eds.) Plant-Microbe Interact., 1:187–235.

Uren, N.C. (2007) Types, amounts, and possible functions of compounds released into the rhizosphere by soil-grown plants. In:

The rhizosphere. Biochemistry and organic substances at the soil- plant interface. Pinton, R., Varanini, Z. and Nannipieri, P. (eds.).

Second edition, pp.1-21. CRC press, Taylor and Francis Group, Boca Raton, FL, USA.

Validov, S., Kamilova, F., Qi, S., Stephan, D., Wang, J.J., Makarova, N.

and Lugtenberg, B. (2007) Selection of bacteria able to control Fusarium oxysporum f. sp. radicis- lycopersici in stonewool substrate. J. Appl. Microbiol.102:461-471.

Validov, S. (2007) Biocontrol of tomato foot and root rot by Pseudomonas bacteria in stonewool. PhD Thesis, Leiden

(16)

15 University.

Van Brussel, A.A.N, Zaat, S.A.J., Canter Cremers, H.C.J., Wijffelman, C.A., Pees, E., Tak, T. and Lugtenberg, B.J.J. (1986) Role of plant root exudate and Sym plasmid- localized nodulation genes in the synthesis by Rhizobium leguminosarum of Tsr factor which causes thick and short roots on common vetch. J. Bacteriol. 165:517-522.

Van Elsas, J.D., Trevors, J.T. and Starodub, M.E. (1988) Bacterial conjugation between pseudomonads in the rhizosphere of wheat.

FEMS Microbiol. Ecol. 54:299-306.

Van Loon, L.C. and Bakker, P.A.H.M. (2006) Induced systemic resistance as a mechanism of disease suppression by rhizobacteria.

In: PGPR: Biocontrol and biofertilization. Siddiqui, Z.A. (ed.), pp.

39-66. Springer, Dordrecht, The Netherlands.

Van Loon, L.C. (2007) Plant responses to plant growth-promoting bacteria. Eur. J. Plant Pathol. 119:243-254.

Van Peer, R., Niemann, G.J. and Schippers, B. (1991) Induced resistance and phytoalexin accumulation in biological control of fusarium wilt of carnation by Pseudomonas sp. strain WCS417r.

Phytopathology 81:728-734.

Van Wees, S. C. M., De Swart, E.A.M., Van Pelt, J.A., Van Loon, L.C.

and Pieterse, C.M.J. (2000) Enhancement of induced disease resistance by simultaneous activation of salicylate- and jasmonate- dependant defense pathways in Arabidopsis thaliana Proc. Natl.

Acad. Sci. USA 97:8711-8716.

Wei, G., Kloepper, J.W, and Tuzun, S. (1991) Induction of systemic resistance of cucumber to Colletotrichum orbiculare by select strains of plant growth-promoting rhizobacteria. Phytopathology 81:1508-1512.

In deze reeks verschijnen teksten van oraties en afscheidscolleges.

Meer informatie over Leidse hoogleraren:

Leidsewetenschappers.Leidenuniv.nl

(17)

Prof.dr. E.J.J. Lugtenberg (Olst, 1941)

1965 Utrecht, doctoraal examen scheikunde.

1971 Utrecht, promotie op een proefschrift over peptidoglycaan synthese.

1972-1973 Postdoc Health Center University of Connecticut, Farmington, CN, USA.

1973-1983 Utrecht, leider onderzoeksgroep “Structure, biogenesis and function of outer membranes of Gram-negative bacteria”

1983-2006 Leiden, hoogleraar Microbiologie.

Het onderzoek betrof de studie van voor de mens nuttige bacteriën die zich op de wortels van planten bevinden. Nuttige eigenschappen betreffen microbiële bemesting van planten, plantengroeibevordering via door Pseudomonas bacteriën geproduceerd

Andere activiteiten o.a.:

1984 Co-director van een Gordon Conference “Bacterial Cell Surfaces”.

Diverse patentaanvragen; deelnemer en/of coordinator van EU, INTAS, NWO en EET projecten; lid Editorial Board van diverse tijdschriften; begeleider van ongeveer 32 promovendi. (Co)-auteur van meer dan 230 peer-reviewed publicaties. Meer dan 12 000 keer geciteerd. Hirsch index 57, gebaseerd op auteursnamen Lugtenberg B., BJJ en EJJ. Organizator van twee NATO Advanced Research Workshops en van het Third European Congress on Biological Nitrogen Fixation (in resp. 1986, 1989 en 1997).

1986 en 1989 Organizator van twee NATO Advanced Research Workshops en van het Third European Congress on Biological Nitrogen Fixation 1997.

1988-1998 Mede-Leider van het TNO-UL Centrum voor Fytotechnologie.

1988-1993 Lid Adviesraad van het Max-Planck-Institute for Plant Breeding, Keulen.

1997 Gekozen tot buitenlands lid van de Russische Academie van Landbouwwetenschappen.

1999-2001 Wetenschappelijk Directeur Instituut voor Moleculaire Plantkunde.

2001-2003 President van de International Society of Molecular Plant-Microbe Interactions