University of Groningen
tRNA mimicking structures to control and monitor biological processes Paul, Avishek
DOI:
10.33612/diss.166342562
IMPORTANT NOTE: You are advised to consult the publisher's version (publisher's PDF) if you wish to cite from it. Please check the document version below.
Document Version
Publisher's PDF, also known as Version of record
Publication date: 2021
Link to publication in University of Groningen/UMCG research database
Citation for published version (APA):
Paul, A. (2021). tRNA mimicking structures to control and monitor biological processes. University of Groningen. https://doi.org/10.33612/diss.166342562
Copyright
Other than for strictly personal use, it is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of the author(s) and/or copyright holder(s), unless the work is under an open content license (like Creative Commons).
Take-down policy
If you believe that this document breaches copyright please contact us providing details, and we will remove access to the work immediately and investigate your claim.
Downloaded from the University of Groningen/UMCG research database (Pure): http://www.rug.nl/research/portal. For technical reasons the number of authors shown on this cover page is limited to 10 maximum.
172
Chapter 8
173
Synthetische biologie is gericht op de rationele constructie van biologische systemen op basis van technische principes. In het vroege ontwikkelingsstadium op het gebied van de synthetische biologie is aanzienlijke vooruitgang geboekt bij het ontwerpen van biologische onderdelen en het samenvoegen ervan tot complexe genetische schakelaars om basisfunctionaliteiten te bereiken. Deze schakelaars zijn gebruikt om proof-of-principle systemen te bouwen met veelbelovende resultaten in industriële en medische toepassingen. Echter zijn de meeste huidige bacteriële schakelaars cis-gecodeerd, waarbij de veelzijdigheid met betrekking tot ingangssignalen welke verwerkt kunnen worden ontbreekt. De opname van cis-gecodeerde schakelaars op het leider-mRNA kan de vouwing van het daarna volgende mRNA verstoren en vereist genetische modificatie vooraf het coderende deel van het doel-gen. Als gevolg van genetische modificatie in dit vooraf liggende mRNA gebied, kunnen bacteriën enkele regulerende genetische elementen verliezen welke hier aanwezig. Om dit probleem op te lossen, presenteren we in hoofdstuk 2 veelzijdige en modulaire trans-gecodeerde RNA-schakelaars welke gebaseerd zijn op tRNA-mimiserende structuren (TMS). Deze schakelaars bieden een hoge mate van vrijheid voor herinrichting en kunnen dus worden ontworpen om een breed scala aan inputs te accepteren, waaronder RNA, kleine moleculen en eiwitten. Omdat ze kunnen worden geproduceerd uit een
trans-regio van RNA, hoeven deze schakelaars geen stroomopwaarts gelegen
genetische sequenties te wijzigen en verminderd daardoor het probleem van het verliezen van noodzakelijke regulerende elementen. Deze krachtige benadering maakt controle over de eiwitvertaling mogelijk van plasmide- en genomisch-DNA.
Nadat het sterke potentieel van de TMS-schakelaar bij het beheersen van genexpressie door veelzijdige stimuli was gerealiseerd, hebben we ons systeem verbeterd om de op RNA-gebaseerde TMS-schakelaar op een meer controleerbare manier te implementeren. In dit opzicht beschouwden we licht als een cruciaal hulpmiddel dat gebruikt kan worden als een ingangssignaal om de uitvoer van de TMS-schakelaar fijn af te stemmen. Het beheersen van genexpressie door licht met spatiotemporele resolutie maakt het niet alleen mogelijk om fundamentele biologische processen te begrijpen en te manipuleren, maar stimuleert ook de ontwikkeling van nieuwe therapeutische strategieën. In aanvulling op het benutten van optogenetische tools, steunen fotochemische strategieën meestal op de opname van foto-responsieve kleine moleculen in de corresponderende bio-macromoleculaire systemen. Daarom is in het algemeen een grote synthetische inspanning vereist en blijft de omkeerbare omschakeling
174
van genexpressie binnen een enkel systeem een uitdaging. Om deze problemen op te lossen, hebben we in hoofdstuk 3 de tRNA-mimiserende structuur (TMS) onder controle van kleine foto-schakelbare signaalmoleculen ontwikkeld. De signaalmoleculen bestaan uit twee aminoglycosidemoleculen welke via een azobenzeeneenheid zijn verbonden. De lichtgevoeligheid van ons systeem is afkomstig van de foto-schakelbare niet-covalente interacties tussen het signaalmolecuul en de TMS-schakelaar, wat leidt tot de demonstratie van fotochemisch gecontroleerde expressie van twee verschillende genen. Dit modulaire ontwerp zal een krachtig platform bieden voor het beheersen van de expressie van andere functionele eiwitten met een hoge spatiotemporele resolutie, waarbij licht als stimulus wordt gebruikt.
Tot dusverre zijn we erin geslaagd de expressie van een doel-gen te manipuleren met een op RNA gebaseerde TMS-schakelaar, en vervolgens vroegen we ons af of we de DNA-tegenhanger van onze op RNA gebaseerde schakelaar konden produceren. Het idee dat onze motivatie drijft om een ssDNA-schakelaar te ontwerpen, is dat de meest gerapporteerde bacteriële schakelaars RNA-structuren zijn, welke niet kunnen reageren op inputs die uitsluitend binden aan ssDNA. In
hoofdstuk 4 hebben we een trans-gecodeerde ssDNA-schakelaar geïntroduceerd
door simpelweg de op RNA gebaseerde TMS-schakelaar om te zetten in zijn deoxynucleotide-analoog. Door de structuur van de omschakeling naar DNA uit te breiden, kan het grote aantal op DNA gebaseerde aptameren als herkenningseenheid in de ssDNA-schakelaar worden benut. Voor zover wij weten, is dit het eerste rapport over intracellulaire ssDNA-schakelaars voor het regelen van genexpressie welke kunnen reageren op veelzijdige stimuli. De ssDNA-schakelaar is geconstrueerd met behulp van het door revere transcriptase (RT) ssDNA-producerende Ec86-retron. Deze ssDNA-schakelaar is zeer efficiënt met tot 150-voudige verandering in de genexpressieniveaus tussen de AAN- en UIT-toestanden. Net als de op RNA gebaseerde TMS-schakelaar, biedt de ssDNA-schakelaar verschillende soorten inputs (RNA en kleine moleculen) met meerdere armen in de structuur die flexibiliteit bieden om verschillende functionele onderdelen te coderen.
Naast het beheersen van genexpressie, hebben we ons ook gericht op het implementeren van onze op RNA gebaseerde tool om andere biologische functies te onderzoeken. Op fluorescentie gebaseerde sondes geven een uniek inzicht in de normaal gesproken obscure innerlijke machinerie van de levende cel. Het ontwerp van sondes die selectief zijn voor nieuwe analyten is echter notoir
175
uitdagend, vooral wanneer substraatbindende eiwitten niet beschikbaar zijn. In
hoofdstuk 5 presenteren we een volledig genetisch gecodeerde RNA-gebaseerde
sensor met een modulaire ontwerpfunctie welke een eenvoudige herbestemming voor nieuwe analyten mogelijk maakt. We verkregen een nieuwe aptameer voor GFP va SELEX rechtstreeks in Escherichia coli, die we conjugeerden met een tweede aptameer om een genetisch gecodeerde sensor te verkrijgen. De sensor heeft geen exogene liganden nodig en is in plaats daarvan gebaseerd op fluorescentie zodra binding van het analyt GFP vrijgeeft. We valideerden de methode tegen biologisch relevante kleine moleculen, metaalionen en eiwitten in
E. coli door eenvoudige RNA-aptameervervanging. Deze methode heeft het
potentieel om een standaard methode te zijn voor de detectie van analyten in cellen.
