Werkdocument
Ministerie van Verkeer en Waterstaat
Rijksinstituut voor Kust en Zee/RIKZ
Partitie-gecontroleerde toediening van hydrofobe stoffen aan
bioassays
Terugblik op het onderzoek van de afgelopen jaren, beschrijving resultaten in 2004 en vooruitblik op het onderzoek in 2005
December 2004
Werkdocument
Ministerie van Verkeer en Waterstaat
Rijksinstituut voor Kust en Zee/RIKZ
Partitie-gecontroleerde toediening van hydrofobe stoffen aan bioassays
Terugblik op het onderzoek van de afgelopen jaren, beschrijving resultaten in 2004 en vooruitblik op het onderzoek in 2005
December 2004
J.E. Åkerman
Werkdocument RIKZ/AB/2004.615W
Inhoudsopgave
. . . .
1 INLEIDING...4
2 ACHTERGROND METHODE ...5
3 ONDERZOEK TOT NU TOE ...7
3.1 BELADING VAN FILMS...7
3.2 SILICONEN KITS...7
3.3 TESTSYSTEMEN...8
3.4 PARTITIE-COËFFICIENT...8
3.5 OPTIMALE FILMVOLUME...9
3.6 LEEFTIJD VAN DE FILM...9
3.7 DESORPTIE-KINETIEK...9
3.8 TOEPASSING IN BIOASSAYS...10
3.8.1 Mutatox®...10
3.8.2 Microtox®...10
3.8.3 Solea solea ...11
4 VERVOLGONDERZOEK...12
4.1 BELADING FILMS...12
4.2 SILICONEN KITS EN OPLOSMIDDELEN...12
4.3 TYPE MICROTITERPLAAT? ...13
4.4 DESORPTIE-KINETIEK...16
4.5 PARTITIE-COËFFICIENT...17
4.6 TOEPASSING IN BIOASSAYS...19
5 CONCLUSIES...20
LITERATUUR...22
1 Inleiding
. . . .
De afgelopen jaren is er, met een lange tussenpoos van twee jaar, bij het Rijksinstituut voor Kust en Zee (RIKZ) gewerkt aan de toepassing van een polymere film voor de gecontroleerde toediening van medium- en apolaire contaminanten aan waterige testmedia van bioassays (Åkerman, 2000a/b;
Brown e.a., 2001; Rijkens, 2004). Het doel van de toepassing van de film is het zorg dragen voor een bekende, constante opgeloste concentratie van
contaminanten in het testmedium, ongeacht de grootte en aard van de processen die deze concentratie kunnen verlagen (b.v. verdamping, sorptie en afbraak). De ontwikkeling van deze nieuwe toedieningsmethode door het RIKZ is gedeeltelijk gebeurd in samenwerking met Queen’s University (Kingston, Canada).
Dit werkdocument blikt terug op het onderzoek uitgevoerd in 1999-2001 (Klamer e.a., 1999; Åkerman, 2000a/b; Brown e.a., 2001), beschrijft kort de resultaten geboekt na de herstart van het onderzoek in 2004, maar blikt vooral vooruit op de werkzaamheden in 2005.
Leeswijzer:
In hoofdstuk 2 wordt de theoretische achtergrond van de toedienings-methode beschreven. De verschillende parameters bepalend voor het functioneren van de methode die in de periode 1999-2001 (en 2004) zijn onderzocht worden beschreven in hoofdstuk 3. Door een aantal veranderingen in de methode, zoals een nieuw type siliconenkit en andere testsystemen, is het nodig een aantal van de experimenten ter controle te herhalen. De methode dient hierna verder ontwikkeld te worden, waarbij twee trajecten worden gevolgd. Namelijk de ontwikkeling van de methode met siliconenfilms in (zie verder
projectplannen ‘Effectbeoordeling’ en ‘Modelkey’):
x (macor) microtiterplaten voor toediening aan in vitro bioassays zoals de Mutatox® assay, en;
x glazen flessen voor toediening aan in vivo bioassays zoals de viseiertest.
Het vervolgonderzoek, gericht op de methode voor toediening in
microtiterplaten, staat beschreven in hoofdstuk 4. Hierin worden de eerste resultaten uit okt.-dec. 2004 behandeld en verder bevat het een vooruitblik (voorbereiding) op het verdere onderzoek in 2005. Begin volgend jaar volgt een werkdocument waarin het onderzoek met betrekking tot de toediening in glazen flessen wordt beschreven.
2 Achtergrond methode
Het ontwikkelde systeem bestaat uit een film van polydimethylsiloxane, oftewel PDMS. Deze film kan geladen worden met een teststof en kan in een
testsysteem toegepast worden. Na toevoeging van een waterig testmedium ontstaat er een evenwicht tussen de concentratie teststof in de film en in het medium volgens een film:vloeistof partitie-coëfficient (Kfw):
(1)
C
water film
fw
C
K
Verlies aan teststof in de vloeibare fase wordt gecompenseerd vanuit de film.
Indien de Kfw en de concentratie in de film bekend is, dan kan de concentratie in oplossing berekend worden. Hiermee kan een gewenste concentratiereeks in het testmedium van tevoren berekend worden.
De partitie-coëfficienten film:water van zuivere stoffen worden bepaald bij verschillende concentraties door een concentratiereeks te maken, waarbij de hoogste concentratie net onder de wateroplosbaarheid (Sw) ligt. Van tevoren worden de concentraties stockoplossing bepaald door terug te rekenen vanuit de gewenste concentratie in het diluent. Dit gebeurt als volgt:
(2)
(3)
fw film
C u
water
C K
C u
stock film film
stock
V
C V
De Kfw-waarde is afkomstig uit een theoretische berekening, waarbij gebruik wordt gemaakt van een lineair verband tussen log Kow en log Kfw (R2 = 0,933;
Brown e.a., 2001):
log
(4)0
log K
fw, 77 u K
ow0 , 63
Met de geschatte Kfw-waarde en de gewenste water concentratie (Cwater) als bekenden, kan de gewenste concentratie in de film (Cfilm) berekend worden.
Vervolgens kan met deze waarde, het volume van de film (Vfilm) en het toegevoegde volume van de stockoplossing (Vstock) berekend worden wat de concentratie van de stockoplossing (Cstock) moet zijn.
Met partitie-experimenten kan de werkelijke Kfw-waarde van de zuivere stof bepaald worden door de concentraties van de stof in de film en de waterfase te bepalen (Åkerman, 2000a/b).
3 Onderzoek tot nu toe
Om de filmmethode in de praktijk toe te kunnen passen heeft er in Nederland en Canada onderzoek plaatsgevonden waarbij de methode is uitgewerkt en (gedeeltelijk) is gevalideerd (Klamer e.a., 1999; Åkerman, 2000; Åkerman, 2000; Brown e.a., 2001; Rijkens, 2004). Hierbij is het functioneren van de film onder invloed van verschillende randvoorwaarden zoals temperatuur,
filmvolume, verschillende testsystemen en leeftijd van de film onderzocht.
Aangezien de resultaten van de verschillende onderzoeken verspreid zijn over verschillende rapportages en artikelen volgt nu een inventarisatie van alle resultaten, aangevuld met mogelijke verbeteringen van de methode.
3.1 Belading van films
De film kan op twee manieren geladen worden, namelijk vóór, pre-loading, of ná, post-loading, de polymerisatie van de PDMS-precursor (PDMS opgelost in hexaan). Bij pre-loading wordt de teststof, opgelost in hexaan, toegevoegd aan de hexaan-oplossing van de PDMS-precursor. Bij het indampen wordt een PDMS-film gevormd, waarin de teststof homogeen verdeeld is. De post- loading methode bestaat uit het maken van lege films, waarna de films geladen worden door het toevoegen van teststof, opgelost in hexaan. Als gevolg hiervan zwelt de film en wordt de teststof opgenomen in de filmmatrix. Bij zowel pre-loading als post-loading methode wordt de film beladen met teststof of extract van een milieumonster.
3.2 Siliconen kits
De gebruikte PDMS-kits, Silicone en Silicone II kit (General Electric, Waterford, VS), zijn commercieel verkrijgbare siliconen kits die gebruikt worden voor sanitaire afdichtingen. Dit soort siliconenkits zijn schimmelbestendig (bevatten fungiciden). Daarom zijn ze van tevoren getest met de acute toxiciteitstest Microtox. De Silicone kit vertoonde hierbij geen toxische respons, maar de Silicone II kit wel, waardoor er alleen experimenten uitgevoerd zijn met de eerste kit.
Aangezien het de bedoeling is om in de toekomst deze nieuwe
toedieningsmethode bij verscheidene bioassays (met andere testorganismen) toe te passen is het echter wenselijk om over te stappen op kits die geen fungicide bevatten. Siliconen kits die toegepast worden voor het afdichten van aquaria zijn hier een goed voorbeeld van. Een type, de Bison Siliconenkit Glas, vertoont in de Microtox geen toxiciteit. De kit geeft echter na polymerisatie witachtige vlekken in de film en is daarom niet geschikt voor toepassingen, waarbij doorzicht gemeten wordt, zoals bij de Mutatoxassay (absorptie bij 665 nm wordt gemeten om groei van bacterie te bepalen). Een geschikte kit lijkt nu gevonden te zijn met de SilasticMedical Adhesive Silicone (Type A) (Dow Corning, Midland, VS). Dit product wordt voornamelijk gebruikt om siliconen elastomeren aan elkaar te kitten voor medisch gebruik. De verwachting is dat deze kit heldere films geeft en niet toxisch zal zijn voor testorganismen. Dit dient echter gecontroleerd te worden.
3.3 Testsystemen
Tot op het heden zijn de meeste experimenten uitgevoerd in glazen cuvetten (3 ml) of kunststoffen (polystyreen) 96-wells microtiterplaten. Tijdens de
experimenten in de microtiterplaten was er sprake van verlies aan teststof, vermoedelijk veroorzaakt door irreversibele adsorptie van de teststof aan de kunststoffen plaat (Brown e.a., 2001). In de glazen cuvetten is dit verlies aan teststof niet waargenomen.
Het verlies in de wells is deels te voorkomen door over te stappen op een grotere film die de gehele bodem en wand bedekt, maar er is nog steeds sprake van verlies in vergelijking met experimenten in glazen cuvetten. Verder
betekend het overstappen op een groter volume film dat de film met een groter volume teststofoplossing beladen dient te worden. Dit kan in het geval van milieuextracten, die vaak in kleine volumes aangeleverd worden, een probleem zijn. Een groter filmvolume betekent verder dat het maken van de films langer duurt.
Een ander probleem met betrekking tot de filmexperimenten in kunststoffen microtiterplaten is de aantasting van de plaat door hexaan. Dit verhoogt waarschijnlijk het verlies aan teststof tijdens de belading van de film. Verder veroorzaakt het verkleuring van de kleurloze, heldere bodem van de plaat problemen bij absorptiemetingen zoals tijdens de Mutatox® assay (zie §2.8).
Aangezien (in vitro) bioassays vaak uitgevoerd worden in microtiterplaten is het wenselijk om een oplossing te vinden voor dit probleem. Daarom is het overstappen op microtiterplaten, gemaakt van glas of een ander
oplosmiddelbestendig materiaal, een goede optie. De oplossing hiervoor is mogelijk microtiterplaten gemaakt van macor (wit), met een heldere glazen bodem. Op het moment zijn deze platen niet commercieel beschikbaar, maar één exemplaar, gemaakt door een glasblazerij in Petten, wordt op het moment gebruikt voor testen.
Vele andere bioassays (in vivo’s) worden juist in grotere testsystemen uitgevoerd zoals glazen flessen. Op het moment lopen er daarom ook
experimenten voor de optimalisatie van de filmmethode in glazen flessen (100 ml).
3.4 Partitie-coëfficient Zuivere verbindingen
In experimenten met de pre-loading en post-loading methode zijn partitie- coëfficienten film:diluent1 (Kfw of Kfd) succesvol bepaald van meerdere PAKs (Åkerman, 2000a/b; Brown e.a., 2001). Met de post-loading methode zijn er verder Kfw-experimenten uitgevoerd met chloorbenzenen, maar deze bleken te vluchtig te zijn, met als gevolg een groot verlies aan teststof tijdens de belading van de film.
Met meer Kfw-bepalingen in de toekomst zal het lineaire verband tussen log Kfw en log Kow (Formule 4) nog exacter weergegeven kunnen worden.
1 Diluent: water met 2% NaCl (Azur Environmental, Carlsbad, VS)
Mengsels en extracten
De post-loading methode is verder met wisselend succes toegepast bij de Kfw- bepaling van mengsels van PAKs (Åkerman, 2000b; Brown e.a., 2001) en sediment-extracten (Åkerman, 2000b) .
In de experimenten met PAK-mengsels zijn Kfw bepalingen succesvol verlopen.
Dit in tegenstelling tot de experimenten met sedimentextracten. Hiervan was de samenstelling en de gehaltes van stoffen (voornamelijk PAKs) bekend, waardoor er een voorspelling gemaakt kon worden met betrekking tot de gehaltes in het diluent. Het is echter niet gelukt om verwachte meetbare concentraties van bekende PAKs in het diluent te bereiken. Vermoedelijk wordt het partitie-proces verstoord door hoogmoleculair materiaal in het extract dat het oppervlak van de film bedekt.
3.5 Optimale filmvolume
Voor de bepaling van het optimale filmvolume (post-loading) zijn de resultaten van Kfw-bepalingen met verschillende filmvolumes (1,3-5,0 µl) met elkaar vergeleken (Åkerman, 2000b). Deze experimenten zijn uitgevoerd in glazen cuvetten. Relatief gezien gaven alle films een hoge concentratie teststof in het diluent. Om uitputting van de film te voorkomen is er gekozen voor een hoog filmvolume van 5,0 µl. Voor microtiterplaten kan het optimale filmvolume anders zijn, vanwege de veel geringere oppervlakte in de wells ten opzichte van de cuvetten. De volume-experimenten dienen daarom voor de microtiterplaat herhaald te worden.
3.6 Leeftijd van de film
De “leeftijd” van de film blijkt invloed te hebben op de Kfw-waarde (Åkerman, 2000b). Met de leeftijd van de film wordt de tijd bedoelt tussen het maken en het beladen van de film. Er blijkt sprake te zijn van een “rijping” van de film, waardoor de Kfw-waarde na ongeveer vier dagen stabiel wordt. Dit betekent dat er vier dagen gewacht wordt voordat de film beladen wordt. Voor de nieuwe films gemaakt met de Silastic Medical Adhesive Silicone kit (zie §2.2) is dit niet gecontroleerd.
3.7 Desorptie-kinetiek
Het evenwicht tussen de film en het water (diluent) met betrekking tot de teststof wordt niet momentaan bereikt. De snelheid van evenwichtsinstelling is afhankelijk van de desorptiesnelheid waarmee de teststof vanuit de film naar het diluent diffundeert. In pre-loading experimenten in glazen cuvetten werd voor fenantreen (PAK) een evenwicht bereikt binnen 6 à 7 minuten schudden bij 700-900 rpm (Åkerman, 2000). Met de post-loading methode werd voor o.a. fenantreen en antraceen onder dezelfde omstandigheden een evenwicht bereikt binnen 10 minuten. De desorptiesnelheid wordt beïnvloed door de temperatuur. Het is waarschijnlijk dat de desorptiesnelheid in de wells van microtiterplaten langzamer is dan in cuvetten, vanwege de kleinere oppervlakte. De desorptie-kinetiek bepaling dient daarom voor de microtiterplaten herhaald te worden.
3.8 Toepassing in bioassays
Het uiteindelijke doel van de filmmethode is gecontroleerde toediening van stoffen, zij het zuivere stoffen (of mengsels hiervan) of stoffen afkomstig uit milieumonsters zoals sedimentextracten, aan bioassays. Hoewel de methode nog in ontwikkeling is, zijn er een aantal experimenten uitgevoerd waarbij (zuivere) stoffen toegevoegd zijn aan een drietal bioassays. Dit zijn de in vivo bioassays Solea solea (met tong eieren) en Microtox®, en de in vitro bioassay Mutatox® (resp. Rijkens, 2004; Åkerman, 2000a/b; Klamer e.a., 1999). De resultaten hiervan zullen nu, beginnend met de Mutatox®, kort toegelicht worden.
3.8.1 Mutatox®
De Mutatox®assay (SDI, Hook, Hampshire, GB) wordt gebruikt voor de toetsing op genotoxische verbindingen. Dit zijn stoffen die schadelijk zijn voor het erfelijk materiaal, zoals carcinogene stoffen. In de Mutatox® test worden verder stoffen meegenomen waaruit genotoxische afbraakproducten ontstaan (indirecte genotoxiciteit door metabolieten). De assay maakt gebruik van een (genetisch gemodificeerde) donkere variant van de lichtgevende bacterie Vibrio fischeri. Onder invloed van genotoxische verbindingen kan het lichtgevende vermogen van de bacterie worden hersteld. De toename van de lichtintensiteit, en de testconcentratie waarbij dit gebeurt, is een maat voor de genotoxiciteit.
De Mutatox® is de eerste bioassay, waarbij de filmmethode toegepast is (Klamer e.a., 1999). Twee polycyclische aromatische koolwaterstoffen (PAKs), benzo(a)pyreen (BaP) en acridine, werden in concentraties tot aan de wateroplosbaarheid (Sw) van de stoffen aan de assay toegediend. De experimenten werden uitgevoerd in polystyrene microtiterplaten. In
tegenstelling tot eerdere Mutatox®experimenten waarbij acridine en BaP met de conventionele methode toegediend zijn (directe toediening aan de waterfase) en allebei een genotoxische respons geven, vertoonde alleen acridine een respons. Deze respons was zelf beduidend hoger dan verwacht.
Waarschijnlijk is dit te danken aan de gecontroleerde toediening met de film, die voor een continue aanlevering van acridine aan de waterfase zorgt.
Hierdoor wordt verlies aan acridine in het water, zoals adsorptie aan de
kunststoffen wand van de microtiterplaat, gecompenseerd. BaP vertoonde zoals verwacht geen genotoxische respons, omdat de PAK met de conventionele test een respons geeft die vele malen hoger ligt dan de wateroplosbaarheid (ongeveer 1.000-20.000 u Sw). Kortom, de toxische respons in de
conventionele test wordt niet (geheel) veroorzaakt door de fractie aan opgelost BaP. Mogelijk spelen BaP kristallen een rol.
3.8.2 Microtox®
De acute toxiciteitstest Microtox® (SDI, Hook, Hampshire, GB) is een breedspectrumassay. Dat wil zeggen dat het reageert op acute celtoxische effecten (zoals sterfte), die door een groot aantal stoffen kunnen worden veroorzaakt. De test maakt gebruik van dezelfde bacterie als de Mutatox® assay, Vibrio fischeri, maar dan wel van de oorspronkelijke, lichtgevende variant. Onder invloed van schadelijke stoffen sterven bacteriën en neemt de lichtintensiteit af. Als een maat voor de toxiciteit geldt de testconcentratie waarbij de lichtintensiteit met 50% afneemt (de EC50, Effect Concentratie).
De Microtox®is de tweede bioassay, waarbij de filmmethode toegepast is (Åkerman, 2000a/b). Drie PAKs, antraceen, fenantreen en fluoreen werden hierbij toegediend aan de assay. Hiervan vertoonden de laatste twee stoffen toxiciteit in de assay. Dit was ook te verwachten aangezien in eerder onderzoek gerapporteerde EC50’s, waarbij de stoffen volgens de conventionele methode toegediend zijn, van fenantreen en fluoreen onder de wateroplosbaarheid lagen, terwijl de EC50 voor antraceen boven de wateroplosbaarheid lag.
Met fenantreen en fluoreen is ook een experiment succesvol uitgevoerd, waarbij een (equitoxisch) mengsel van de twee stoffen werd toegediend.
3.8.3 Solea solea
De Solea solea (tong) is een assay in ontwikkeling bij het Nederlands Instituut voor Visserij Onderzoek(RIVO), waarbij gekeken wordt naar het effect (acute toxiciteit) van stoffen op tong eieren. In 2004 is met deze assay een
verkennend onderzoek uitgevoerd, waarbij twee PAKs, fenantreen en benzo(h)quinoline, met de filmmethode toegediend zijn aan de assay. De experimenten zijn uitgevoerd in glazen flesjes (100 ml).
De films zijn gemaakt door 4 ml PDMS-oplossing (12 mg PDMS-precursor in 1 ml pentaan) toe te voegen aan het flesje. Deze werd vervolgens op een rollerbank met hoge snelheid rond gedraaid, zodat de film gelijkmatig over de fles verdeeld werd. Na verdamping van het pentaan blijft een film over met een volume van 100 µl. Belading van de film gebeurd op een vergelijkbare manier als het maken van de film.
Bepaling van het partitie-coëfficient is eerst uitgevoerd zonder viseieren in de waterfase. Het evenwicht tussen de film en het water werd voor beide stoffen bereikt na 77 minuten, wat beduidend langzamer is dan in de cuvetten (§3.7).
Dit komt hoogst waarschijnlijk doordat de flessen tijdens het partionerings- proces beduidend langzamer geschud worden dan de cuvetten (resp. 13 en 700-900 rpm). Door de gevoeligheid van de eitjes is het niet mogelijk om bij hoge snelheden te schudden. Bij de partitie-coëfficient bepalingen met viseitjes was er na twee uur schudden nog geen evenwicht bereikt. Mogelijk speelt opname door de eieren zelf hierbij een rol, met name door de olieachtige substantie aanwezig in de eieren, waarvoor hydrofobe stoffen zoals PAKs een hoge affiniteit hebben. Dit dient onderzocht te worden. In januari 2005 zal hiervoor een onderzoeksvoorstel geschreven worden.
4 Vervolgonderzoek
. . . .
Meerdere parameters met betrekking tot de toedieningsmethode zijn reeds onderzocht. Echter, door het overstappen naar een nieuw type siliconenkit (zie
§2.2) en het toepassen van de methode in verschillende testsystemen (zie
§2.3), dienen deze parameters (gedeeltelijk) opnieuw vastgesteld te worden.
De te nemen stappen, waarmee in de herfst van 2004 begonnen is, zullen nu beschreven worden.
4.1 Belading films
Zowel de pre-loading als de post-loading methode geven goede resultaten in partitie-experimenten (Åkerman, 2000a/b). Een groot voordeel van de eerste methode is dat het maken en beladen van de film in één stap gebeurd. Met de post-loadingmethode is het echter mogelijk om een grote hoeveelheid lege films te maken en de benodigde hoeveelheid films een dag voor het experiment te beladen met de desbetreffende stof of extract. Dit geeft, ten opzichte van de pre-loading methode, meer flexibiliteit in het onderzoek. Daarom is er voor de komende experimenten gekozen voor de post-loading methode. Een langere houdbaarheid van de films is hierbij wel een vereiste, wat gecontroleerd dient te worden.
Werkzaamheden
De houdbaarheid van de film (‘aging’) is te onderzoeken door:
1. In alle wells van de microtiterplaat (12 kolommen, 96 wells) films te maken.
2. Vervolgens in twee kolommen per week een partitie- experiment uit te voeren na belading met een modelstof (fenantreen), waarbij het partitie-coëfficient (Kfw) van de stof bepaald wordt. Het experiment wordt dus in tweevoud uitgevoerd gedurende 6 weken.
3. Na afloop (6 weken) de bepaalde partitie-coëfficienten per week met elkaar te vergelijken ter bepaling van de reproduceerbaarheid van de films.
Indien de herhaalbaarheid goed is kan aangenomen worden dat de films in ieder geval gedurende 6 weken goed blijven.
4.2 Siliconen kits en oplosmiddelen
Voor het maken van de films wordt als PDMS-precursor Silastic Medical Adhesive Silicone (Type A)kit gebruikt (zie §2.2). Deze kit geeft, opgelost in hexaan of pentaan, mooie egale films (Smedes en van Vliet, 2004). Bij de toepassing van de coating procedure bleek bij gebruik van hexaan, dat het oplosmiddel erg langzaam verdampt en dat de polymerisatie reeds startte voordat de verdamping een feit was. Het gevolg was een ruwe film. Dit trad niet op bij het gebruik van pentaan als oplosmiddel, omdat pentaan zeer snel
verdampt (< 2 min.). Het resultaat was een opale, egale film. Overigens kan het probleem van de ruwe film bij het gebruik van hexaan voorkomen worden, indien er tijdens de indamping over de film stikstof wordt geblazen. Het te vroeg starten van het polymerisatie proces wordt zo voorkomen. Zo werden egale films verkregen, maar misschien wel belangrijker voor de toepassing in microtiterplaten, de films zijn kleurloos en helder.
Uit de experimenten van Smedes en van Vliet blijkt dat zowel pentaan als hexaan, mits er tijdens indamping afgeblazen wordt met stikstof, geschikt zijn als oplosmiddel voor de PDMS-precursor. Voor het gebruik in microtiterplaten, met name in experimenten waarbij absorptie gemeten wordt zoals in de Mutatox®assay, zijn kleurloze, doorzichtige films een noodzaak. Daarom gaat de eerste keuze uit naar hexaan als oplosmiddel. Hierbij dient echter opgemerkt te worden dat de experimenten van Smedes en van Vliet uitgevoerd zijn in glazen flessen (300 ml), waarvan het volume 1000 maal groter is dan dat van een well in de microtiterplaat (300 µl). Het verschil in volume en dimensie van de testsystemen kan van invloed zijn op het droogproces van de film.
Werkzaamheden
Om een keuze te kunnen maken tussen de oplosmiddelen (pentaan, hexaan of eventueel een ander oplosmiddel) dienen de volgende werkzaamheden uitgevoerd te worden:
1. PDMS-oplossing maken in de verschillende oplosmiddelen (minstens in duplo, twee of meer kolommen per type oplosmiddel). Indien mogelijk de wells afblazen met stikstof tijdens de indamping van de films.
2. De verschillende films beladen met een concentratiereeks van de modelstof (fenantreen opgelost in het desbetreffende oplosmiddel).
3. Doorzicht en kleur bepalen van de films.
4. Kfw bepalen van de modelstof in de verschillende films.
5. Resultaten van de doorzicht-, kleur-, en Kfw-bepaling tussen de verschillende typen film vergelijken.
De resultaten van de eerste experimenten uitgevoerd in oktober/november 2004 met films gemaakt met hexaan of pentaan als oplosmiddel, gaven vergelijkbare Kfw’s. De ‘hexaan-films’ waren wel helderder dan de ‘pentaan- films’. Hieruit kunnen echter geen conclusies getrokken worden, omdat de macor microtiterplaat gebruikt tijdens het experiment niet geheel schoon was.
Bij het meten van fenantreen uit de wells m.b.v. HPLC-FLD bleek namelijk dat er ook andere stoffen (in lage concentraties) aanwezigen waren.
Parallel aan de experimenten in de well zijn ook partitie-experimenten uitgevoerd in glazen cuvetten (zelfde type als gebruikt door Åkerman, 2000a/b). Ook hier gaven de films gemaakt met hexaan of pentaan vergelijkbare Kfw’s en was de ‘hexaan-film’ helderder.
4.3 Type microtiterplaat?
Tot op heden zijn de filmexperimenten in microtiterplaten uitgevoerd in platen gemaakt van polystyreen of macor. Er is echter een belangrijk verschil tussen deze experimenten, namelijk het gebruikte oplosmiddel. Voor de experimenten in de polystyrene platen was dit methanol, terwijl in de macor plaat hexaan of
pentaan is gebruikt. De polystyrene platen zijn wel bestand tegen methanol, maar niet tegen hexaan en waarschijnlijk ook niet tegen pentaan. Dit laatste dient echter nog getest te worden. Het is mogelijk dat pentaan geen probleem vormt omdat het snel verdampt en de tijd voor aantasting van de plaat te kort is.
Het voordeel van de macor plaat ten opzichte van kunststoffen platen is dat de adsorptie van (hydrofobe) stoffen beduidend lager is en dat het beter bestendig is tegen verschillende oplosmiddelen. Een groot nadeel van macor is dat het een relatief duur materiaal betreft, waardoor hergebruik van de plaat noodzakelijk is. Dit betekent dat de plaat gereinigd dient te worden. Mogelijk dat de film herbruikbaar is, maar ook deze zal na langer gebruik vervangen moeten kunnen worden. Vooral bij de belading van films met milieuextracten zal het schoonmaken van de film moeizaam verlopen.
Op het moment is het, op basis van eerdere resultaten, moeilijk een keuze te maken tussen de verschillende materialen. De keuze is eigenlijk afhankelijk van een aantal eigenschappen van de platen die eerst onderzocht dienen te worden. De vragen ten opzichte van deze eigenschappen zijn:
Macor microtiterplaat: Polystyrene microtiterplaat:
1. Kan de film (in de plaat) na gebruik schoon gemaakt worden (verwijdering van contaminanten in de film) zodat het geschikt is voor hergebruik? Welke stappen dienen hiervoor genomen te worden?
2. Kan de plaat in zijn geheel na gebruik schoon gemaakt worden (verwijdering van film en contaminanten) zodat het geschikt is voor hergebruik?
Welke stappen dienen hiervoor genomen te worden?
1. Tast pentaan, of een ander geschikt oplosmiddel waarin PDMS goed in oplost, de plaat aan gedurende de indamping van de film?
2. Is het verlies van opgelost teststof aan de plaat (adsorptie) een constante factor dat gecompenseerd kan worden door desorptie vanuit de film?
Macor microtiterplaat
In experimenten uitgevoerd in oktober-december 2004 bleek het mogelijk om de film uit de plaat te verwijderen. Dit gebeurde als volgt:
1. Aan elke well is ± 100 µl Silstrip (Nederlandsche Benzol
Maatschappij B.V., Dordrecht) toegevoegd. Dit is een hoogwaardig reinigingsmiddel voor het verwijderen van siliconen.
2. Na ongeveer 20 min. wordt elke well met een watten staafje geboend, waarna de Silstrip verwijderd wordt.
3. Vervolgens wordt de plaat met aceton en daarna milliQ gewassen.
4. Herhaling van stap 1 en 2.
5. De plaat wordt nogmaals met aceton gewassen en in de zuurkast (afzuiging aan) gezet om te drogen.
6. Nadat de plaat gedroogd is wordt gecontroleerd of alle wells schoon zijn (sporen van film etc.). Indien nodig worden de bovenstaande stappen herhaald.
Met de bovenstaande methode is het mogelijk om de film uit de plaat te verwijderen. Het is echter well een tijdrovend proces, vooral als het na elk experiment herhaald moet worden. Daarom is hergebruik (meerdere keren) van de film wenselijk. Dit is waarschijnlijk mogelijk indien de film, na gebruik, één of enkele keren gewassen wordt met een oplosmiddel zoals methanol, ethanol of ethyl acetaat. Het succes van de methode kan getoetst worden door na partitie-experimenten met b.v. fenantreen de film een drietal keer te wassen en na elke wasbeurt de concentratie fenantreen in het oplosmiddel te meten met HPLC/FLD. Indien succesvol, kan het experiment herhaald worden met een aantal andere stoffen, en met name na experimenten met milieuextracten.
Polystyrene microtiterplaat
De bestendigheid van polystyrene microtiterplaten kan getoetst worden door verschillende oplosmiddelen toe te voegen aan de wells in de plaat. Het volgende experiment wordt voorgesteld:
1. Aan ‘kolom 1’ wordt 200 µl/well van oplosmiddel A toegevoegd, aan
‘kolom 2’ 300 µl/well van oplosmiddel B, enz.
2. De plaat wordt op een plaatschudder, met een langzame
rotatiesnelheid (200-300 rpm) gedurende 8 uur te schudden gezet bij 20 qC.
3. Na elk uur wordt per kolom (per oplosmiddel) een well geleegd en vervolgens worden de lege wells onder een binoculair bekeken of ze beschadigd zijn.
Indien uit het bovenstaande experiment blijkt dat er een geschikt oplosmiddel bestaat voor het maken van PDMS-films in polystyrene microtiterplaten, kan onderzocht worden of de capaciteit van de film groot genoeg is om verlies aan opgelost teststof in de waterfase door adsorptie aan de plaat te compenseren.
Dit kan met het volgende experiment, waarbij verschillende filmvolumes van b.v. 1,3 t/m 20 µl meegenomen worden:
1. In microtiterplaat worden 6 verschillende filmvolumes in triplo gemaakt volgens de onderstaande indeling (met per well het filmvolume in µl). Per well wordt 300 µl PDMS-oplossing (in verschillende concentraties) toegevoegd.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A 1,3 1,3 1,3 5,0 5,0 5,0 12 12 12 20 20 20 B 1,3 1,3 1,3 5,0 5,0 5,0 12 12 12 20 20 20 C 1,3 1,3 1,3 5,0 5,0 5,0 12 12 12 20 20 20 D 1,3 1,3 1,3 5,0 5,0 5,0 12 12 12 20 20 20 E 1,3 1,3 1,3 5,0 5,0 5,0 12 12 12 20 20 20 F 1,3 1,3 1,3 5,0 5,0 5,0 12 12 12 20 20 20 G 1,3 1,3 1,3 5,0 5,0 5,0 12 12 12 20 20 20 H 1,3 1,3 1,3 5,0 5,0 5,0 12 12 12 20 20 20 De plaat wordt vervolgens op een schudder gezet en bij 25 qC rustig zwenkend (200 rpm) gedroogd.
2. Na een aantal dagen (3-4) te hebben gedroogd, worden de bovenstaande films per kolom beladen met een concentratiereeks van een teststof, b.v. fenantreen.
3. 24 uur later wordt het partitie-coëfficient van fenantreen bepaald door aan elke well 300 µl milliQ of diluent toe te voegen (zie ook
§3.1.4). Na 20 min schudden bij 700-900 rpm wordt het milliQ verwijdert om daarin de concentratie fenantreen te bepalen.
Vervolgens wordt de film in de wells tweemaal geëxtraheerd met methanol om de concentratie fenantreen in de film te bepalen.
4. Na bepaling van de concentratie fenantreen in het milliQ en de film kan Kfw berekend worden.
Met een vergelijking van de Kfw’s binnen de triplo’s (STDEV), tussen de verschillende triplo’s en mogelijk met resultaten uit experimenten in de macor microtiterplaat en/of glazen cuvetten kan waarschijnlijk een uitspraak gemaakt worden m.b.t. capaciteit van de film ten opzichte van verlies aan teststof in de waterfase in kunststoffen platen. Het is mogelijk dat de capaciteit van de films met een klein volume niet groot genoeg is, maar die van de films met een groot volume wel.
Als hetzelfde experiment uitgevoerd wordt in de macor microtiterplaat kan voor beide type platen ook een uitspraak gemaakt worden over het optimale filmvolume.
Geadviseerd wordt indien:
x de polystyrene microtiterplaat bestendig is tegen één of meer oplosmiddelen die geschikt zijn voor de filmmethode;
x en de capaciteit van de film groot genoeg is om snel het verlies aan teststof in de waterfase te compenseren;
om de polystyrene microtiterplaten te gebruiken. Deze zijn commercieel reeds makkelijk te krijgen en vormen een beduidend goedkoper alternatief dan de macor microtiterplaat.
4.4 Desorptie-kinetiek
Om de snelheid van evenwichtsinstelling van de teststof tussen de film en de vloeistof te kunnen bepalen is het nodig de concentratie van de teststof vanaf het begin van het experiment te meten in de waterfase. Met de methode zoals beschreven in §4.5 kan dit als volgt uitgevoerd worden:
1. Voer stap 1 en 2 uit zoals beschreven in §4.5.
2. Na 3 dagen worden de films per kolom beladen met een concentratiereeks van de teststof door 200 µl stockoplossing per well toe te voegen met een pipet. Voorbeeld met fenantreen:
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A Fen1 Fen1 Fen1 Fen1 Fen1 Fen1 Fen1 Fen1 Fen1 Fen1 Fen1 B Fen2 Fen2 Fen2 Fen2 Fen2 Fen2 Fen2 Fen2 Fen2 Fen2 Fen2 C Fen3 Fen3 Fen3 Fen3 Fen3 Fen3 Fen3 Fen3 Fen3 Fen3 Fen3 D Fen4 Fen4 Fen4 Fen4 Fen4 Fen4 Fen4 Fen4 Fen4 Fen4 Fen4 E Fen5 Fen5 Fen5 Fen5 Fen5 Fen5 Fen5 Fen5 Fen5 Fen5 Fen5 F Fen6 Fen6 Fen6 Fen6 Fen6 Fen6 Fen6 Fen6 Fen6 Fen6 Fen6 G Fen7 Fen7 Fen7 Fen7 Fen7 Fen7 Fen7 Fen7 Fen7 Fen7 Fen7 H Fen8 Fen8 Fen8 Fen8 Fen8 Fen8 Fen8 Fen8 Fen8 Fen8 Fen8 Onder een rustig zwenkende beweging (200 rpm) gedurende 24 uur bij 25 qC worden de films in de microtiterplaat beladen.
3. Voeg voordat het experiment begint met een (repiteer)pipet 300 µl methanol (MeOH) toe aan ambergekleurde HPLC-vials (evenveel
vials als wells met film). Bedek de vials in afwachting op het experiment met Parafilm®.
4. Voeg aan elke well 300 µl milliQ toe en laat de plaat gedurende 21 min. schudden bij 700-900 rpm (bij kamertemperatuur).
5. Pipetteer na 1 min. schudden met een multichannelpipet (snel) het milliQ in kolom 1 over naar de desbetreffende HPLC-vials. Zet de schudder hierbij weer aan na het opzuigen, maar voor injecteren in de vial zodat de plaat zoveel mogelijk staat te schudden.
6. Herhaal stap 5 na 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 en 21 min.
schudden. Zorg dat de pipettips klaar staan zodat de tips van de multichannelpipet snel verwisseld kunnen worden. Vergeet niet de pipettips na injectie in de vial een paar keer te spoelen met het MeOH-milliQ mengsel.
7. Analyseer de concentraties teststof in de waterfase (milliQ) met HPLC/FLD.
In eerdere experimenten in glazen cuvetten werd het evenwicht bereikt binnen 10 min. (Åkerman, 2000a/b). Waarschijnlijk zal het evenwicht in de
microtiterplaat wat langer op zich laten wachten, aangezien het oppervlak van de film kleiner is. Mogelijk dat daarom het experiment herhaald moet worden met een langere schudtijd.
4.5 Partitie-coëfficient
Afhankelijk van de resultaten uit de experimenten beschreven in §4.3 zal de bepaling van het partitie-coëfficient van een aantal stoffen uitgevoerd in een macor of polystyrene microtiterplaat. Voor deze bepalingen zijn een aantal modelstoffen geselecteerd die voldoen aan een aantal criteria. Het zijn stoffen die:
1. hydrofoob zijn (ClogP > 3,5);
2. goed meetbaar zijn met HPLC/FLD (fluorescerende stoffen);
3. waarvan voor minstens één stof in eerdere experimenten Kfw succesvol bepaald is;
4. en waarvan minstens één stof een hoge respons (genotoxiciteit) vertoont in de Mutatox assay.
Aan de hand van deze criteria zijn de volgende stoffen geselecteerd (voldoet aan criteria):
x Fenantreen (1, 2, 3);
x Fluoranteen (1, 2, 3);
x Phenantridine (1, 2, 4);
x Benzo(h)quinoline (1, 2, 4).
Voor de eerste twee stoffen bestaat reeds een methode om ze te meten met HPLC/FLD. Deze methodes zullen enigszins aangepast worden vanwege de nieuwe HPLC-opstelling. Dit is voor fenantreen recentelijk gebeurd. Voor de laatste twee stoffen moet nog een detectiemethode ontwikkeld worden.
In een later stadium kunnen ook Kfw-bepalingen uitgevoerd worden van stofmengels.
De partitie-coëfficient bepaling wordt, met het optimale filmvolume bepaald tijdens de experimenten beschreven in §4.3, als volgt uitgevoerd:
1. 200 µl PDMS-oplossing wordt aan de desbetreffende wells toegevoegd.
2. Onder een rustig zwenkende beweging (200 rpm) gedurende 3 dagen bij 25 qC worden de films in de microtiterplaat uitgedampt.
3. Na 3 dagen worden de films per kolom beladen met een concentratiereeks van de desbetreffende teststof door 200 µl stockoplossing per well toe te voegen met een pipet. Voorbeeld met de bovenstaande stoffen fenantreen, fluoranteen, phenantridine en benzo(h)quinoline:
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A Fen1 Fen1 Fen1 Flu1 Flu1 Flu1 Phe1 Phe1 Phe1 BhQ1 BhQ1 BhQ1 B Fen2 Fen2 Fen2 Flu2 Flu2 Flu2 Phe2 Phe2 Phe2 BhQ2 BhQ2 BhQ2 C Fen3 Fen3 Fen3 Flu3 Flu3 Flu3 Phe3 Phe3 Phe3 BhQ3 BhQ3 BhQ3 D Fen4 Fen4 Fen4 Flu4 Flu4 Flu4 Phe4 Phe4 Phe4 BhQ4 BhQ4 BhQ4 E Fen5 Fen5 Fen5 Flu5 Flu5 Flu5 Phe5 Phe5 Phe5 BhQ5 BhQ5 BhQ5 F Fen6 Fen6 Fen6 Flu6 Flu6 Flu6 Phe6 Phe6 Phe6 BhQ6 BhQ6 BhQ6 G Fen7 Fen7 Fen7 Flu7 Flu7 Flu7 Phe7 Phe7 Phe7 BhQ7 BhQ7 BhQ7 H Fen8 Fen8 Fen8 Flu8 Flu8 Flu8 Phe8 Phe8 Phe8 BhQ8 BhQ8 BhQ8
Onder een rustig zwenkende beweging (200 rpm) gedurende 24 uur bij 25 qC worden de films in de microtiterplaat beladen.
8. Voeg aan elke well 300 µl milliQ of diluent toe en laat de plaat afgedekt (met plate sealer) gedurende 20 min schudden bij 700-900 rpm.
9. Voeg na 15 min. schudden met een (repiteer)pipet 300 µl methanol (MeOH) toe aan ambergekleurde HPLC-vials (evenveel vials als wells met film).
10. Pipetteer na 20 min. schudden de vloeistof (milliQ) in elke well met een multichannelpipet over naar de desbetreffende vial met MeOH.
Gebruik voor elke reeks (kolom) een nieuwe pipettip. Spoel de pipet na elke injectie in de vial een aantal keer met het MeOH-milliQ mengsel. Sluit aan het einde van de overdracht de vials af met caps en plaats de vials in afwachting op analyse in een koelkast.
11. Voeg aan de leeg gemaakte wells met een (repiteer)pipet 200 µl MeOH toe en laat de plaat afgedekt (met plate sealer) gedurende 20 min schudden bij 700-900 rpm.
12. Herhaal stappen 5 en 6 (volume MeOH is 200 i.p.v. 300 µl).
13. Extraheer de film nogmaals door de stappen 7 en 8 te herhalen.
14. Analyseer de concentraties teststof in de waterfase (milliQ) en de film (extractie 1 en 2) met HPLC/FLD.
De bovenstaande methode is recentelijk een paar keer getest in de macor microtiterplaat. Voor het eerste experiment werd de methode volgens alle stappen uitgevoerd, met uitzondering van het afdekken van de plaat tijdens het schudden. Toen bleek dat, indien er bij 700-900 rpm wordt geschud, de vloeistof uit de well komt. Dit geldt met name voor oplosmiddelen. Opzich kan dit voorkomen worden door langzamer te schudden (200-300 rpm).
Hierdoor neemt de snelheid van desorptie vanuit de film echter drastisch af,
met als gevolg dat de evenwichtsinstelling van de teststof tussen film en water veel langer op zich laat wachten. Door de plaat af te dekken met plate sealer kan er toch geschud worden bij hoge toeren per minuut. Wel bestaat het risico dat de plate sealer zorgt voor een extra verliespost m.b.t. de teststof door adsorptie of dat de sealer zelf een bron vormt voor stoffen die de test kunnen beïnvloeden. Deze mogelijkheden dienen onderzocht te worden.
4.6 Toepassing in bioassays
De eerste bioassay, uitvoerbaar in een microtiterplaat, waarbij de filmmethode toegepast gaat worden is de Mutatox® (zie §3.8.1). In eerste instantie betreft het alleen de directe test. Bij de indirecte test is er sprake van enzymatische omzetting om zo eventuele genotoxische metabolieten mee te nemen. Deze test in combinatie met de partitie-gecontroleerde toediening met de film geeft een complexe situatie, er lopen namelijk twee kinetische processen
tegelijkertijd:
x desorptie-kinetiek vanuit de film, die zorgt voor de aanlevering van de teststof aan de waterfase;
x en de enzymatische kinetiek, waarbij dezelfde stof in de waterfase wordt omgezet in metabolieten.
Oftewel, de concentratie teststof in de waterfase blijft dalen door afbraak van de stof door enzymen en tegelijkertijd wordt dit “verlies” gecompenseerd door nalevering vanuit de film. Dit laatste is uiteraard niet de bedoeling. Vanwege de complexheid van dit probleem, zal de filmmethode eerst verder ontwikkeld worden voor de directe Mutatox® test. Indien dit succesvol verloopt, kan in een later stadium het bovenstaande probleem onderzocht worden.
Voor de toepassing van de toedieningsmethode in de Mutatox® dient de methode gedurende 24 uur (incubatietijd van de test) de teststof na te kunnen leveren aan de waterfase. Het gevaar bestaat dat de film gedurende de test uitgeput raakt. Verliesprocessen zoals adsorptie aan de wand van de well en verdamping kunnen hier aan bijdragen, maar ook adsorptie aan het
testorganisme (bacterie) en aan voedingsstoffen in het medium (voor de bacterie).
Het voorstel is daarom om eerst een experiment uit te voeren waarin dit gecontroleerd wordt. Dit kan door een experiment uit te voeren, waarbij de Microtox®bacterie en het Mutatox® medium gebruikt wordt. Deze bacterie, Vibrio fischeri, is de normale lichtgevende variant van de (genetisch
gemodificeerde) donkere variant gebruikt in de Mutatox®assay (zie §3.8.1 en
§3.8.2). Het voordeel van de Microtox® ten opzichte van de Mutatox® bacterie is dat deze beduidend goedkoper is. Het heeft ook een ander voordeel m.b.t.
het volgende probleem. Door denaturatie van cellen, als gevolg van sterfte van bacterie, kan dood organisch materiaal afzakken naar de bodem van de well.
Hierdoor kan de desorptie van teststof vanuit de film verminderen, omdat het dode materiaal het relatief kleine oppervlak van de film gedeeltelijk bedekt.
Oftewel, vermindering van desorptie van de teststof vanuit de film in combinatie met hoge sterfte van de bacterie is een sterke aanwijzing dat het dode organisch materiaal deze vermindering veroorzaakt. Dit kan gecontroleerd worden door het meten van de lichtproductie van de Microtox® bacterie (luminescentie). Toename of afname van luminescentie geeft informatie over respectievelijk de groei, maar nog belangrijker, de sterfte van het organisme.
5 Conclusies
. . . .
Een belangrijke beslissing die genomen moet worden met betrekking tot de partitie-gecontroleerde toediening in microtiterplaten is de keuze van het materiaal waaruit de plaat bestaat. Op het moment zijn er twee mogelijkheden, namelijk:
x een kostbare macor microtiterplaat die herbruikt dient te worden, maar wel bestendig is tegen oplosmiddelen;
x en de gangbare commercieel verkrijgbare polystyrene microtiterplaat, die minder goed bestendig is tegen oplosmiddelen en mogelijk de aanlevering van de teststof vanuit de film kan storen door irreversibele adsorptie van de stof aan de plaat.
Macor microtiterplaat
Een methode is ontwikkeld voor het schoonmaken van de macor plaat. Deze methode werkt redelijk goed (er is nog sprake lichte verontreiniging na schoonmaak), maar is wel tijdrovend. Eventueel herbruik van de films in de plaat lijkt ook mogelijk, maar dit dient verder onderzocht te worden.
Polystyrene microtiterplaat
In eerder onderzoek is gebleken dat de polystyrene plaat gevoelig is voor hexaan. Mogelijk geldt dit ook voor pentaan. Echter, door de verdamping van het oplosmiddel, oftewel de indamping van de film, te versnellen door afblazing met stikstof kan mogelijk aantasting van de plaat voorkomen worden.
Overstappen op een ander oplosmiddel, dat zowel geschikt is voor de filmmethode als voor gebruik in polystyrene platen, is ook een optie die het onderzoeken waard is.
Belangrijk is dat de bovenstaande keuze gemaakt wordt voordat er begonnen wordt met het verdere onderzoek zoals in dit werkdocument beschreven. Voor het verdere onderzoek is het ook van belang dat de juiste siliconenkit gebruikt wordt. De Silastic Medical Adhesive Silicone (Type A)kit scoort goed in alle onderdelen, maar op één onderdeel dient nog getoetst te worden,
namelijktoxiciteit. Het is niet waarschijnlijk dat dit een probleem zal zijn, aangezien de kit toegepast wordt in de medische hoek, maar aangezien het hier een geheel andere toepassing betreft dient dit wel gecontroleerd te worden.
Wanneer de bovenstaande keuze gemaakt is en de kit niet toxisch blijkt te zien, kan er snel begonnen worden met het vervolgonderzoek. De daarvoor
benodige methoden zijn in dit werkdocument beschreven. Ook is in
voorbereiding op het onderzoek in 2005 (voor een groot deel) het benodigde materiaal aangeschaft.
In aanvulling op het onderzoek beschreven in dit werkdocument, volgt in begin 2005 een vergelijkbaar document voor de toedieningsmethode aan bioassays in glazen flessen. Vanwege de grote verschillen tussen de twee testsystemen, microtiterplaat (300 µl) en glazen flessen (100 ml), is de beschrijving van het benodigde onderzoek gescheiden.
Literatuur
. . .
Brown, R.S. (2001). Partition controlled Delivery of Hydrophobic Substances in Toxicity Tests Using Poly(dimethylsiloxane) (PDMS) Films. Environ. Sci.
Technol. 35, 4097-4102.
Klamer, J.C., F. Smedes, I. Kozin, R.S. Brown (1999). Polymer Films for Controlled Delivery
of Contaminants in Toxicity Tests. Presentatie op SETAC mei 1999, Leipzig, Duitsland.
Rijkens, B. (2004). Het effect van fenantreen en benzo(h)quinoline op het vroege levensstadium van de tong (Solea solea). Stagerapport RIKZ.
Smedes, F., S. van Vliet (2004). Coaten van flessen met een laagje silicone rubber. Werkdocument RIKZ/MI/2004.658W.
Åkerman, J. (2000). Gecontroleerde toediening van contaminanten aan screenings-assays. Werkdocument RIKZ/OS/2000.601X.
Åkerman, J. (2000). Partitie gecontroleerde toediening van contaminanten in bio-assays: Gebruik makend van de post-loading film-methode. Rapport AquaSense 1338-10, Amsterdam.
