Tot op heden zijn de filmexperimenten in microtiterplaten uitgevoerd in platen gemaakt van polystyreen of macor. Er is echter een belangrijk verschil tussen deze experimenten, namelijk het gebruikte oplosmiddel. Voor de experimenten in de polystyrene platen was dit methanol, terwijl in de macor plaat hexaan of
pentaan is gebruikt. De polystyrene platen zijn wel bestand tegen methanol, maar niet tegen hexaan en waarschijnlijk ook niet tegen pentaan. Dit laatste dient echter nog getest te worden. Het is mogelijk dat pentaan geen probleem vormt omdat het snel verdampt en de tijd voor aantasting van de plaat te kort is.
Het voordeel van de macor plaat ten opzichte van kunststoffen platen is dat de adsorptie van (hydrofobe) stoffen beduidend lager is en dat het beter bestendig is tegen verschillende oplosmiddelen. Een groot nadeel van macor is dat het een relatief duur materiaal betreft, waardoor hergebruik van de plaat noodzakelijk is. Dit betekent dat de plaat gereinigd dient te worden. Mogelijk dat de film herbruikbaar is, maar ook deze zal na langer gebruik vervangen moeten kunnen worden. Vooral bij de belading van films met milieuextracten zal het schoonmaken van de film moeizaam verlopen.
Op het moment is het, op basis van eerdere resultaten, moeilijk een keuze te maken tussen de verschillende materialen. De keuze is eigenlijk afhankelijk van een aantal eigenschappen van de platen die eerst onderzocht dienen te worden. De vragen ten opzichte van deze eigenschappen zijn:
Macor microtiterplaat: Polystyrene microtiterplaat:
1. Kan de film (in de plaat) na gebruik schoon gemaakt worden (verwijdering van contaminanten in de film) zodat het geschikt is voor hergebruik? Welke stappen dienen hiervoor genomen te worden?
2. Kan de plaat in zijn geheel na gebruik schoon gemaakt worden
1. Tast pentaan, of een ander geschikt oplosmiddel waarin PDMS goed in oplost, de plaat aan gedurende de indamping van de film?
2. Is het verlies van opgelost teststof aan de plaat (adsorptie) een constante factor dat gecompenseerd kan worden door desorptie vanuit de film?
Macor microtiterplaat
In experimenten uitgevoerd in oktober-december 2004 bleek het mogelijk om de film uit de plaat te verwijderen. Dit gebeurde als volgt:
1. Aan elke well is ± 100 µl Silstrip (Nederlandsche Benzol
Maatschappij B.V., Dordrecht) toegevoegd. Dit is een hoogwaardig reinigingsmiddel voor het verwijderen van siliconen.
2. Na ongeveer 20 min. wordt elke well met een watten staafje geboend, waarna de Silstrip verwijderd wordt.
3. Vervolgens wordt de plaat met aceton en daarna milliQ gewassen.
4. Herhaling van stap 1 en 2.
5. De plaat wordt nogmaals met aceton gewassen en in de zuurkast (afzuiging aan) gezet om te drogen.
6. Nadat de plaat gedroogd is wordt gecontroleerd of alle wells schoon zijn (sporen van film etc.). Indien nodig worden de bovenstaande stappen herhaald.
Met de bovenstaande methode is het mogelijk om de film uit de plaat te verwijderen. Het is echter well een tijdrovend proces, vooral als het na elk experiment herhaald moet worden. Daarom is hergebruik (meerdere keren) van de film wenselijk. Dit is waarschijnlijk mogelijk indien de film, na gebruik, één of enkele keren gewassen wordt met een oplosmiddel zoals methanol, ethanol of ethyl acetaat. Het succes van de methode kan getoetst worden door na partitie-experimenten met b.v. fenantreen de film een drietal keer te wassen en na elke wasbeurt de concentratie fenantreen in het oplosmiddel te meten met HPLC/FLD. Indien succesvol, kan het experiment herhaald worden met een aantal andere stoffen, en met name na experimenten met milieuextracten.
Polystyrene microtiterplaat
De bestendigheid van polystyrene microtiterplaten kan getoetst worden door verschillende oplosmiddelen toe te voegen aan de wells in de plaat. Het volgende experiment wordt voorgesteld:
1. Aan ‘kolom 1’ wordt 200 µl/well van oplosmiddel A toegevoegd, aan
‘kolom 2’ 300 µl/well van oplosmiddel B, enz.
2. De plaat wordt op een plaatschudder, met een langzame
rotatiesnelheid (200-300 rpm) gedurende 8 uur te schudden gezet bij 20 qC.
3. Na elk uur wordt per kolom (per oplosmiddel) een well geleegd en vervolgens worden de lege wells onder een binoculair bekeken of ze beschadigd zijn.
Indien uit het bovenstaande experiment blijkt dat er een geschikt oplosmiddel bestaat voor het maken van PDMS-films in polystyrene microtiterplaten, kan onderzocht worden of de capaciteit van de film groot genoeg is om verlies aan opgelost teststof in de waterfase door adsorptie aan de plaat te compenseren.
Dit kan met het volgende experiment, waarbij verschillende filmvolumes van b.v. 1,3 t/m 20 µl meegenomen worden:
1. In microtiterplaat worden 6 verschillende filmvolumes in triplo gemaakt volgens de onderstaande indeling (met per well het filmvolume in µl). Per well wordt 300 µl PDMS-oplossing (in verschillende concentraties) toegevoegd. De plaat wordt vervolgens op een schudder gezet en bij 25 qC rustig zwenkend (200 rpm) gedroogd.
2. Na een aantal dagen (3-4) te hebben gedroogd, worden de bovenstaande films per kolom beladen met een concentratiereeks van een teststof, b.v. fenantreen.
3. 24 uur later wordt het partitie-coëfficient van fenantreen bepaald door aan elke well 300 µl milliQ of diluent toe te voegen (zie ook
§3.1.4). Na 20 min schudden bij 700-900 rpm wordt het milliQ verwijdert om daarin de concentratie fenantreen te bepalen.
Vervolgens wordt de film in de wells tweemaal geëxtraheerd met methanol om de concentratie fenantreen in de film te bepalen.
4. Na bepaling van de concentratie fenantreen in het milliQ en de film kan Kfw berekend worden.
Met een vergelijking van de Kfw’s binnen de triplo’s (STDEV), tussen de verschillende triplo’s en mogelijk met resultaten uit experimenten in de macor microtiterplaat en/of glazen cuvetten kan waarschijnlijk een uitspraak gemaakt worden m.b.t. capaciteit van de film ten opzichte van verlies aan teststof in de waterfase in kunststoffen platen. Het is mogelijk dat de capaciteit van de films met een klein volume niet groot genoeg is, maar die van de films met een groot volume wel.
Als hetzelfde experiment uitgevoerd wordt in de macor microtiterplaat kan voor beide type platen ook een uitspraak gemaakt worden over het optimale filmvolume.
Geadviseerd wordt indien:
x de polystyrene microtiterplaat bestendig is tegen één of meer oplosmiddelen die geschikt zijn voor de filmmethode;
x en de capaciteit van de film groot genoeg is om snel het verlies aan teststof in de waterfase te compenseren;
om de polystyrene microtiterplaten te gebruiken. Deze zijn commercieel reeds makkelijk te krijgen en vormen een beduidend goedkoper alternatief dan de macor microtiterplaat.
4.4 Desorptie-kinetiek
Om de snelheid van evenwichtsinstelling van de teststof tussen de film en de vloeistof te kunnen bepalen is het nodig de concentratie van de teststof vanaf het begin van het experiment te meten in de waterfase. Met de methode zoals beschreven in §4.5 kan dit als volgt uitgevoerd worden:
1. Voer stap 1 en 2 uit zoals beschreven in §4.5.
2. Na 3 dagen worden de films per kolom beladen met een concentratiereeks van de teststof door 200 µl stockoplossing per well toe te voegen met een pipet. Voorbeeld met fenantreen:
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A Fen1 Fen1 Fen1 Fen1 Fen1 Fen1 Fen1 Fen1 Fen1 Fen1 Fen1 B Fen2 Fen2 Fen2 Fen2 Fen2 Fen2 Fen2 Fen2 Fen2 Fen2 Fen2 C Fen3 Fen3 Fen3 Fen3 Fen3 Fen3 Fen3 Fen3 Fen3 Fen3 Fen3 D Fen4 Fen4 Fen4 Fen4 Fen4 Fen4 Fen4 Fen4 Fen4 Fen4 Fen4 E Fen5 Fen5 Fen5 Fen5 Fen5 Fen5 Fen5 Fen5 Fen5 Fen5 Fen5 F Fen6 Fen6 Fen6 Fen6 Fen6 Fen6 Fen6 Fen6 Fen6 Fen6 Fen6 G Fen7 Fen7 Fen7 Fen7 Fen7 Fen7 Fen7 Fen7 Fen7 Fen7 Fen7 H Fen8 Fen8 Fen8 Fen8 Fen8 Fen8 Fen8 Fen8 Fen8 Fen8 Fen8 Onder een rustig zwenkende beweging (200 rpm) gedurende 24 uur bij 25 qC worden de films in de microtiterplaat beladen.
3. Voeg voordat het experiment begint met een (repiteer)pipet 300 µl methanol (MeOH) toe aan ambergekleurde HPLC-vials (evenveel
vials als wells met film). Bedek de vials in afwachting op het experiment met Parafilm®.
4. Voeg aan elke well 300 µl milliQ toe en laat de plaat gedurende 21 min. schudden bij 700-900 rpm (bij kamertemperatuur).
5. Pipetteer na 1 min. schudden met een multichannelpipet (snel) het milliQ in kolom 1 over naar de desbetreffende HPLC-vials. Zet de schudder hierbij weer aan na het opzuigen, maar voor injecteren in de vial zodat de plaat zoveel mogelijk staat te schudden.
6. Herhaal stap 5 na 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 en 21 min.
schudden. Zorg dat de pipettips klaar staan zodat de tips van de multichannelpipet snel verwisseld kunnen worden. Vergeet niet de pipettips na injectie in de vial een paar keer te spoelen met het MeOH-milliQ mengsel.
7. Analyseer de concentraties teststof in de waterfase (milliQ) met HPLC/FLD.
In eerdere experimenten in glazen cuvetten werd het evenwicht bereikt binnen 10 min. (Åkerman, 2000a/b). Waarschijnlijk zal het evenwicht in de
microtiterplaat wat langer op zich laten wachten, aangezien het oppervlak van de film kleiner is. Mogelijk dat daarom het experiment herhaald moet worden met een langere schudtijd.
4.5 Partitie-coëfficient
Afhankelijk van de resultaten uit de experimenten beschreven in §4.3 zal de bepaling van het partitie-coëfficient van een aantal stoffen uitgevoerd in een macor of polystyrene microtiterplaat. Voor deze bepalingen zijn een aantal modelstoffen geselecteerd die voldoen aan een aantal criteria. Het zijn stoffen die:
1. hydrofoob zijn (ClogP > 3,5);
2. goed meetbaar zijn met HPLC/FLD (fluorescerende stoffen);
3. waarvan voor minstens één stof in eerdere experimenten Kfw succesvol bepaald is;
4. en waarvan minstens één stof een hoge respons (genotoxiciteit) vertoont in de Mutatox assay.
Aan de hand van deze criteria zijn de volgende stoffen geselecteerd (voldoet aan criteria):
x Fenantreen (1, 2, 3);
x Fluoranteen (1, 2, 3);
x Phenantridine (1, 2, 4);
x Benzo(h)quinoline (1, 2, 4).
Voor de eerste twee stoffen bestaat reeds een methode om ze te meten met HPLC/FLD. Deze methodes zullen enigszins aangepast worden vanwege de nieuwe HPLC-opstelling. Dit is voor fenantreen recentelijk gebeurd. Voor de laatste twee stoffen moet nog een detectiemethode ontwikkeld worden.
In een later stadium kunnen ook Kfw-bepalingen uitgevoerd worden van stofmengels.
De partitie-coëfficient bepaling wordt, met het optimale filmvolume bepaald tijdens de experimenten beschreven in §4.3, als volgt uitgevoerd:
1. 200 µl PDMS-oplossing wordt aan de desbetreffende wells toegevoegd.
2. Onder een rustig zwenkende beweging (200 rpm) gedurende 3 dagen bij 25 qC worden de films in de microtiterplaat uitgedampt.
3. Na 3 dagen worden de films per kolom beladen met een concentratiereeks van de desbetreffende teststof door 200 µl stockoplossing per well toe te voegen met een pipet. Voorbeeld met de bovenstaande stoffen fenantreen, fluoranteen, phenantridine en benzo(h)quinoline:
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A Fen1 Fen1 Fen1 Flu1 Flu1 Flu1 Phe1 Phe1 Phe1 BhQ1 BhQ1 BhQ1 B Fen2 Fen2 Fen2 Flu2 Flu2 Flu2 Phe2 Phe2 Phe2 BhQ2 BhQ2 BhQ2 C Fen3 Fen3 Fen3 Flu3 Flu3 Flu3 Phe3 Phe3 Phe3 BhQ3 BhQ3 BhQ3 D Fen4 Fen4 Fen4 Flu4 Flu4 Flu4 Phe4 Phe4 Phe4 BhQ4 BhQ4 BhQ4 E Fen5 Fen5 Fen5 Flu5 Flu5 Flu5 Phe5 Phe5 Phe5 BhQ5 BhQ5 BhQ5 F Fen6 Fen6 Fen6 Flu6 Flu6 Flu6 Phe6 Phe6 Phe6 BhQ6 BhQ6 BhQ6 G Fen7 Fen7 Fen7 Flu7 Flu7 Flu7 Phe7 Phe7 Phe7 BhQ7 BhQ7 BhQ7 H Fen8 Fen8 Fen8 Flu8 Flu8 Flu8 Phe8 Phe8 Phe8 BhQ8 BhQ8 BhQ8
Onder een rustig zwenkende beweging (200 rpm) gedurende 24 uur bij 25 qC worden de films in de microtiterplaat beladen.
8. Voeg aan elke well 300 µl milliQ of diluent toe en laat de plaat afgedekt (met plate sealer) gedurende 20 min schudden bij 700-900 rpm.
9. Voeg na 15 min. schudden met een (repiteer)pipet 300 µl methanol (MeOH) toe aan ambergekleurde HPLC-vials (evenveel vials als wells met film).
10. Pipetteer na 20 min. schudden de vloeistof (milliQ) in elke well met een multichannelpipet over naar de desbetreffende vial met MeOH.
Gebruik voor elke reeks (kolom) een nieuwe pipettip. Spoel de pipet na elke injectie in de vial een aantal keer met het MeOH-milliQ mengsel. Sluit aan het einde van de overdracht de vials af met caps en plaats de vials in afwachting op analyse in een koelkast.
11. Voeg aan de leeg gemaakte wells met een (repiteer)pipet 200 µl MeOH toe en laat de plaat afgedekt (met plate sealer) gedurende 20 min schudden bij 700-900 rpm.
12. Herhaal stappen 5 en 6 (volume MeOH is 200 i.p.v. 300 µl).
13. Extraheer de film nogmaals door de stappen 7 en 8 te herhalen.
14. Analyseer de concentraties teststof in de waterfase (milliQ) en de film (extractie 1 en 2) met HPLC/FLD.
De bovenstaande methode is recentelijk een paar keer getest in de macor microtiterplaat. Voor het eerste experiment werd de methode volgens alle stappen uitgevoerd, met uitzondering van het afdekken van de plaat tijdens het schudden. Toen bleek dat, indien er bij 700-900 rpm wordt geschud, de vloeistof uit de well komt. Dit geldt met name voor oplosmiddelen. Opzich kan dit voorkomen worden door langzamer te schudden (200-300 rpm).
Hierdoor neemt de snelheid van desorptie vanuit de film echter drastisch af,
met als gevolg dat de evenwichtsinstelling van de teststof tussen film en water veel langer op zich laat wachten. Door de plaat af te dekken met plate sealer kan er toch geschud worden bij hoge toeren per minuut. Wel bestaat het risico dat de plate sealer zorgt voor een extra verliespost m.b.t. de teststof door adsorptie of dat de sealer zelf een bron vormt voor stoffen die de test kunnen beïnvloeden. Deze mogelijkheden dienen onderzocht te worden.
4.6 Toepassing in bioassays
De eerste bioassay, uitvoerbaar in een microtiterplaat, waarbij de filmmethode toegepast gaat worden is de Mutatox® (zie §3.8.1). In eerste instantie betreft het alleen de directe test. Bij de indirecte test is er sprake van enzymatische omzetting om zo eventuele genotoxische metabolieten mee te nemen. Deze test in combinatie met de partitie-gecontroleerde toediening met de film geeft een complexe situatie, er lopen namelijk twee kinetische processen
tegelijkertijd:
x desorptie-kinetiek vanuit de film, die zorgt voor de aanlevering van de teststof aan de waterfase;
x en de enzymatische kinetiek, waarbij dezelfde stof in de waterfase wordt omgezet in metabolieten.
Oftewel, de concentratie teststof in de waterfase blijft dalen door afbraak van de stof door enzymen en tegelijkertijd wordt dit “verlies” gecompenseerd door nalevering vanuit de film. Dit laatste is uiteraard niet de bedoeling. Vanwege de complexheid van dit probleem, zal de filmmethode eerst verder ontwikkeld worden voor de directe Mutatox® test. Indien dit succesvol verloopt, kan in een later stadium het bovenstaande probleem onderzocht worden.
Voor de toepassing van de toedieningsmethode in de Mutatox® dient de methode gedurende 24 uur (incubatietijd van de test) de teststof na te kunnen leveren aan de waterfase. Het gevaar bestaat dat de film gedurende de test uitgeput raakt. Verliesprocessen zoals adsorptie aan de wand van de well en verdamping kunnen hier aan bijdragen, maar ook adsorptie aan het
testorganisme (bacterie) en aan voedingsstoffen in het medium (voor de bacterie).
Het voorstel is daarom om eerst een experiment uit te voeren waarin dit gecontroleerd wordt. Dit kan door een experiment uit te voeren, waarbij de Microtox®bacterie en het Mutatox® medium gebruikt wordt. Deze bacterie, Vibrio fischeri, is de normale lichtgevende variant van de (genetisch
gemodificeerde) donkere variant gebruikt in de Mutatox®assay (zie §3.8.1 en
§3.8.2). Het voordeel van de Microtox® ten opzichte van de Mutatox® bacterie is dat deze beduidend goedkoper is. Het heeft ook een ander voordeel m.b.t.
het volgende probleem. Door denaturatie van cellen, als gevolg van sterfte van bacterie, kan dood organisch materiaal afzakken naar de bodem van de well.
Hierdoor kan de desorptie van teststof vanuit de film verminderen, omdat het dode materiaal het relatief kleine oppervlak van de film gedeeltelijk bedekt.
Oftewel, vermindering van desorptie van de teststof vanuit de film in combinatie met hoge sterfte van de bacterie is een sterke aanwijzing dat het dode organisch materiaal deze vermindering veroorzaakt. Dit kan gecontroleerd worden door het meten van de lichtproductie van de Microtox® bacterie (luminescentie). Toename of afname van luminescentie geeft informatie over respectievelijk de groei, maar nog belangrijker, de sterfte van het organisme.
5 Conclusies
. . . .
Een belangrijke beslissing die genomen moet worden met betrekking tot de partitie-gecontroleerde toediening in microtiterplaten is de keuze van het materiaal waaruit de plaat bestaat. Op het moment zijn er twee mogelijkheden, namelijk:
x een kostbare macor microtiterplaat die herbruikt dient te worden, maar wel bestendig is tegen oplosmiddelen;
x en de gangbare commercieel verkrijgbare polystyrene microtiterplaat, die minder goed bestendig is tegen oplosmiddelen en mogelijk de aanlevering van de teststof vanuit de film kan storen door irreversibele adsorptie van de stof aan de plaat.
Macor microtiterplaat
Een methode is ontwikkeld voor het schoonmaken van de macor plaat. Deze methode werkt redelijk goed (er is nog sprake lichte verontreiniging na schoonmaak), maar is wel tijdrovend. Eventueel herbruik van de films in de plaat lijkt ook mogelijk, maar dit dient verder onderzocht te worden.
Polystyrene microtiterplaat
In eerder onderzoek is gebleken dat de polystyrene plaat gevoelig is voor hexaan. Mogelijk geldt dit ook voor pentaan. Echter, door de verdamping van het oplosmiddel, oftewel de indamping van de film, te versnellen door afblazing met stikstof kan mogelijk aantasting van de plaat voorkomen worden.
Overstappen op een ander oplosmiddel, dat zowel geschikt is voor de filmmethode als voor gebruik in polystyrene platen, is ook een optie die het onderzoeken waard is.
Belangrijk is dat de bovenstaande keuze gemaakt wordt voordat er begonnen wordt met het verdere onderzoek zoals in dit werkdocument beschreven. Voor het verdere onderzoek is het ook van belang dat de juiste siliconenkit gebruikt wordt. De Silastic Medical Adhesive Silicone (Type A)kit scoort goed in alle onderdelen, maar op één onderdeel dient nog getoetst te worden,
namelijktoxiciteit. Het is niet waarschijnlijk dat dit een probleem zal zijn, aangezien de kit toegepast wordt in de medische hoek, maar aangezien het hier een geheel andere toepassing betreft dient dit wel gecontroleerd te worden.
Wanneer de bovenstaande keuze gemaakt is en de kit niet toxisch blijkt te zien, kan er snel begonnen worden met het vervolgonderzoek. De daarvoor
benodige methoden zijn in dit werkdocument beschreven. Ook is in
voorbereiding op het onderzoek in 2005 (voor een groot deel) het benodigde materiaal aangeschaft.
In aanvulling op het onderzoek beschreven in dit werkdocument, volgt in begin 2005 een vergelijkbaar document voor de toedieningsmethode aan bioassays in glazen flessen. Vanwege de grote verschillen tussen de twee testsystemen, microtiterplaat (300 µl) en glazen flessen (100 ml), is de beschrijving van het benodigde onderzoek gescheiden.
Literatuur
. . .
Brown, R.S. (2001). Partition controlled Delivery of Hydrophobic Substances in Toxicity Tests Using Poly(dimethylsiloxane) (PDMS) Films. Environ. Sci.
Technol. 35, 4097-4102.
Klamer, J.C., F. Smedes, I. Kozin, R.S. Brown (1999). Polymer Films for Controlled Delivery
of Contaminants in Toxicity Tests. Presentatie op SETAC mei 1999, Leipzig, Duitsland.
Rijkens, B. (2004). Het effect van fenantreen en benzo(h)quinoline op het vroege levensstadium van de tong (Solea solea). Stagerapport RIKZ.
Smedes, F., S. van Vliet (2004). Coaten van flessen met een laagje silicone rubber. Werkdocument RIKZ/MI/2004.658W.
Åkerman, J. (2000). Gecontroleerde toediening van contaminanten aan screenings-assays. Werkdocument RIKZ/OS/2000.601X.
Åkerman, J. (2000). Partitie gecontroleerde toediening van contaminanten in bio-assays: Gebruik makend van de post-loading film-methode. Rapport AquaSense 1338-10, Amsterdam.