Cover Page The handle

Cover Page

The handle http://hdl.handle.net/1887/55958 holds various files of this Leiden University dissertation

Author: Xin, Bo-Tao

Title: Discovery and development of inhibitors selective for human constitutive proteasome and immunoproteasome active sites

Date: 2017-09-27

General Introduction   

1.1 The Ubiquitin Proteasome System (UPS) 

The ubiquitin proteasome system (UPS) is responsible for the degradation of the majority of  cytosolic  and  nuclear  proteins  in  eukaryotic  cells.¹  Proteins  destined  for  degradation  by  the  UPS are ubiquitinated by an ATP‐dependent cascade of E1, E2 and E3 enzymes.² Ubiquitin is a  76‐residue protein that is attached to substrate proteins via an isopeptidic linkage, in which  the lysine side chain amine is condensed with the C‐terminal glycine of a ubiquitin moiety.³  Ubiquitin lysines themselves can be modified with ubiquitin moieties, giving rise to a plethora  of  oligo‐  and  poly‐ubiquitylated  proteins.  Some  of  these  are  destined  for  proteasomal  degradation whereas others may guide other cellular functions. Once bound to the 19S caps of  26S  proteasomes,  ubiquitin  chains  are  removed  through  the  action  of  one  of  a  number  of  deubiquitinases. The target proteins are then unfolded and channeled to the inner catalytic  chamber of 20S proteasomes where they are processed to give oligopeptides with an average  length of 8‐12 amino acids.⁴ These short peptides can be further degraded into amino acids by  aminopeptidases,  while  some  escape  further  degradation  and  are  displayed  by  major  histocompatibility complex class I (MHCI) molecules on the cell surface.⁵ 

1

Chapter 1

1.2 The Proteasome 

Proteasomes are large multiprotein complexes that are expressed by all eukaryotic cells. 26S  proteasome particles consist of a 19S regulatory particle and a 20S core particle (CP). 20S CPs  are  C2‐symmetrical  barrel‐shaped  multiprotein  complexes  composed  of  four  stacked  rings,  each of which contains seven subunits: two inner rings (β1‐7) and two outer rings (α1‐7). In  constitutive proteasome CPs, the proteolytic activity resides within three distinct β subunits,  namely,  β1c  (caspase‐like,  cleaving  preferably  after  acidic  amino  acids),  β2c  (trypsin‐like,  cleaving  preferably  after  basic  amino  acids)  and  β5c  (chymotrypsin‐like,  cleaving  preferably  after hydrophobic amino acids).⁴ The active sites of the β‐subunits share N‐terminal threonine  residue  and  it  can  coordinate  to  a  water  molecule  (Figure  1).  The  hydroxyl  group  of  the  threonine  attacks  the  adjacent  peptide  bond,  which  results  in  the  cleavage  of  the  peptide  pond and formation of ester bond between proteasome and the substrate. This ester bond  could be further cleaved through attack of a water molecule. 

In higher vertebrate, these three subunits may be replaced by β1i (LMP2), β2i (MECL1) and β5i  (LMP7),  giving  rise  to  immunoproteasome  core  particles  (iCPs).⁶  iCP  proteolytic  activities  feature  substrate  preferences  similar  to,  but  distinct  from,  their  cCP  counterparts  and  are  commonly  thought  to  generate  peptides  with  higher  affinity  for  MHCI.⁷  Cortical  thymic  epithelial  cells  uniquely  express  β5t  subunits,  which  replace  β5i  in  immunoproteasomes  to  form thymoproteasome core particles (tCPs).⁸ 

Figure 1. The catalytic cycle of proteasomal peptide bond hydrolysis. 

1.3 Proteasome Inhibitors 

Proteasomes  are  validated  drug  targets  in  the  treatment  of  hematological  cancers  and  are  considered  as  promising  targets  for  the  development  of  drugs  to  treat  a  variety  of  immunological  disorders,  including  rheumatoid  arthritis  and  multiple  sclerosis.⁹  Proteasome 

inhibitors currently used in the clinic for the treatment of multiple myeloma and mantle cell  lymphoma  are  the  C‐terminally  modified  oligopeptides,  bortezomib,¹⁰  carfilzomib¹¹  and  ixazomib,¹²  and  several  analogous  structures  are  in  various  stages  of  development.  Besides  these clinical drugs and drug candidates, numerous proteasome inhibitors have been reported,  including both natural products and synthetic compounds.¹³ Synthetic peptide‐based natural  proteasome  inhibitors  usually  consist  of  2‐4  amino  acids  with  a  N‐terminal  cap  and  a  C‐terminal  electrophilic  trap  (also  termed  the  ‘warhead’).  The  peptide fragment  serves  as  a  recognition  part  that  interacts  with  the  non‐primed  part  of  the  substrate‐binding  channel  within proteasome core particles. The electrophile reacts with the N‐terminal and catalytically  active threonine residues to form a covalent and either reversible or irreversible linkage. The  four most widely used warheads are epoxyketones (EK), vinyl sulfones (VS), boronic acids and  aldehydes. Epoxyketones and vinyl sulfones react with proteasome active site threonines to  form  covalent,  irreversible  bonds  whereas  boronic  acides  and  aldehydes  form  covalent,  reversible bonds. The mechanism of action of these electrophiles is show in figure 2. 

Figure 2. Mechanism of EK, VS, boronic acid and aldehyde electrophiles is reacting with the active site threonine of  proteasomes. 

The natural product, epoxomicin, is the archetypal peptide epoxyketone proteasome inhibitor  (Figure 3). Epoxomicin is a highly specific proteasome inhibitor with no off‐targets known to  date. This specificity may be due to its mechanism of action: two electrophiles are present in  the  N‐terminal  2‐amino‐alcohol  that  makes  up  the  active  site  residue.¹⁴  Indeed,  both  threonine  alcohol  and  amine  are  covalently  modified  upon  reaction  with  epoxomicin  and  related peptide epoxyketones. Originally and based on crystal studies the covalent adduct was  thought to be a morpholine ring, however, recent structural studies proteasomes complexed  to  epoxyketones  suggest  that  a  seven‐membered  oxazepane  ring  can  be  formed  instead  (Figure 2).¹⁵ Vinyl sulfones inhibit proteasomes by conjugate addition of the hydroxyl moiety of  the threonine in the active site to the vinyl sulfone to form a stable ether linkage.¹⁶ Common  off‐targets of peptide vinyl sulfones are cysteine proteases, which in a similar process react to 

Chapter 1

give stable thioether adducts. Peptide boronic acids react as a Lewis base with the Lewis acidic  threonine‐alcohol to form stable, tetrahedral adducts that however collapse upon denaturing  proteasomes and as such are formal reversible inhibitors.¹⁷ Depending on the nature of the  peptide sequence, the residence time of peptide boronic acids varies such that, while some  are to all intends and purposes irreversible (the time of their presence in proteasome active  sites  surpasses  that  of  proteasome  half‐life),  others  are  (slowly)  reversible.  Off‐targets  of  peptide  boronic  acids  may  be  found  in  the  (extensive)  serine  hydrolase  family.  Peptide  aldehydes finally form a reversible hemi‐acetal bond with the active site threonine alcohol.¹⁸  Peptide aldehydes (with as example Z‐Leu3‐Al, or MG‐132) were the first designed, synthetic  proteasome inhibitors. Today they are however considered inferior in comparison to peptide  epoxyketones, peptide vinyl sulfones and peptide boronic acids because they are less active,  relatively unstable and moreover have many off targets in the serine hydrolase and cysteine  protease families. 

Figure 3. Structures of representative compounds with various electrophiles: EK (epoxomicin), VS (Z‐L3‐VS), boronic  acid (bortezomib) and aldehyde (MG132). 

In the first years, efforts in the development of proteasome inhibitors were either directed on  pan‐proteasome  inhibitors  or  on  the  development  of  inhibitors  active  against  proteasomal  chymotryptic  sites.  In  the  last  few  years,  however,  inhibitors  that  target  selectively  β1c/1i  (NC‐001),¹⁹ β2c/2i (LU‐102)²⁰ and β5c/5i (NC‐005)²¹ have been reported (Figure 4A). After the  successful  development  of  these  selective  inhibitors,  research  has  been  focusing  on  the  development of inhibitors that selectively and potently target one out of the six catalytically  active subunits of human cCPs and iCPs together.²² Recently, and at the basis of the research  described in this Thesis, a set of inhibitors were disclosed (Figure 4B),²³ by means of which one  selected activity out of the six embedded in human cCPs and iCPs combined can be blocked.   

Figure 4. Structures of selective proteasome inhibitors. 

As  well,  a  set  of  activity‐based  probes  with  complementary  fluorescent  properties  and  reporting, in a single activity‐based protein profiling (ABPP) assay, on β1c/1i, β2c/2i and β5c/5i,  respectively,  was  described  (Figure  5).  With  this  ABPP  assay,  the  activity  and  selectivity  of  proteasome inhibitors, including those developed in the course of the research described in  this Thesis, can be monitored with relative ease.²³ 

Chapter 1

Figure  5.  A)  Structures  of  Cy5‐NC‐001,  BODIPY(FL)‐LU‐112  and  BODIPY(TMR)‐NC‐005‐VS.  B)  Selective  inhibition  of  β‐subunits  in Raji cell lysates by subunit‐specific proteasome inhibitors assayed by competitive ABPP using cocktail  APBs. 

1.4 Aim and outline of this thesis 

This  thesis  presents  the  development  and  optimization  of  subunit‐selective  proteasome  inhibitors and their corresponding activity‐based probes (ABPs), building on the inhibitor‐ and  probe  set  depicted  in  Figure  4.  Chapter  2  provides  a  concise  overview  of  methods  for  the  asymmetric synthesis of non‐canonical aliphatic ‐amino acids – structures featuring in several  of  the  optimized  oligopeptide  vinyl  sulfones  and  oligopeptide  epoxyketones  presented  in  subsequent  chapters.  In  Chapter  3,  the  design,  synthesis  and  evaluation  as  potential  proteasome inhibitors of a series of C‐terminally modified oligopeptides featuring structural  variations on the epoxyketone theme is presented. Chapter 4 describes the incorporation of  the  constrained  peptidomimetic,  5‐methylpyridin‐2‐one  into  peptide  vinyl  sulfones  and  peptide  epoxyketones  as  well  as  the  consequences  of  this  modification  on  proteasome  inhibition  potency.  The  structure‐based  design  of  β5c  selective  inhibitors  of  human  constitutive  proteasomes  including  a  stereoselective  synthesis  of  the  Boc‐cis‐BiCha‐OH  and  Boc‐trans‐BiCha‐OH amino acids is subject of Chapter 5. Chapter 6 presents the synthesis and  evaluation of a focused compound library designed to encompass β2c‐selective proteasome  inhibitors.  Chapter 7  reports  on  the discovery  of  a β2i‐selective  inhibitor  and  activity‐based  probe. In Chapter 8, efforts to attain new reagents for in vitro and in situ two‐step labeling of  individual proteasome activities is described. Chapter 9 provides a summary of the research  described in this Thesis and reflects on some future research directions presents. One major  outstanding  question  is  the  development  of  an  inhibitor  selective  for  the  seventh  human  proteasome  activity,  the  thymoproteasome‐specific  β5t.  Amongst  others,  this  final  chapter  reports  on  results  obtained  after  screening  of  an  in‐house  available  library  of  C‐terminally  modified  oligopeptides,  including  all  proteasome  inhibitors  currently  available  at  Leiden  University for the presence of β5t selective inhibitors. 

1.5 References 

[1] a)  Rock,  K.L.;  Gramm,  C.;  Rothstein,  L.;  Clark,  K.;  Stein,  R.;  Dick,  L.;  Hwang,  D.;  Goldberg,  A.L.  Inhibitors  of  the  proteasome block the degradation of most cell proteins and the generation of peptides presented on MHC class I  molecules. Cell 1994, 78, 761‐771. b) Hershko, A.; Chiechanover, A. The ubiquitin system. Annu. Rev. Biochem. 

1998, 67, 651‐664. 

[2] Glickman,  M.H.;  Ciechanover,  A.  The  ubiquitin‐proteasome  proteolytic  pathway:  desctruction  for  the  sake  of  construction. Physiol. Rev. 2002, 82, 373‐428. 

[3] a)  Goldstein,  G.;  Scheid,  M.;  Hammerling,  D.H.;  Niall,  H.D.;  Boyse,  E.A.  Isolation  of  a  polypeptide  that  has  lymphocyte‐differentiating properties and is probably represented universally in living cells. Proc. Natl. Acad. Sci. 

U.S.A. 1975, 72, 11‐15. b) Wilkinson, K.D. The discovery of ubiquitin‐dependent proteolysis. Proc. Natl. Acad. Sci. 

U.S.A.  2005,  102,  15280‐15282.  c)  Kimura,  Y.;  Tanaka,  K.  Regulatory  mechanisms  involved  in  the  control  of  ubiquition homeostasis. J. Biochem. 2010, 147, 793‐798. 

[4] Voges,  D.;  Zwickl,  P.;  Baumeister,  W.  The  26S  proteasome:  a  molecular  machine  designed  for  controlled  proteolysis. Annu. Rev. Biochem.1999, 68, 1015‐1068. 

[5] Kloetzel, P.‐M. Antigen processing by the proteasome. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2001, 2, 179‐187. 

[6] a)  Kloetzel,  P.M.;  Ossendorp,  F.  Proteasome  and  peptidase  function  in  MHC‐class‐I‐mediated  antigen  presentation. Curr. Opin. Immunol. 2004, 16(1), 76‐81. b) Griffin, T.A.; Nandi, D.; Cruz, M.; Fehling, H.J.; Kaer, L. V.; 

Monaco,  J.J.;  Colbert,  R.A.  Immunoproteasome  assembly:  cooperative  incorporation  of  interferon  gamma  (IFN‐gamma)‐inducible subunits. J. Exp. Med. 1998, 187, 97‐104. c) Groettrup, M.; Kraft, R.; Kostka, S.; Standera,  S.; Stohwasser, R.; Kloetzel, P. M. A third interferon‐gamma‐induced subunit exchange in the 20S proteasome. 

Eur. J. Immunol. 1996, 26, 863‐869. 

[7] Orlowski, M.; Cardozo, C.; Michaud, C. Evidence for the presence of five distinct proteolytic components in the  pituitary multicatalytic proteinase complex. Properties of two components cleaving bonds on the carboxyl side of  branched chain and small neutral amino acids. Biochemistry 1993, 32, 1563‐1572. 

[8] Murata, S.; Sasaki, K.; Kishimoto, T.; Niwa, S.‐I.; Hayashi, H.; Takahama, Y.; Tanaka, K. Regulation of CD8⁺ T cell  development by thymus‐specific proteasome. Science 2007, 316, 1349‐1353. 

[9] a) O’Connor, O.A.; Stewart, A. K.; Vallone, M.; Molineaux, C.J.; Kunkel, L.A.; Gerecitano, J.F.; Orlowski, R.Z.A phase  1 dose escalation study of the safety and pharmacokinetics of the novel proteasome inhibitor carfilzomib (PR‐171)  in patients with hematologic malignancies. Clin. Cancer Res. 2009, 15, 7085‐8091. b) Adams, J.; Behnke, M.; Chen,  S.; Cruickshank, A.A.; Dick, L.R.; Grenier, L.; Klunder, J.M.; Ma, Y.‐T.; Plamondon, L.; Stein, R.L. Potent and selective  inhibitors of the proteasome: dipeptidyl boronic acids. Bioorg. Med. Chem. Lett. 1998, 8, 333‐338. c) Richardson,  P.  G.;  Sonneveld,  P.;  Schuster,  M.W.;  Irwin,  D.;  Stadtmauer,  E.A.;  Facon,  T.;  Harousseau,  J.L.;  Ben‐Yehuda,  D.; 

Lonial, S.; Goldschmidt, H.; Reece, D.; San‐Miguel, J.F.; Bladé, J.; Boccadoro, M.; Cavenagh, J.; Dalton, W.S.; Boral,  A.L.;  Esseltine,  D.L.;  Porter,  J.B.;  Schenkein,  D.;  Anderson,  K.D.  Bortezomib  or  high‐dose  dexamethasone  for  relapsed multiple myeloma. N. Engl. J. Med. 2005, 352, 2487‐2498. d) Demo, S.D.; Kirk, C.J.; Aujay, M.A.; Buchholz,  T.J.; Dajee, M.; Ho, M.N.; Jiang, J.; Laidig, G.J.; Lewis, E.R.; Parlati, F.; Schenk, K.D.; Smyth, M.S.; Sun, C.M.; Vallon,  M.K.; Woo, T.M.; Molineaux, C.J.; Bennett, M.K. Antitumor activity of PR‐171, a novel irreversible inhibitor of the  proteasome. Cancer Res. 2007, 67, 6383‐6391. 

[10] a) Adams, J.; Behnke, M.; Chen, S.; Cruickshank, A.A.; Dick, L.R.; Grenier, L.; Klunder, J.M.; Ma, Y.‐T.; Plamondon, L.; 

Stein, R.L. Potent and selective inhibitors of the proteasome: dipeptidyl boronic acids. Bioorg. Med. Chem. Lett. 

1998,  8,  333‐338.  b)  Richardson,  P.G.;  Sonneveld,  P.;  Schuster,  M.W.;  Irwin,  D.;  Stadtmauer,  E.A.;  Facon,  T.; 

Harousseau, J.L.; Ben‐Yehuda, D.; Lonial, S.; Goldschmidt, H.; Reece, D.; San‐Miguel, J.F.; Bladé, J.; Boccadoro, M.; 

Cavenagh, J.; Dalton, W.S.; Boral, A.L.; Esseltine, D.L.; Porter, J.B.; Schenkein, D.; Anderson, K.D. Bortezomib or  high‐dose dexamethasone for relapsed multiple myeloma. N. Engl. J. Med. 2005, 352, 2487‐2498. 

[11] a) Demo, S.D.; Kirk, C.J.; Aujay, M.A.; Buchholz, T.J.; Dajee, M.; Ho, M.N.; Jiang, J.; Laidig, G.J.; Lewis, E.R.; Parlati,  F.;  Schenk,  K.D.;  Smyth,  M.S.;  Sun,  C.M.;  Vallon,  M.K.;  Woo,  T.M.;  Molineaux,  C.J.;  Bennett,  M.K.  Antitumor  activity of PR‐171, a novel irreversible inhibitor of the proteasome, Cancer Res. 2007, 67, 6383‐6391. b) O’Connor,  O.A.;  Stewart,  A.K.;  Vallone,  M.;  Molineaux,  C.J.;  Kunkel,  L.A.;  Gerecitano,  J.F.;  Orlowski,  R.Z.A  phase  1  dose 

Chapter 1

escalation  study  of  the  safety  and  pharmacokinetics  of  the  novel  proteasome  inhibitor  carfilzomib  (PR‐171)  in  patients with hematologic malignancies. Clin. Cancer Res. 2009, 15, 7085‐8091. 

[12] Kupperman, E.; Lee, E.C.; Cao, Y.; Bannerman, B.; Fitzgerald, M.; Berger, A.; Yu, J.; Yang, Y.; Hales, P.; Bruzzese, F.; 

Liu, J.; Blank, J.; Garcia, K.; Tsu, C.; Dick, L.; Fleming, P.; Yu, L.; Manfredi, M.; Rolfe, M.; Bolen, J. Evaluation of the  proteasome inhibitor MLN9708 in preclinical models of human cancer. Cancer Res. 2010, 70, 1970‐1980. 

[13] a)  Kisselev,  A.  F.;  van  der  Linden,  W.A;  Overkleeft,  H.S.  Proteasome  inhibitors:  an  expanding  army  attacking  a  unique target. Chem. Biol. 2012, 19, 99‐115. b) Rentsch, A.; Landsberg, D.; Brodman, T.; Bulow, L.; Girbig, A. K.; 

Kalesse, M. Synthesis and pharmacology of proteasome inhibitors. Angew. Chem. Int. Ed. 2013, 52, 5450‐5488. c)  Huber,E. M.; Groll, M. Inhibitors for the immuno‐ and constitutive proteasome: current and future trends in drug  development. Angew. Chem. Int. Ed. 2012, 51, 8708‐9720. 

[14] Groll, M.; Kim, K.B.; Kairies, N.; Huber, R.; Crews, C.M. Crystal structure of epoxomicin: 20S proteasome reveals a  molecular  basis  for  selectivity  of  α’,β’‐epoxyketone  proteasome  inhibitors.  J.  Am.  Chem.  Soc.  2000,  122,  1237‐12380. 

[15] Schrader,  J.;  Henneberg,  F.;  Mata,  R.A.;  Tittmann,  K.;  Schneider,  T.R.;  Stark,  H.;  Bourenkov,  G.;  Chari,  A.  The  inhibition  mechanism  of  human  20S  proteasomes  enables  next‐generation  inhibitor  design.  Science  2016,  353,  594‐598. 

[16] Bogyo,  M.;  Shin,  S.;  McMaster,  J.S.;  Gaczynska,  M.;  Tortorella,  D.;  Goldberg,  A.L.;  Ploegh,  H.L.  Covalent  modification of the active site threonine of proteasomal β subunits and the Escherichia coli homolog HsIV by a  new class of inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1997, 94, 6629‐6634. 

[17] Groll, M.; Berkers, C.R.; Ploegh, H.L.; Ovaa, H. Crystal structure of the boronic acid‐based inhibitor bortezomib in  complex with the yeast 20S proteasome. Structure 2006, 14, 451‐456. 

[18] Borissenko,  L.;  Groll,  M.  20S  proteasome  and  its  inhibitors:  crystallographic  knowledge  for  drug  development. 

Chem. Rev. 2007, 107, 687‐717. 

[19] Britton, M.; Lucas, M.M.; Downey, S.L.; Screen, M.; Pletnev, A.A.; Verdoes, M.; Tokhunts, R.A.; Amir, O.; Goddard,  A.L.; Pelphrey, P.M.; Wright, D.L.; Overkleeft, H.S.; Kisselev, A.F. Selective inhibitor of proteasome’s caspase‐like  sites sensitizes cells to specific inhibition of chymotrypsin‐like sites. Chem. Biol. 2009, 16, 1278‐1289. 

[20] Geurink, P.P., van der Linden, W.A.; Mirabella, A.C.; Gallastegui, N.; de Bruin, G.; Blom, A.E.M.; Voges, M.J.; Mock,  E.D.;  Florea,  B.I.;  van  der  Marel,  G.A.;  Driessen,  C.;  van  der  Stelt,  M.;  Groll,  M.;  Overkleeft,  H.S.;  Kissele,  A.F. 

Incorporation  of  non‐natural  amino  acids  improves  cell  permeability  and  potency  of  specific  inhibitors  of  proteasome trypsin‐like sites. J. Med. Chem. 2013, 56, 1262‐1275. 

[21] Screen, M.; Britton, M.; Downey, S.L.; Verdoes, M.; Voges, M.J.; Blom, A.E.M.; Geurink, P.P.; Risseeuw, M.D.P.; 

Florea,  B.I.;  van  der  Linden,  W.A.;  Pletnve,  A.A.;  Overkleeft,  H.S.;  Kisselev,  A.F.  Nature  of  pharmacophore  influences active site specificity of proteasome inhibitors. J. Chem. Biol. 2010, 285, 40125‐40134. 

[22] de Bruin, G.; Huber, E.M.; Xin, B.‐T.; van Rooden, E.J.; Al‐Ayed, K.; Kim, K.‐B.; Kisselev, A.F.; Driessen, C.; van der  Stelt, M.; van der Marel, G.A.; Groll, M.; Overkleeft, H.S. Structure‐based design of β1i or β5i specific inhibitors of  human immunoproteasomes. J. Med. Chem. 2014, 57, 6197‐6209. 

[23] de Bruin, G.; Xin, B.‐T.; Kraus, M.; van der Stelt, M.; van der Marel, G.A.; Kisselev, A.F.; Driessen, C.; Florea, B.I.; 

Overkleeft, H.S. A set of activity‐based probes to visualize human (Immuno)proteasome activities. Angew. Chem. 

Int. Ed., 2016, 55, 4199‐4206.