Towards subunit specific proteasome inhibitors
Linden, W.A. van der
Citation
Linden, W. A. van der. (2011, December 22). Towards subunit specific proteasome inhibitors. Retrieved from https://hdl.handle.net/1887/18273
Version: Corrected Publisher’s Version
License: Licence agreement concerning inclusion of doctoral thesis in the Institutional Repository of the University of Leiden
Downloaded from: https://hdl.handle.net/1887/18273
Note: To cite this publication please use the final published version (if applicable).
Samenvatting
Op weg naar subunit-specifieke proteasoomremmers
De kwaliteit en hoeveelheid van elk eiwit is van cruciaal belang voor het overleven van een cel. Het proteasoom speelt een onmisbare rol in het afbreken van de meeste eiwit- ten in de menselijke cel. Het proteasoom, een groot eiwitcomplex dat strak gereguleerd wordt, is daarvoor uitgerust met subunits met verschillende proteolytische activiteiten die bij elkaar in het eiwitcomplex zitten. Het constitutieve proteasoom bevat subunits met caspase-achtige activiteit (β1), trypsine-achtige activiteit (β2) en chymotryptische activiteit (β5). Elk van deze activiteiten prefereert het knippen van een eiwitketen op andere plekken.
Dit wordt gestuurd door het aminozuur naast de te knippen plek in een eiwit. Afhankelijk van het celtype kunnen nog eens vier verschillende subunits met proteolytische activiteiten de plek van β1, β2 of β5 van het proteasoom innemen. Op een gecontroleerde manier worden doeleiwitten door het proteasoom afgebroken tot korte peptiden. De meeste van deze peptiden worden verder afgebroken tot losse aminozuren. Een deel van de peptiden wordt echter geselecteerd voor presentatie op het celoppervlak en door het immuunsysteem bestudeerd. Op deze manier stelt het immuunsysteem vast of een cel lichaamsvreemde ei- witten bevat en wordt er zo nodig een immuunreactie opgewekt. Het proteasoom is dus een belangrijk studieobject in de immunologie. Daarnaast is het proteasoom een doelwit voor medicijnen tegen kanker.
Op basis van antiontstekings- of antitumoractiviteit zijn veel natuurstoffen gevonden die een remmende werking vertonen op proteolytische activiteiten van het proteasoom.
Tegelijkertijd zijn er vele proteasoomremmers gesynthetiseerd en op het moment wordt de proteasoomremmer bortezomib in de kliniek gebruikt als medicijn tegen leukemie. Een aantal andere remmers wordt aan klinisch onderzoek onderworpen. De rol van elke afzon- derlijke proteolytische activiteit in gezonde cellen of kankercellen of hun rol in het ontstaan van auto-immuunziekten is nog niet geheel duidelijk. Selectieve remmers die elke activiteit van het proteasoom afzonderlijk kunnen stilleggen zijn handig gereedschap om de rol van elk van deze activiteiten te onderzoeken. Om gebruikt te kunnen worden om proteasoom- functies in cellen te bestuderen moeten deze selectieve remmers wel celpermeabel zijn. Veel proteasoomremmers bestaan uit een electrofiele val (om aan het katalytisch actieve residu van de proteolytische activiteit van het proteasoom te binden), een peptidensequentie (ver-
147
antwoordelijk voor herkenning), en een N-terminale extensie. Dit proefschrift beschrijft de ontwikkeling van enkele specifieke remmers van individuele proteasoomactiviteiten.
Hoofdstuk 1geeft een overzicht van natuurlijk voorkomende en synthetische klassen proteasoomremmers. Daarnaast wordt een overzicht gegeven van proteasoomremmers die selectief zijn voor bepaalde proteolytische activiteiten van het proteasoom.
Hoofdstuk 2beschrijft de synthese van drie proteasoomremmers die de chymotrypti- sche activiteit van het proteasoom (β5) remmen. Door het epoxyketon-electrofiel in deze drie stoffen, verantwoordelijk voor binding aan het nucleofiele katalytische residu van de proteasoomactiviteit, te vervangen door een vinylsulfon, werden drie analoga verkregen.
Met behulp van een fluorescent epoxomicin-analoog werd het inhibitieprofiel van de zes stoffen in cellysaat bepaald. Door gebruik van een fluorogeen substraathydrolyse-assay met gezuiverd constitutief proteasoom en immunoproteasoom werd de activiteit op immuno- subunits onderzocht. De activiteit van de drie vinylsulfon-analogen is lager dan die van de epoxyketon-gebaseerde remmers, maar twee van de vinylsulfon-analogen vertonen meer selectiviteit voor β5. De electrofiele val beïnvloedt dus de selectiviteit van proteasoomrem- mers.
Hoofdstuk 3beschrijft de synthese van tien electrofiele vallen die in staat zijn Michael- additie te ondergaan. Deze electrofielen werden gekoppeld aan drie verschillende pepti- dedelen en dit leidde tot een dertigtal verbindingen. Geen van deze stoffen vertoonde po- tente inhibitie van proteasoomactiviteit. De cellulaire doelwitten van twee azide bevattende stoffen werd bepaald door middel van een bioorthogonale twee-staps labelingstrategie. De stoffen werden met cellen geïncubeerd, waarna de azide selectief gemodificeerd werd met biotine door middel van de Staudinger-ligatie. De gemodificeerde cellulaire doelwitten wer- den gescheiden op basis van de aanwezigheid van biotine en geanalyseerd met massaspec- trometrie. Onder de teruggevonden eiwitten waren katalytisch actieve subunits van het proteasoom, ondanks het onvermogen van de gebruikte stoffen het proteasoom potent te remmen. Daarnaast werden cathepsines gevonden, een familie cysteïne-proteases die in staat zijn Michael-additie te ondergaan.
Syringolin A is een potente proteasoomremmer die wordt uitgescheiden door een plantenpathogeen wanneer deze een plant binnendringt. Syringolin A is ook een potente remmer van het menselijke proteasoom. Hoofdstuk 4 behandelt de inbouw van het bij- zondere valine-ureum-valine motief, aanwezig in syringolin A, in een bibliotheek peptide- gebaseerde vinylsulfonen en epoxyketonen. Het inhibitieprofiel van de bibliotheek werd vastgesteld met een fluorescente analoog van epoxomicin. Stoffen waarbij de ureumband op een korte afstand van de electrofiele val is ingebouwd remmen de caspase-achtige ac- tiviteit (β1) van het proteasoom. Een epoxyketon-gebaseerde remmer uit deze korte serie kwam naar voren als de meest potente selectieve remmer van β1 in levende cellen tot nu toe beschreven. Remmers met een iets langere afstand tussen electrofiel en ureumband ver- tonen juist selectiviteit voor de chymotryptische proteasoomactiviteit (β5). Verscheidene stoffen uit de in dit hoofdstuk beschreven bibliotheek zijn potenter dan syringolin A.
Hoofdstuk 5beschrijft de vergelijking van twee-staps labeling door cyclooctynen en de Staudinger-Bertozzi ligatie. Proteasomen werden gelabeld met een proteasoomremmer die een BODIPY-fluorofoor en een azide bevat. De reactie-efficiëntie van drie cyclooctynen,
148
bevestigd aan biotine, werd bestudeerd aan de hand van de verschuiving van proteasoom- signalen na gel-electroforese. De concentratie die nodig is om alle azide-BODIPY gemod- ificeerde proteasomen te decoreren met biotine is voor cyclooctynen veel lager dan voor de fosfine van de Staudinger-Bertozzi-ligatie. Bij het uitlezen van het signaal van biotine blijkt dat de cyclooctyn-ligatie gepaard gaat met veel ongewenste achtergrondlabeling, in tegenstelling tot de Staudinger-Bertozzi-ligatie.
In Hoofdstuk 6 wordt de synthese van een serie proteasoomremmers met basische aminozuurzijketens beschreven. Het inhibitieprofiel van deze stoffen in cellysaat en le- vende cellen werd bepaald met behulp van een fluorescente epoxomicinanaloog. Selec- tiviteit voor de tryptische activiteit van het proteasoom (β2) wordt verkregen wanneer een bij fysiologische pH positief geladen zijketen op P1 wordt gebruikt. Het inbouwen van een 4-aminomethyleen fenylalanine op de P1- en P3-positie van een tetrapeptide vinyl- sulfon levert een potente remmer met hoge selectiviteit voor β2 op. Bevestiging van een BODIPY-fluorofoor aan dit molecuul resulteerde in een activiteits-gebaseerde probe voor β2. Door de aanwezigheid van twee basische zijketens komen deze twee moleculen echter niet efficiënt de cel binnen.
149
