Los, Alrik Pieter
Citation
Los, A. P. (2007, January 25). Diacylglycerol kinase theta and zeta isoforms: regulation of
activity, protein binding partners and physiological functions. Retrieved from
https://hdl.handle.net/1887/9451
Version: Corrected Publisher’s Version
License: Licence agreement concerning inclusion of doctoral thesis in the
Institutional Repository of the University of Leiden
Downloaded from: https://hdl.handle.net/1887/9451
Note: To cite this publication please use the final published version (if applicable).
152
N e d e r la n d s e
s a m e n v a t t in g
Het menselijke lichaam bestaat naar schatting uit 65.000.000.000.000 cellen, die allemaal een sp ecif ieke taak en/ o f f unctie hebben. Co mmunicatie tussen cellen o nderling als mede gro eif acto ren in de lichaamsv lo eisto f f en (bijv o o rbeeld in het blo ed) gene reren signalen die, o nder andere, bep alen w elke taak o f f unctie een cel heef t en o f een cel z ich mag delen. A ls cellen niet reageren o p die signalen o f als de signalen niet go ed v ertaald w o rden kan dit leiden to t o nge co ntro leerde celdeling w at uiteindelijk kan resulteren in kanker.
S ignalen die celgro ei stimuleren o f remmen, mo eten v an buiten de cel getrans- p o rteerd w o rden naar binnen o v er het celmembraan. D at membraan, o o k w el p lasmamembraan geno emd, bestaat uit lip iden (v etten) en eiw itten, en v o rmt een barriè re die de inho ud v an de cel scheidt v an het ex terne milieu. I n het celmem- braan bev inden z ich recep to ren die signalen uit hun o mgev ing o p v angen en dit v ia een cascade v an signaalmo leculen in de cel do o rgev en naar, o nder andere, de celkern w aar sp ecif ieke genen o p het D N A aan o f uit w o rden geschakeld. D it kan leiden to t een resp o ns, bijv o o rbeeld celdeling. E en v eel v o o rko mende manier v an signaalo v erdracht is het mo dif iceren v an signaalmo leculen met een o f meer f o sf aatgro ep en, w at f o sf o ry lering w o rdt geno emd. Z o w el eiw itten (p ro teinen) als lip iden kunnen gef o sf o ry leerd w o rden do o r sp ecif ieke enz y men, kinases geno emd.
I n dit p ro ef schrif t is o nderz o ek gedaan naar diacy lgly cero l kinase (D G K) dat een f o sf aatgro ep ko p p elt aan het lip ide diacy lgly cero l (D A G ) w aarbij f o sf atidez uur (P A ) o ntstaat. D G K is een enz y matische schakel in een signaalo v erdracht cascade dat begint met de recep to r- gemedieerde activ ering v an een enz y m (f o sf o lip ase C) dat een lip ide in de celmembraan (f o sf atidy lino sito l- bisf o sf aat, P I P2) klief t w aar - bij D A G gev o rmd w o rdt. E en v o o rbeeld v an een signaal o v erdracht cascade w aarin D G K een ro l sp eelt is geïllustreerd in F iguur 1 . D A G is een signaalmo lecuul dat
Fig 1.
Positie van DGK in een signaal overdracht cascade.
meerdere eiwitten kan activeren, waaronder protein kinase C (PKC), en speelt een rol in celdeling, differentiatie (celspecialisatie) en celmorfologie. O ok het DGK product, PA, kan meerdere eiwitten activeren, maar het is niet bekend in welke processen in het lichaam het een rol speelt. In gist is aangetoond dat PA een rol speelt bij het reguleren van specifieke genen. DGK regelt dus de hoeveelheid van twee verschillende signaalmoleculen, DAG en PA. Het belang van een goede regu- latie van DAG en PA wordt benadrukt door het grote aantal verschillende subtypen (isovormen) van DGK; bij de mens zijn dat er tien. Dit onderzoek is gefocuseerd op twee DGK isovormen: DGKe (theta) en DGKc (zeta). Een overzicht van de litera- tuur over DGKe en DGKc is beschreven in Hoofdstuk 1.
154
In Hoofdstuk 2 is bestudeerd welke domeinen binnen het DGKe molecuul belang- rijk zijn voor het efficië nt fosforyleren van DAG.DGKe is opgebouwd uit een aantal domeinen, waaronder drie cysteine-rijke domeinen waarvan wordt gedacht dat het DAG bindt en een domein dat verantwoordelijk is voor de enzymatische (kinase) acti viteit. Het derde cysteine-rijke domain van DGKe is verlengd met 15 aminozuren (bouwstenen van eiwitten), wat geconserveerd is (d.w.z. een ver- gelijkbare structuur heeft) in alle DGKs. Geconserveerde aminozuren binnen deze verlenging bleken essentieel te zijn voor DGK activiteit. M ogelijk speelt de ver- lenging van het cyteine-rijke domein een rol bij het presenteren van DAG aan het kinase domein. Daarnaast is gebleken dat het verwijderen van zelfs een klein gedeelte van DGKe de DGK activiteit al drastisch verlaagt. Het grote effect op de activiteit duidt er op dat het complete eiwit nodig is voor de correcte vouwing van DGKe of dat alle domeinen nodig zijn voor interacties met andere eiwitten die DGKe activiteit kunnen regelen.
Het werk dat is beschreven in de overige hoofdstukken van dit proefschrift is een gevolg van onze ontdekking dat het DGKc isotype bleek te binden aan het R etino blastoma eiwit (pR B). Hoofdstuk 3 is een in leiding over pR B en de pR B- gerelateerde eiwitten p107 en p13 0. pR B is een tumor-suppressor eiwit en is een belangrijke schakel die celdeling onderdrukt. In tumoren is pR B of een ander signaalmolecuul in de pR B signalering cascade gemuteerd, waardoor de celdeling niet meer geremd wordt. Naast het reguleren van celdeling is pR B betrokken bij celdifferentiatie.
In Hoofdstuk 4 wordt beschreven dat DGKc aan zowel pR B, p107 als p13 0 kan binden. Deze binding verhoogt de activiteit van DGKc. Daarnaast toonden we aan dat DGKc een rol speelt in pR B -signalering. B estraling van cellen (en tu- moren) leidt tot DNA schade welke hersteld moet worden voordat de celdeling kan starten. De daartoe benodigde blokkering van de celcyclus is afhankelijk van pR B. Dit werd duidelijk omdat cellen die afkomstig waren van muizen waaruit het pR B gen verwijderd is, zogenaamde pR B-deficië nte cellen, na bestraling niet stopten zich te delen. Overexpressie (verhoogd produ ceren) van actief DGKc in pR B-deficië nte cellen daarentegen, herstelt de blokkering van de celdeling na bestraling. DGK activiteit is daarbij essentieel, aangezien cellen waarin een enzy- matisch-inactief DGKc tot overexpressie is gebracht wel door blijven delen na bestraling. DGKc overexpressie heeft geen effect op de blokkering van de celcyclus na bestraling in pR B-positieve cellen. Een mogelijke verklaring hiervoor is dat in pR B-deficië nte cellen een verhoogde hoeveelheid R as (een klein schakel-eiwit) aanwezig is waarvan bekend is dat het celdeling stimuleert. DGKc kan R as signa- lering remmen doordat het DAG wegneemt, en daarmee voorkomt dat DAG een R as activator (R as-GR P) kan activeren. Over expressie van DGKc in pR B-deficië nte cellen zou R as signalering kunnen onderdrukken waardoor de celdeling niet ge- stimuleerd wordt en de cellen na bestraling wel stoppen met delen.
Net als DGKe heeft DGKc een katalytisch domein en twee cysteine-rijke domei- nen. Daarnaast bevat DGKc een M AR CKS domein, dat homoloog is aan (sterk lijkt op) een gedeelte van het myristoylated alanine-rich C-kinase substrate (M AR CKS) eiwit. Het M AR CKS domein van DGKc wordt gefosforyleerd door PKC, wat de acti-
Nederlandse samenvatting
viteit van DGKc reduceert. pRB bindt aan het MARCKS domein van DGKc en daarom is in Hoofdstuk 5 bestudeerd of PKC de binding tussen pRB en DGKc regelt. PKC remt inderdaad de binding tussen DGKc en pRB door de MARCKS domein van DGKc te fosforyleren. Ook van PKC bestaan diverse isovormen, waarvan met name PKC_ de binding tussen pRB en DGKc bleek te remmen. Door de binding tussen pRB en DGKc te verbreken stimuleert PKC_ zijn eigen activatie. pRB binding aan DGKc stimuleert namelijk DGKc activiteit waardoor DAG omgezet wordt in PA en PKC niet geactiveerd wordt. Door de interactie te remmen wordt DAG niet weggenomen en kunnen PKC en andere DAG-bindende eiwitten geactiveerd worden. W at de functie van deze regulering is in de cel is niet bekend, maar van PKC_ is bekend dat het een rol speelt in de regulatie van celdeling en differentiatie, dus mogelijk speelt dit mechanisme daar een rol in.
Om de fysiologische functie van de interactie tussen pRB en DGKc te bepalen is onderzocht of DGKc celdeling of spier -cel-differentiatie reguleert; processen waarin pRB een rol speelt. In Hoofdstuk 6 is aangetoond dat overexpressie van DGKc in verschillende cellijnen geen invloed heeft op de celcyclus. Ook onder condities waarbij pRB de celcyclus blokkeert heeft overexpressie van DGKc geen additionele effecten. Daarnaast is de celcyclus van DGKc-deficiënte cellen (afkom- stig van muizen waaruit het DGKc gen verwijderd is) vergelijkbaar met controle- cellen. DGKc overexpressie of de afwezigheid van DGKc heeft dus geen effect op de celdeling.
Aangezien pRB betrokken is bij spiercel-differentiatie, is in Hoofdstuk 7 onderzocht of DGKc een rol speelt in dit proces. Overexpressie van DGKc stimu- leert spiercel differentiatie en de productie van spiercel-specifieke eiwitten.
Aangezien een inactieve mutant van DGKc geen effect heeft op spiercel-differen- tiatie, is het verminderen van DAG of het produceren van PA waarschijnlijk belang- rijk voor differentiatie. Gen-expressie studies door middel van
microarrays hebben aangetoond dat DGKc voornamelijk genen stimuleert die worden geactiveerd door de spiercel-specifieke transcriptiefactor MyoD, wat suggereert dat DGKc mogelijk MyoD activiteit stimuleert. Promoter studies met verschillende pro moters die bindingsplaatsen voor MyoD bevatten, waaronder de myogenin- en muscle creatine kinase promoter, bevestigden dat DGKcMyoD- gereguleerde promoters stimuleert. Daarnaast bleken DGKc-deficiënte cellen niet te kunnen differentiëren tot spiercellen en de daarbij behorende specifieke eiwitten te produceren, wat aantoont dat DGKc essentieel is voor spiercel-diffe- rentiatie.
In dit proefschrift is versterkt bewijs gevonden dat DGK activiteit, en daarmee de hoeveelheden DAG en PA, goed gereguleerd dienen te worden. T en eerste, het complete DGKe eiwit is nodig voor de volledige activiteit van DGKe, wat sugge- reert dat subtiele veranderingen van het eiwit al voldoende zijn voor regulatie van DGK activiteit. T en tweede, DGKc activiteit wordt gereguleerd door pRB, p107 en p130. T en derde, het enzym PKC remt de activering van DGKc door pRB.
156
Daarnaast is aangetoond dat DGKc betrokken is bij twee fysiologische processen:
(1) overexpressie van DGKc in pRB-deficiënte cellen herstelt de blokkering van de celdeling na bestraling en (2) DGKc stimuleert spiercel-differentiatie. Het feit dat we alleen een effect van DGKc op de celdeling hebben gevonden in bestraalde pRB-deficiënte cellen, suggereert dat DGKc alleen een effect heeft op de celdeling onder zeer specifieke condities. Onze hypothese is dat in pRB-deficiënte cellen de balans tussen DAG en PA verstoord is en dat cellen daardoor kunnen blijven delen na bestraling. Overexpressie van DGKc herstelt deze balans, waardoor cellen in staat zijn het blokkeringmechanisme van de celdeling in gang te zetten. In con- trole-cellen is de DAG-PA balans goed gereguleerd, waardoor overexpressie van DGKc geen extra bijdrage levert aan de DAG-PA balans, zodat hiervan geen effec- ten op celdeling worden gevonden. Bij spiercel-differentiatie is mogelijk ook een veran dering in de DAG-PA balans nodig, wat in cellen met verhoogde DGKc expressie eerder wordt bereikt, waardoor deze cellen sneller differentiëren. Het is bekend dat DAG de spiercel-differentiatie remt door de activering van Ras (via Ras-GRP) en door activering van PKC dat expressie van spiercel-specifieke genen remt. PA, daar entegen, stimuleert spiercel-differentiatie via het signaal eiwit mTOR, maar hoe dit precies gereguleerd wordt is niet bekend.
Om het mechanisme te achterhalen hoe DGKc bovengenoemde fysiologische processen reguleert en of DAG-PA balansen daarmee te maken hebben, zou in toekomstige experimenten DAG en PA hoeveel heden gemeten kunnen worden.
Daarnaast zou onderzocht kunnen worden welke DAG- en PA-bindende eiwitten een rol spelen bij deze fysiologische processen. Een gerichte studie naar het functioneren van spiercellen in DGKc-deficiënte muizen kan inzicht verschaffen wat de precieze rol van DGKc in spiercel-differentiatie is. Om de rol van DGKc in pRB signalering uit te zoeken zou het interessant zijn om pRB mutanten te gene- reren die niet aan DGKc, maar wel aan andere pRB-bindende eiwitten kunnen binden. Deze mutanten zouden ingezet kunnen worden in celcyclus- en spiercel- differen tiatie experimenten. Een zeer interessante richting voor vervolgonderzoek is om na te gaan of DGKc regulatie verstoord is in tumoren met een niet-functio- nerende pRB-signaleringsroute. In dit proefschrift is indirect bewijs gevonden dat DGKc betrokken zou kunnen zijn bij een verstoorde regulatie van de celcyclus in cellen waarin pRB signalering geremd is, aangezien DGKc over expressie een blok- kering van de cel cyclus in bestraalde pRB-deficiënte cellen kan herstellen. Het zou zeer interessant zijn te onderzoeken of DGKc ook een positief effect heeft op een blokkering van de cel cyclus in bestraalde tumoren waarin pRB signalering niet functioneel is. Er is dus genoeg werk voor de toekomst om de rol van DGKc in pRB-signalering verder te onderzoeken en hopelijk leidt dit tot verder inzicht hoe kanker behandeld zou kunnen worden.
