Jan Bergervoet, Jan van der Wolf, Patricia van der Zouwen en Carin van Tongeren
Plant Research International B.V., Wageningen
januari 2006
1. Doelstelling
Doel van dit verkennende onderzoek was om de mogelijkheden van flowcytometrie te onderzoeken als hulpmiddel bij het bepalen van het aantal sporen van de schimmel Helminthosporium solani in grondmonsters en, indien mogelijk, de vitaliteit van deze sporen te bepalen.
Werkwijze
Voor het opzetten van de methode is gebruik gemaakt van met H. solani geïnfecteerd aardappelknolmateriaal. Om voldoende sporen van H. solani te verkrijgen werden aardappelknollen bij hoge luchtvochtigheid opgekweekt. Naast deze standaard methode zijn er ook delen van de aardappelknollen, inclusief de schil, in kweekbakjes bij hoge luchtvochtigheid geplaatst.
Nadat er voldoende sporen ontwikkeld waren, werden de sporen geïsoleerd m.b.v. steriel water + 0.05 % (v/v) Tween 20. Deze sporensupensie werd vervolgens gezeefd met een 75 6m filter om de grove delen te verwijderen. De overgebleven gezeefde fractie werd microscopisch gecontroleerd op de aanwezigheid van sporen. De gezeefde fractie werd verdeeld in porties van 100 6l in microtiterplaten.
Deze platen werden vervolgens gebruikt om de fluorochromen te testen. In de eerste serie testen is gebruikt gemaakt van de fluorochromen SYTO9, SYTO11#16 en propidiumjodide (PI) in verschillende concentraties en combinaties. Deze combinaties werken voor een groot aantal schimmelsporen (b.v. Botrytis en Phytophthora). De onderstaande fluorescente kleurstoffen, al dan niet gecombineerd, werden daarna getest.
DNA kleurstoffen: SYTO 11#16, SYTO 17 en SYTO 59–64, DAPI, PI, Hexidiumjodide; enzymatische activiteit:
FUN1, cFDA, Calcein AM en JC1.
Resultaten
De vorming van sporen was geen probleem, beide gebruikte methoden leverden voldoende sporen (afbeelding 1). De schimmelgroei was duidelijk zichtbaar en de hoeveelheid geïsoleerde sporen was zodanig dat de experimenten konden worden uitgevoerd.
Afbeelding 1. Aardappelschijf met sporen van Helminthosporium solani aan sporendragers
Door te controleren met de microscoop bleek dat na spoelen en zeven van de suspensies, er voldoende sporen overbleven voor de testen met fluorochromen (afbeelding 2).
Na toevoegen van fluorochromen bleek in alle gevallen dat de sporen van H. solani niet fluorescent te kleuren waren (afbeelding 3). Als controle werden er sporen van Botrytis cinerea gekleurd (inzet afbeelding 3).
Omdat geen van de gebruikte fluorochromen resulteerde in kleuring van de H. solani #sporen is in een tijdreeks onderzocht of door beschadiging van de sporewand met zuur (2N HCl) dit probleem kon worden opgelost. Deze zuurbehandeling resulteerde ook niet in het gewenste resultaat. Er kon op geen enkele manier (fluorescent en microscopisch) worden geconstateerd dat de sporewand beschadigd werd.
Afbeelding 2. Lichtmicroscopische opname van een gezeefde H. solani #sporenfractie
Afbeelding 3. Kleuring van schimmelsporen: B. cinerea (inzet) geeft een normaal fluorescentiebeeld (fluorescent signaal in een zwarte achtergrond). Bij deze instellingen is H. solani
niet zichtbaar, en dus niet fluorescent. Alleen na een zeer lange belichting zijn de sporen zichtbaar in een lichte achtergrond. De sporen zijn dan ook niet fluorescent.
Conclusie
In dit verkennende onderzoek kon geen methode worden ontwikkeld die het mogelijk maakt om sporen van H. solani
te kunnen tellen of om de vitaliteit van deze sporen te kunnen meten. Er is in deze pilot#study een beperkt literatuuronderzoek gedaan waarbij het zwaartepunt lag op H. solani. In een eventueel uitgebreider onderzoek zouden er mogelijk nog methoden gevonden kunnen worden die dit probleem kunnen oplossen.
In andere projecten (botrytissporen en salmonella) is er een combinatie gemaakt tussen specifieke detectie met antilichamen en vitaliteitsbepaling. Beide micro#organismen waren, afhankelijk van hun vitaliteit, toegankelijk voor de fluorochromen (SYTO63 en PI) en de kleuring kan dan ook gecombineerd worden met een fluorescent gelabeld antilichaam. Hierdoor is in het geval van salmonella dan detectie in grondmonsters mogelijk.
Appendix
Naar aanleiding van het voorgaande is besloten om het literatuuronderzoek verder uit te breiden. De
doelstelling hierbij was om na te gaan of er voor andere, vergelijkbare schimmelsporen, protocollen
gepubliceerd waren die vitaliteitkleuringen beschreven. In dit literatuuronderzoek (o.a. Cox et al., 2001;
Haugland, 1994; Haugland, 1995; Haugland, 1996; Millard et al., 1997) werden geen
aanknopingspunten gevonden betreffende de vitaliteitkleuring. Er werden wel publicaties gevonden
waarin melding gemaakt werd van helminthosporine; een fluorescente kleurstof (afbeelding 1) (Charles et
al., 1933), die ook aanwezig is in de sporen van Helminthosporium oryza (Raistrick et al., 1934) .
Deze stof heeft een zeer specifiek spectrum en dit komt overeen met de resultaten die verkregen
werden met de flowcytometer. Hierbij werd in het rode spectrum een piek gevonden tijdens de metingen
van suspensies van Helminthosporium#sporen, maar omdat deze piek niet gecombineerd kon worden
met een vitaliteitbepaling (propidiumjodide) is dit niet verder uitgewerkt. Uit de literatuur bleek dat er ook
in de sporen van andere Helminthosporium#soorten een soortgelijke fluorescente stof aanwezig was. De
resultaten verkregen na het maken van een scan van 200 tot 800 nm met verse sporen lijkt aan te
geven dat er in de sporen van H. solani ook helminthosporine aanwezig is (afbeelding 2 en 3). De
gevonden spectra komen redelijk overeen met het helminthosporine#spectrum in afbeelding 1, de witte
pijl geeft het spectrum rond de 600 nm aan.
Afbeelding 2. Spectrum van Helminthosporium solani# sporen afkomstig van aardappelschil.
Afbeelding 3. Spectrum van Helminthosporium# solani sporen afkomstig van plaat.
Afbeelding 1. Spectrum van helminthosporine (Charles et al., 1933).
