Enzymová aktivita
Kinetika podle Michaelise a Mentenové
E + S ES E + P koncentrace substrátu ry ch lo st e n zy m o vé r e a kc e S K S V v m lim
Jednotky enzymové aktivity
KATAL (kat)
1 katal = 1 mol přeměnéného substrátu (event. vzniklého produktu) / s
MEZINÁRODNÍ JEDNOTKA (IU, international unit)
1 IU = 1 mol přeměněného substrátu (event. vzniklého produktu)
Enzymová aktivita se obvykle stanovuje za optimálních
podmínek (teplota, pH, atd.) při nasycení enzymu
substrátem (S Km). Za takovýchto podmínek odpovídá aktivita limitní rychlosti (a = Vlim)
Vlim
Specifická aktivita
Aktivita vztažená na jednotkovou hmotnost proteinu (typicky 1 mg)
Metody homogenizace pletiv
Mixer
+ velké množství zpracovaného materiálu
- málo citlivá metodika
Ultraturax
+ rychlé zpracování velkého množství vzorků, snadné chlazení
Třecí miska
+ nejdostupnější metoda homogenizace
+ vhodná pro velké množství typů homogenizovaných materiálů
+ lze použít kapalní dusík pro zvýšení efektivity homogenizace
- pomalé a fyzicky náročné zpracování vzorku
Ultrazvuk
+ rychlé zpracování velkého množství vzorků, snadné chlazení
- možnost vzniku artefaktů díky mechanickému poškození molekul
Enzymová lýze + osmotický šok
+ velmi citlivá metodika
- časově náročné, mohou vznikat artefakty
Pro každou aplikaci je třeba vybrat vhodnou metodiku v závislosti na vlastnostech izolovaných objektů či látek
Pístový homogenizátor
+ velmi citlivá metoda - obtížne zpracování velkého množství vzorků
Balotina
+ velmi citlivá metoda
homogenizace mikroorganizmů - časově náročná metodika
Mrazový lis
+ zpracování velkého množství mikrobiální biomasy
Extrakční pufr
Pro každou aplikaci je třeba vybrat vhodný pufr v závislosti na vlastnostech izolovaných objektů či látek
Osmotikum
Vyrovnání osmotického tlaku při izolaci organel
sacharosa, manitol
Extrakční pufr Pufrační systém
Nastavení a stabilitace vhodného pH
Tris, fosfát, fyziologické pufry (PIPES, MES, atd.)
Adsorpční činidla
Odtranění produktů degradace polyfenolů a barviv
PVP (polyvynylpyrrolidon)
Antioxidanty
Ochrana před nežádoucím působením oxidantů (aktivní kyslík atd.)
DTT (dithiotreitol), merkaptoethanol
Inhibitory proteas
Ochrana extrahovaných proteinů před nežádoucí degradací
PMSF (fenylmethyl sulfonyflfluorid), EDTA, leupeptin, komerční koktejly inhibitorů
Anorganické ionty
Stability některých látek nebo enzymů je závislá na
přítomnosti určitých anoganických iontů Ca2+, K+, Mg2+
centrifugace
supernatant pelet
úhlový rotor křížový rotor
Přetížení (Relative Centrifugation Force ) otáčky (Rounds Per Minute)
) ( ) ( 946 ) (min 1 mm poloměr g přetížení Otáčky H ru bě p ře fi lt ro va ný e xt ra kt 200 g 1000 g 10 000 g 100 000 g jádra chloroplasty mitochondrie ribosomy
Centrifugace
Stanovení enzymové aktivity
Pro účely stanovení enzymu se obvykle sleduje přírustek koncentrace produktu enzymové reakce v čase. Stanovení se obvykle provádí za optimálních podmínek (teplota, pH, iontová síla) při nasycení enzymu substrátem.
Obecné schéma stanovení enzymové aktivity
Enzym katalyzující preanalytickou reakci Produkt Substrát2 Stanovovaný enzym Analytická reakce Detekční reakce Detekovatelný produkt Preanalytická reakce Enzym katalyzující detekční reakci Substrát1 titrační stanovení fotometrie fluorimetrie elektroanalytické metody hmotnostní spektroskopie automatizace stanovení fluoresceindiacetát Esterasa Analytická reakce fluorescein (fluorimetrie)
Základní stav E xc it ac e Em ise Excitovaný stav Nezářivý přechod 350 450 550 650 vlnová délka (nm) A bs or ba nc e / fl uo re sc en ce F lu or es ce n ce ( F R U ) mision (nm) excitation (nm) a b O O O -O H O
Fluorescence
fluoresceinZdroj světla
Monochromátor Štěrbina
Kyveta se vzorkem
Monochromátor Štěrbina Fotonásobič
Fluorimetrie
Schema fluorimetru
Pro zředěné roztoky (absorbance < 0,05) platí: Fluorescence = k koncentrace
Kde k je konstanta pro daný fluorimetr.
Fluorescence závisí na: teplotě a polaritě prostředí Fluorimetrické měření ruší:
•zákal
•přítomnost silně absorbujících látek •detergenty
