Afbraak van PET door Ideonella sakaiensis in de oceaan

Afbraak van PET door Ideonella sakaiensis

in de oceaan

Een interdisciplinair onderzoek naar biologische afbraak van de

plastic soep

24 december 2017

Luc Krimpenfort 11061324 Biomedische Wetenschappen

Bastiaan Beerman 11048883 Scheikunde

Jeroen van Kasteren 10659838 Natuurkunde

Jet Vessies 10543619 Aardwetenschappen

Abstract

PET is een van de meest gebruikte plastics omdat het goedkoop, sterk en houdbaar is. Door deze eigenschappen hoopt het echter ook op in de oceaan. PET is zeer stabiel en was tot voorkort biologisch niet afbreekbaar. In 2016 is echter de bacterie I. sakaiensis gevonden, die in staat is om PET bij relatief lage temperaturen (20 – 45°C) te degraderen. Dit onderzoek beschouwt hoe I. sakaiensis in zee de PET-vervuiling kan tegengaan. Er is gekeken naar de gunstigste omstandigheden in de oceaan voor I. sakaiensis: temperatuur, plasticconcentratie, zoutgehalte en pH. Verder is gekeken naar de enzymatische afbraak van PET door het enzym PETase. De temperatuur van de oceaan en distributie van plastic zijn in kaart gebracht. In de Indische oceaan, de Golf van Mexico en de Caribische Zee zouden de factoren het gunstigst zijn voor de afbraak van PET door I. sakaiensis. Hier bevindt zich een hoge concentratie plastic en zijn de temperaturen van het water hoog. Echter weet men nog niet hoe I. sakaiensis zal reageren als het in de oceaan wordt geplaatst en zullen omstandigheden altijd suboptimaal zijn. Er is nog te weinig onderzoek gedaan naar deze kwesties om sluitende conclusies te kunnen trekken.

Inhoudsopgave

Abstract 1

Inhoudsopgave 2

Inleiding 3

Theoretisch kader 4

Hoe kan PET enzymatisch worden afgebroken? 4

Op welke plekken in de oceaan kan enzymatische afbraak van PET plaatsvinden? 8

Methode 11

Resultaten 13

Discussie en conclusie 14

Inleiding

Plastic is een goedkoop, licht en stevig materiaal waardoor het veel in gebruik is (Andrady, 2015; Wie, 2017). De meeste soorten plastic degraderen slecht of niet, waardoor het accumuleert in de bio- en hydrosfeer (Li, Tse & Fok, 2016). Wereldwijd komt uiteindelijk ongeveer 10% van het plastic in de oceaan terecht, waar het gevaar kan opleveren voor de organismen; ze eten het plastic op, raken erin verstrengeld of hun wil om te eten wordt minder, doordat plastic ophoopt in hun verteringsstelsel (Thompson, 2006; Laist, 1987; Gregory, 1996; Derraik, 2002; Gregory en Andrady, 2003). Via consumptie van mariene organismen komen (micro)plastics (<0,5 mm) in de mens terecht. Bij 95% van de volwassenen in de Verenigde Staten wordt plastic gevonden in hun urine, dit kan negatieve effecten hebben op de gezondheid (North et al., 2013).

Een groot deel van de wereldwijde plasticproductie (7%) is polyethyleentereftalaat (PET) (Wu, Yang & Criddle, 2016). PET is een relatief stabiel polymeer. Dit komt door de structuur van twee esterbindingen aan een benzeenring. Dit vormt geconjugeerde systemen. De stabiliteit zorgt voor veel gewenste eigenschappen, zoals thermische stabiliteit tot ongeveer 260°C, hoge mechanische stabiliteit en stabiliteit tegen hydrolyse (Mighani, 2012). Deze stabiliteit zorgt er wel voor dat het moeilijk is af te breken; de thermische afbraak is duur en zorgt voor schadelijke bijproducten. Biologische afbraak is energetisch efficiënter (Mighani, 2012, Yoshida et al., 2016), en vindt plaats bij temperaturen van 20°C tot 45°C (Yoshida et al., 2016).

PET heeft een hogere dichtheid dan water, waardoor microplastics naar de bodem zinken. Daarom is gekozen voor het onderzoeken van grotere plastics (macroplastics), zoals flesjes, die door aanwezige lucht toch blijven drijven. Met het microbe Ideonella sakaiensis (I. sakaiensis), maakt een enzym PETase aan. Hiermee kunnen deze PET macroplastics biologisch afgebroken worden (Yoshida et al.,2016). I. sakaiensis is het eerst gevonden micro-organisme dat bij lage temperaturen PET kan afbreken (Yoshida et al., 2016). Door dit microbe te implementeren in de oceaan, kan een

interessante oplossing worden geboden voor een deel van het plasticprobleem, namelijk de ophoping van plastics in de oceaan. Echter is het nog niet eerder gebruikt voor afbraak in marine omstandigheden, omdat de toepasbaarheid van I. sakaiensis pas sinds 2016 bekend is (Yoshida et al., 2016). Introductie van een nieuwe soort in een ecosysteem kan negatieve gevolgen hebben op de biodiversiteit (Derraik, 2002), welke invloed I. sakaiensis zal hebben, is onbekend. Aan de hand van deze kennishiaten is de volgende onderzoeksvraag opgesteld: Op welke manier kan polyethyleen

tereftalaat (PET) worden afgebroken in marine omstandigheden door gebruik van de bacterie

Ideonella sakaiensis?

Aan de hand van deze hoofdvraag zullen de volgende deelvragen worden onderzocht: 1. Hoe kan PET door middel van het enzym PETase worden afgebroken?

2. Op welke plaatsen in de oceaan is I. sakaiensis toepasbaar voor de afbraak van PET? In de eerste deelvraag wordt gekeken naar hoe de afbraak van PET werkt door I. sakaiensis. Hierna wordt bekeken hoe de evolutie van deze bacterie is verlopen en hoe andere organismen PET

mogelijk zouden afbreken. Hierna wordt gekeken welke omstandigheden I. sakaiensis nodig heeft om te overleven en PET te degraderen. Daarna wordt bekeken hoe de omstandigheden in de oceaan zijn met betrekking tot zoutgehalte, pH, temperatuur en verdeling van plastics (inclusief PET).

De chemie van levende bacteriën toegepast op het synthetische polymeer PET is een interdisciplinair onderwerp. Zodra deze levende chemie in de oceaan wordt toegepast, is er kennis nodig over de mariene omstandigheden, die moet worden verweven met de levende chemie. Deze kennis wordt vanuit de aardwetenschappen en natuurkunde bekeken. De natuurkunde beschrijft ook hoe plastic zich ophoopt in de oceaan.

In dit onderzoek zal eerst een overzicht worden gegevens van de reeds vergaarde kennis binnen de verschillende domeinen in het theoretisch kader, waarna de methodes en het

onderzoeksproces worden verantwoord. Hierna worden de resultaten weergegeven, afsluitend met discussie en conclusie samengevoegd.

Theoretisch kader

Indeling

Eerst zal de biologische degradatie van PET door I. sakaiensis besproken worden. Dit gebeurt enzymatisch en deze afbraak wordt gedocumenteerd. Hierna wordt I. sakaiensis vergeleken met andere bacteriën die PET kunnen degraderen en worden omstandigheden genoemd waarin de degradatie mogelijk is. Hierbij worden pH, zoutgehalte en temperatuur besproken. Tenslotte wordt bekeken hoe deze omstandigheden in de oceanen zijn. Er zijn kaarten gemaakt van hoe de

temperatuur in de zee is en hoe plastic verdeeld is over de oceaan.

Hoe kan PET enzymatisch worden afgebroken door I. sakaiensis?

Er zijn meerdere micro-organismen bekend die PET kunnen afbreken, zoals Thermobifida fusca en Candida antarctica. Deze organismen beschikken over enzymen die in staat zijn om PET af te breken bij hoge temperaturen (>50°C). De vereiste temperaturen maken ze echter ongeschikt voor de afbraak van PET in de oceaan.

Yoshida et al. (2016) vonden een bepaald consortium van bacteriën op een PET-recycling terrein, dat PET-film kon afbreken met een snelheid van 0,13 mg/cm²/dag bij 30 °C. I. sakaiensis blijkt het verantwoordelijke microbe te zijn. Dankzij de activiteit van I. sakaiensis werd het PET-film binnen 6 weken bijna geheel afgebroken. 75% van het gedegradeerde PET wordt door I. sakaiensis

gekataboliseerd tot CO₂. De bacterie moest eerst aan een PET-oppervlak hechten, waarna het enzym PETase wordt afgescheiden (Yoshida et al., 2016). De bacterie maakt gebruik van uitstulpingen van het celmembraan om PETase beter af te scheiden aan het PET film (afbeelding 4). Hierbij wordt de esterbinding van PET gehydrolyseerd tot n moleculen mono(2-hydroxyethyl) tereftaalzuur (MHET). Dit is schematisch weergegeven in afbeelding 1. Volgens Yoshida et al. (2016) is dit op zowel micro- als macroschaal mogelijk.

Afbeelding 1: De hydrolyse van PET door PETase tot mono(2-hydroxyethyl) tereftaalzuur (Beerman, 2017; Yoshida et al., 2016).

Het relatief kleine MHET kan door de cel worden geabsorbeerd. Dit MHET wordt intracellulair snel afgebroken tot glycol en tereftaalzuur. Deze twee moleculen zijn relatief kleine organische

verbindingen die door het organisme gebruikt kunnen worden (Bornscheuer, 2016). Een gen, ‘‘Open Reading Frame’’ (afgekort: ORF) ISF6_0224 werd gevonden en gepurificeerd (Yoshida et al., 2016). ISF6_0224 kon MHET efficiënt hydrolyseren, maar vertoonde geen activiteit tegen de overige esterverbindingen. Daarom wordt het ISF6_0224 eiwit benoemd als MHETase. De reactie van MHET tot glycol en tereftaalzuur is schematisch weergegeven in afbeelding 2.

Afbeelding 2: Afbraak van MHET door MHETase tot tereftaalzuur en ethaan-1,2-diol (Beerman, 2017; Yoshida et al., 2016).

PETase heeft een active site die eruit ziet zoals in afbeelding 3 step I is weergegeven. De drie aminozuren aan het eiwit asparagine (Asp), histidine (His) en serine (Ser) voeren een

protonuitwisseling uit, waardoor serine een intermediair vorm met een enkel gebonden zuurstof en een extra vrije elektronenpaar, wat resulteert in een negatieve lading. Dit reageert met de

esterbinding, waardoor er twee losse delen ontstaan, namelijk:

1) Het enzym aan de zuurkant van MHET (met aan de andere kant de restketen van PET). Dit wordt in afbeelding 3 step II het Acyl-enzyme intermediate genoemd.

2) De andere restketen van PET eindigend in een OH-groep. Dit is geprotoneerd door aanwezig H2O in de omgeving.

Het Acyl-enzyme intermediate reageert met water door een hydrolysereactie. Water is ons nucleofiel in afbeelding 3 step II.

MHETase werkt volgens hetzelfde principe als PETase. Bij de active site van Asp-His-Ser vindt een protonuitwisseling plaats en het vrije elektronenpaar reageert met de esterbinding. Het Acyl-enzyme intermediate wordt vervolgens weer gehydrolyseerd.

Afbeelding 3: de enzymatische afbraak van een esterbinding (Pers. comm. F. Mutti, 31 oktober 2017).

Afbeelding 4: Ideonella sakaiensis geïncubeerd op een PET film. De lange draden zijn uitstulpingen van het celmembraan. Deze uitstulpingen verbinden de cellen met elkaar en met het PET-film. Waarschijnlijk dienen ze voor stabiliteit en effectievere afgifte van PETase (Gepakt van Yoshida, et al., 2016).

Yoshida et al. (2016) identificeerden "open reading frame" (ORF) ISF6_4831 in I. sakaiensis. Dit is een stuk gen dat codeert voor het enzym PETase. Deze ORF komt voor 51% overeen met een enzym uit Thermobifida fusca (TfH) dat ook in staat is om PET af te breken. Door gepurificeerde PETase van ISF6_4831 te incuberen op PET film bij 30°C ontstond er significante putvorming. Dit toont aan dat ISF6_4831 PET degradeert.

Yoshida et al. (2016) vergeleken de activiteit van dit ISF6_4831-eiwit met drie evolutionair afgeweken PET-hydrolytische enzymen, geïdentificeerd aan de hand van een fylogenetische boom die ze construeerden (figuur 5). Dit waren de enzymen ThF (afkomstig van Thermobifida Fusca), LCC (Leaf-branch Compost Cutinase) en FsC (F. solani Cutinase). De activiteit van ISF6_4831 tegen PET-film was 120, 5,5 en 88 keer zo hoog als die van TfH, LCC en FsC respectievelijk. Vanwege deze hoge activiteit is het enzym aangeduid als PET-hydrolase (PETase). PETase was ook actiever dan Tfh, LCC en FsC tegen gekristalliseerd PET uit commerciële PET flessen, al was de activiteit van alle enzymen lager. PETase presteerde voornamelijk ook beter bij lage temperaturen dan de enzymen van de andere microben.

Afbeelding 5: Fylogenetische boom van PET hydrolytische enzymen (gepakt van Yoshida, et al., 2016)

Afgebroken PET wordt snel afgebroken tot glycol en tereftaalzuur. Een ander gen, ORF ISF6_0224 werd gevonden en gepurificeerd. ISF6_0224 kon MHET efficiënt hydrolyseren, maar vertoonde geen activiteit tegen de overige esterverbindingen. Daarom wordt het ISF6_0224 eiwit MHETase

genoemd.

Door Tanasupawat et al. (2016) zijn de omstandigheden onderzocht waarin I. sakaiensis kan gedijen en PET kan degraderen. Temperatuur, zoutgehalte en pH zijn de belangrijkste factoren voor I. sakaiensis gebleken (Tanasupawat et al., 2016). De temperatuur moet tussen de 15 en 42˚C zijn (optimaal bij 30 tot 37˚C). Het zoutgehalte van de omgeving moet tenminste 3% zijn. De pH moet tussen de 5,5 tot 9,0 zijn en is optimaal bij pH 7,0 tot 7,5.

Op welke plaatsen in de oceaan is I. sakaiensis toepasbaar voor de afbraak van

PET?

Door de hierboven genoemde optimale omstandigheden voor I. sakaiensis te combineren met verspreiding van PET in de oceaan, kan bekeken worden wat de optimale plek is om I. sakaiensis te implementeren. Daarom wordt nu bekeken waar PET zich bevindt in de oceaan.

Aan de hand van de dataset van Law et al. (2010) is er geconcludeerd dat de plastic

concentratie afhankelijk is van de windkracht. Reisser et al. (2014) hebben vervolgens een verwachte samenhang tussen concentratie PET en windkracht opgesteld met de formule:

N=e

Waar

N

z

Volgens Kukulka et al. (2012) kan de vervalsnelheid beschreven worden door:

λ=W

/(1.5U

K H

)

Waar Uzw=¿ windsnelheid wrijving water

K=

¿

Hs=¿ significante golfhoogte

Alleen Hs is afhankelijk van de windkracht en zo kan de N ( plastic hoeveelheid) en Hs (gerelateerd aan windkracht volgens de beaufortschaal) aan elkaar gekoppeld worden. Reisser et al. (2014) hebben deze formule getest en vervolgens geconcludeerd dat het grootste deel van de PET zich in de eerste 5 meter bevindt.

Ericksen et al. (2014) hebben vervolgens onderzocht waar plastic gevonden wordt in de oceaan en het blijkt zich voornamelijk te verzamelen in 5 gyres. In hun onderzoek wordt onderscheid gemaakt tussen micro-en macroplastics, gewicht en hoeveelheid, waardoor het een volledig

overzicht geeft van de verdeling in grootte in de oceaan (zie afbeelding 7 & 8). Dit onderzoek is gebaseerd op transecten in de oceaan waar de concentraties plastics zijn gemeten en vervolgens geëxtrapoleerd in een model. Aangezien de concentraties zijn gebaseerd op modellen, kan de werkelijk te vinden concentratie hiervan afwijken. In ons onderzoek zal worden aangenomen dat er in de gebieden waar veel macroplastic te vinden zijn, ook een hoge hoeveelheid PET is, voornamelijk in de vorm van PET-flesjes. Verder is in de oceaan de pH 8,1 tot 8,2, het zoutgehalte gehalte 3,1 tot 3,8%, en de temperatuur tussen de 0 en 26˚C (zie afbeelding 6), daarnaast is er in de oceaan een aerobe omgeving.

Afbeelding 6; Mean Annual Sea Surface Temperature 2009-2013 (UNEP World Conservation Monitoring Centre, 2015)

Afbeelding 7; Modelresultaten van Ericksen et al. (2014) met het gewicht en distributie van plastics in vier grootteklassen (g/km2; zie legenda). Het grootste deel van het gewicht bevindt zich in de grootste klasse.

Afbeelding 8; Modelresultaten van Ericksen et al. (2014) met de hoeveelheid en distributie van plastics in vier grootteklassen (g/km2; zie legenda). De meeste deeltjes bevinden zich in de kleinste klasse.

Methode

In ons onderzoek zijn we op zoek gegaan naar een duurzaamheidsprobleem. We kwamen er al snel achter dat we plastics wilden gaan onderzoeken. We betrokken dit op de oceaan, aanvankelijk de Noord Atlantische Gyre. Hierover was veel data beschikbaar en dit maakte ons onderzoek meer interdisciplinair. We wilden biodegradatie van plastics bekijken, om een modern en interdisciplinair onderzoek op te kunnen zetten. We moesten hierin ook nog kijken welke microben we wilden gebruiken. Een belangrijke stap in ons onderzoek was het kiezen van de plasticsoort waarop we ons wilden focussen. Aanvankelijk kozen we voor polyhydroxyalkanoaten: PHA’s. Dit is een goed te degraderen plastic, waarvan de productie nog sterk stijgt. We hebben uiteindelijk dit plan moeten laten varen, omdat PHA’s nog te weinig terug te vinden zijn in oceanen en daarom (nog) niet relevant zijn. De keuze was tussen biodegradable plastics en poly(ethylene). Tijdens het interview met Francesco Mutti, een biochemicus van het HIMS (Van 't Hoff Institute for Molecular Sciences) te Amsterdam, werd duidelijk dat polyethylene op dit moment nog niet biologisch afbreekbaar is. Wel werden we gewezen op de nieuwste ontwikkelingen in het vak, namelijk de biologische

afbreekbaarheid van polyethyleentereftalaat (PET). Hierdoor hebben we voor de afbraak van PET gekozen. Dit is nog zeer recent onderzoek, waarbij een microob al snel gekozen was, omdat alleen over I. sakaiensis data beschikbaar is. Na een tip uit een interview kwamen we erachter dat de Noord Atlantische Gyre waarschijnlijk niet de juiste omstandigheden had voor de opzet van ons onderzoek, aangezien de Noord Atlantische gyre wel veel plastic bevat, maar redelijk weinig nutriënten (de Jong, 2017). Hierdoor hebben we besloten om aan de hand van een aantal belangrijke factoren, namelijk temperatuur, zoutgehalte, pH en distributie van plastics te onderzoeken en kaartjes te maken van waar ons onderzoek opgezet zou kunnen worden. De conclusie is dat we onderzoeken waar in de oceaan microben ingezet zouden kunnen worden om PET af breken.

Het (literatuur)onderzoek

De chemische afbraak van PET is eerst onderzocht door een gehouden interview met Francesco Mutti (pers. comm., 8 november 2017), hoofd van de biokatalyse groep van het HIMS. Hij vertelde over hoe de enzymatische afbraak globaal te werk ging en verschafte afbeeldingen van zijn collegeslides over dit onderwerp. Hierna is literatuuronderzoek gedaan naar dit onderwerp. Uit verschillende bronnen is gehaald hoe de biologische degradatie van PET in zijn gang gaat.

De biologische afbraak is besproken in een interview met Helge Niemann (pers. comm., 16 november 2017), een onderzoeker bij het Nederlands Instituut voor Zee Onderzoek (NIOZ). Het gesprek begon over I. sakaiensis en wat het organisme zo speciaal maakt, dit komt voornamelijk neer op het feit dat het over een enzym beschikt dat nog heel goed werkt bij relatief lage temperaturen. Al snel ging het over de toepassing van het organisme in de oceaan. Hier waren veel vragen over, zo wisten we namelijk niet of een organisme dat van het land komt in de oceaan kan overleven. En als het zou overleven, zou het dan nog steeds PET afbreken? En zou het schade kunnen aanrichten aan het ecosysteem? Helaas had hij hier geen antwoord op. De maritieme microbiologie is namelijk nog een jong onderzoeksveld wat pas net over de instrumenten beschikt om grootschalig onderzoek te doen (zoals next generation sequencing). Daarom is het voor ons belangrijk dat wij goed doorhebben

wat wel en niet bekend is. Het is zaak om goed aan te geven welke conclusies we kunnen trekken en waar we alleen over kunnen speculeren.

Toch hebben we een deel onderzoek kunnen doen, waarvan een deel in het programma ArcGIS (ESRI, 2011). De distributie van plastic is gecombineerd met de temperatuur (> 20˚C) die de overlevingskansen en functionaliteit van het micro-organisme en enzymen bevordert (Yoshida, 2016). Door middel van de raster calculator in ArcGIS zijn de gebieden met een Sea Surface

Temperature (SST) van 20˚C geselecteerd en weergegeven met de plasticdistributie als in Ericksen et al. (2014). De gemiddelde SST gemeten door NASA aan de hand van remote sensing tussen 2009-2013 is gebruikt (UNEP World Conservation Monitoring Centre, 2015). Er is gekozen voor een gemiddelde temperatuur ondanks de variatie in seizoenen. Aangezien het micro-organisme nog overleeft in koudere omstandigheden, hoewel het enzym niet meer functioneel is, dit de oppervlakte van de bruikbare gebieden vergroot.

We hebben gekozen om geen empirisch onderzoek te doen, maar alleen literatuuronderzoek in combinatie met interviews. Dit hebben we gedaan, omdat empirisch onderzoek met levende organismen een bepaalde expertise vereist waar wij niet over beschikken. Daarnaast is het ook een proces wat veel tijd en materiaal kost, beiden dingen die wij niet hebben.

Resultaten

Recentelijk is er een nieuw organisme gevonden dat PET kan afbreken, I. sakaiensis. Dit organisme is afkomstig van een PET-recycling terrein en is in staat om PET op relatief hoge snelheid af te breken bij een temperatuur van 20 tot 45°C. Bij 30° C werd een PET-film binnen 6 weken bijna geheel

afgebroken, meerdere malen sneller dan andere PET-afbrekende organismen. Echter is het vooral door de lage temperaturen waaronder het werkt een veelbelovend organisme om PET in de oceaan af te breken.

I. sakaiensis breekt PET af door middel van het enzym PETase die de esterverbindingen verbreekt met hydrolyse tot MHET. Dit product is klein genoeg om geabsorbeerd te worden door de het celmembraan van I. sakaiensis. Eenmaal opgenomen in de cel, wordt MHET ook

gemetaboliseerd. Dit vindt plaats dankzij het enzym MHETase. Dit enzym zet MHET om in tereftaalzuur (TPA) en (ethyleen)glycol (EG), ook door middel van hydrolyse.

Tanasupawat et al (2016) beschrijven in hun taxonomisch onderzoek naar I. sakaiensis, dat het een aeroob, mesofiel organisme is dat geen kiemcellen kan vormen. Verder groeit I. sakaiensis bij een pH van 5,5 tot 9,0 (optimaal bij pH 7,0 tot 7,5) en bij een temperatuur van 15 tot 42°C (optimaal bij 30-37°C). I. sakaiensis groeit niet onder anaerobe omstandigheden of bij een

zoutgehalte van 3% of lager. In de oceaan is pH 8,1 tot 8,2 en het zoutgehalte gehalte is 3,1 tot 3,8%, daarnaast biedt de oceaan een aerobe omgeving aan. De verschillen in pH zijn niet significant volgens de data van Yoshida et al. (2016). Het zoutgehalte in de hele oceaan schikt I. sakaiensis. In afbeelding 9 is weergegeven waar, in het gebied met T>20˚C, de plastic concentratie macroplastics (>200mm) in de oceaan het hoogst is. Hieruit valt op te maken dat de Caribische zee en grote delen van de Indische oceaan beschikken over een hoge concentratie plastic en temperaturen hoger dan 20˚C.

Afbeelding 9: De ideale omstandigheden voor I. sakaiensis, bepaald aan de hand van temperatuur. Witte delen oceaan zijn temperaturen <20˚ C, ongeschikt voor I. sakaiensis. Het gekleurde gedeelte geeft de

Discussie en conclusie

De mogelijkheid om I. sakaiensis of het PETase enzym te gebruiken om PET in de oceaan af te breken is iets wat nog weinig genoemd wordt in wetenschappelijke literatuur. Pas in 2016 werd er voor het eerst onderzoek gedaan naar I. sakaiensis en PET-ase om PET te degraderen, en nog nooit in marine omstandigheden (Yoshida et al., 2016) Dit zorgt ervoor dat er nog weinig feitelijke kennis is om onderbouwde conclusie aan te koppelen. Er kan een positief scenario geschetst worden op basis van de taxonomische studie door Tanasupawat et al. (2016). Het is namelijk zo dat I. sakaiensis in het lab de temperatuur, het zoutgehalte en de pH, zoals die voorkomen in bepaalde delen van de oceaan, afzonderlijk overleeft. Er bevindt zich ook veel plastic afval op de plekken in de oceaan waar deze omstandigheden voorkomen. Daarnaast is het organisme in staat om met het PETase enzym, dat ook goed functioneert met de temperaturen die in de oceaan voorkomen, hoog-gekristalliseerd PET af te breken. In dit positieve scenario kan I. sakaiensis gebruikt worden om PET in de oceaan af te breken. Veelbelovende locaties zijn de Caribische Zee en grote delen van de Indische Oceaan, waar de temperatuur van het water en plastic concentraties hoog zijn. Echter zijn er voor bovenstaand scenario erg veel aannames nodig die eigenlijk niet gemaakt kunnen worden.

Ten eerste is het niet zeker of PET zich verzamelt op dezelfde plekken als ander plastic. Daarnaast is het ook onzeker wat er gebeurt met PET zodra het is afgebroken tot kleine stukken (microplastic). Het is aannemelijk dat het PET zal gaan zinken wanneer het wordt afgebroken. Dit omdat, zoals eerder besproken, PET alleen blijft drijven wanneer het lucht bevat (zoals in een

drinkflesje). Wanneer het PET gaat zinken zal ook de temperatuur van het oceaanwater snel afnemen waardoor I. sakaiensis niet meer optimaal werkt, of zelfs niet overleeft. In dit onderzoek is er

aangenomen dat de concentratie PET hoog is waar plastic zich verzameld in de oceaan, waardoor er voor I. sakaiensis voldoende PET aanwezig is. Er zijn dus geen cijfers van de concentratie PET in marine omstandigheden, wat dan ook verder moet worden onderzocht.

Ten tweede is I. sakaiensis of een vergelijkbaar organisme nooit in oceanische

omstandigheden getest en kan dus niet worden gezegd of het daar zou overleven en wat voor impact het heeft op het ecosysteem. Het zou bijvoorbeeld kunnen bezwijken onder de druk van een

competitief ecosysteem. Daarnaast hangt de overlevingskans van I. sakaiensis in de oceaan af van de nutriënten die het nodig heeft om te overleven, waar weinig over bekend is. Bovendien kan het inbrengen van een vreemd organisme in een ecosysteem leiden tot afname van de biodiversiteit (Derraik, 2002) en is het onbekend of I. sakaiensis deze schade kan aanrichten.

In het geval dat I. sakaiensis wel kan overleven in (bepaalde delen van) de oceaan, weten we niet of het PET zal gebruiken als een bron van koolstof en dus of het de moeite zal nemen om het af te breken. Ook weten we niet of het in de oceaan zal hechten aan het PET-oppervlak. Daarbij komt dat het niet zeker is of PETase werkzaam is in de oceaan.

Verder is er over de precieze werking van het PETase eiwit nog weinig bekend. Hoe het bijvoorbeeld aan een substraat bindt is nog onbekend. Hiervoor is de driedimensionale kristalstructuur van het eiwit nodig. Het is ook nog niet bekend hoe het enzym omgaat met de lage flexibiliteit van hoog gekristalliseerd PET bij temperaturen van 20 - 45°C.

Als I. sakaiensis niet overleeft in de oceaan en/of een ernstige schade aanbrengt aan het ecosysteem, bestaat er de optie om het PETase en/of MHETase gen te implementeren in een maritiem (micro-)organisme. Of er een organisme is dat hier geschikt voor is en of een

gast-organisme de genen überhaupt zal gebruiken. Ook hier weten we niet of er ecologische schade zou optreden.

Er moet nog veel onderzoek worden gedaan naar I. sakaiensis in en buiten het lab. Eerst zou er onderzoek in een nagebootste oceaan in het lab moeten worden gedaan waarna de bacterie eventueel kan worden geïmplementeerd in een van de onderzochte delen van de oceaan. Daarbij zal er meer onderzoek gedaan moeten worden naar de omstandigheden waarin I. sakaiensis nog PET kan afbreken en kan voortplanten. Nu is er slechts bekend wanneer I. sakaiensis optimaal kan werken, maar is er nog niks bekend wat er zal gebeuren als dit niet het geval is. Daarbij zal er ook meer onderzoek gedaan moeten worden naar het enzym PET-ase. Er zal misschien een ander

organisme zijn die het enzym PET-ase draagt of kan dragen en daarmee goed kan overleven in marine omstandigheden. Ook zal de driedimensionale kristalstructuur van PETase bijdragen aan een beter begrip van PET afbraak. Als laatst is het ook essentieel om te onderzoeken waar specifiek PET zich bevindt in de oceaan en wat er gebeurt als het wordt afgebroken. Dit kan namelijk grote invloed hebben op de omstandigheden waarbij PET moet worden gedegradeerd door organismen.

References

Andrady, A. L. (2011). Microplastics in the marine environment. Marine pollution bulletin, 62(8), 1596-1605.

Andrady, A. L. (2015). Persistence of plastic litter in the oceans. In Marine anthropogenic litter (pp. 57-72). Springer International Publishing.

Awaja, F., & Pavel, D. (2005). Recycling of PET. European Polymer Journal, 41(7), 1453-1477.

http://dx.doi.org/10.1016/j.eurpolymj.2005.02.005

Beerman, B. (24-12-2017); Chemdraw.

Derraik, J. G. (2002). The pollution of the marine environment by plastic debris: a review. Marine pollution bulletin, 44(9), 842-852.

EA (2001) Plastics in the Environment. Environment Agency

Emadian, S. M., Onay, T. T., & Demirel, B. (2017). Biodegradation of bioplastics in natural environments. Waste Management, 59, 526-536.

Eriksen, M., Lebreton, L. C., Carson, H. S., Thiel, M., Moore, C. J., Borerro, J. C., ... & Reisser, J. (2014). Plastic pollution in the world's oceans: more than 5 trillion plastic pieces weighing over 250,000 tons afloat at sea. PloS one, 9(12), e111913.

ESRI 2011. ArcGIS Desktop: Release 10.x. Redlands, CA: Environmental Systems Research Institute. Francesco Mutti (pers. comm. 31 oktober 2017)

Femke de Jong (pers. comm. 3 november 2017)

Gregory, M. R. (1996). Plastic ‘scrubbers’ in hand cleansers: a further (and minor) source for marine pollution identified. Marine Pollution Bulletin, 32(12), 867-871.

Gregory, M. R., & Andrady, A. L. (2003). Plastics in the marine environment. Plastics and the Environment, 379, 389-90.

Jambeck, J. R., Geyer, R., Wilcox, C., Siegler, T. R., Perryman, M., Andrady, A., ... & Law, K. L. (2015). Plastic waste inputs from land into the ocean. Science, 347(6223), 768-771.

Kukulka, T., Proskurowski, G., Morét Ferguson, S., Meyer, D. W., & Law, K. L. (2012). The effect of ‐ wind mixing on the vertical distribution of buoyant plastic debris. Geophysical Research Letters, 39(7).

Laist, D. W. (1987). Overview of the biological effects of lost and discarded plastic debris in the marine environment. Marine pollution bulletin, 18(6), 319-326.

Law, K. L., Morét-Ferguson, S., Maximenko, N. A., Proskurowski, G., Peacock, E. E., Hafner, J., & Reddy, C. M. (2010). Plastic accumulation in the North Atlantic subtropical gyre. Science, 329(5996), 1185-1188.

Li, W. C., Tse, H. F., & Fok, L. (2016). Plastic waste in the marine environment: A review of sources, occurrence and effects. Science of the Total Environment, 566, 333-349.

Mighani, H. (2012). Synthesis of Thermally Stable Polyesters (3rd ed.). INTECH Open Access Publisher. North, Emily J.; Halden, Rolf U. (1 January 2013). "Plastics and environmental health: the road ahead". Reviews on Environmental Health. 28 (1): 1–8. doi:10.1515/reveh-2012-0030.

Reisser, J., Slat, B., Noble, K., Du Plessis, K., Epp, M., Proietti, M., ... & Pattiaratchi, C. (2015). The vertical distribution of buoyant plastics at sea: an observational study in the North Atlantic Gyre. Biogeosciences, 12(4), 1249.

Tanasupawat, S., Takehana, T., Yoshida, S., Hiraga, K., & Oda, K. (2016). Ideonella sakaiensis sp. nov., isolated from a microbial consortium that degrades poly (ethylene terephthalate). International

journal of systematic and evolutionary microbiology, 66(8), 2813-2818.

Thompson, R. C. (2006). Plastic debris in the marine environment: consequences and solutions. Marine Nature Conservation in Europe, 193, 107-115.

Thompson, R. C., Swan, S. H., Moore, C. J., & Vom Saal, F. S. (2009). Our plastic age.

UNEP World Conservation Monitoring Centre (2015): Mean Annual Sea Surface Temperature 2009-2013. Opgevraagd op 13 december 2017 van http://data.unep-wcmc.org/datasets/36

Wei, R., & Zimmermann, W. (2017). Microbial enzymes for the recycling of recalcitrant petroleum‐ based plastics: how far are we?. Microbial Biotechnology.

Wu, W., Yang, J., & Criddle, C. (2016). Microplastics pollution and reduction strategies. Frontiers Of Environmental Science & Engineering, 11(1), 3-6. http://dx.doi.org/10.1007/s11783-017-0897-7

Yoshida, S., Hiraga, K., Takehana, T., Taniguchi, I., Yamaji, H., & Maeda, Y. et al. (2016). A bacterium that degrades and assimilates poly(ethylene terephthalate). Science, 351(6278), 1196-1199.