UvA-DARE is a service provided by the library of the University of Amsterdam (https://dare.uva.nl)
Microparticles: mediators of cellular and environmental homeostasis
Böing, A.N.
Publication date
2011
Link to publication
Citation for published version (APA):
Böing, A. N. (2011). Microparticles: mediators of cellular and environmental homeostasis.
General rights
It is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of the author(s) and/or copyright holder(s), other than for strictly personal, individual use, unless the work is under an open content license (like Creative Commons).
Disclaimer/Complaints regulations
If you believe that digital publication of certain material infringes any of your rights or (privacy) interests, please let the Library know, stating your reasons. In case of a legitimate complaint, the Library will make the material inaccessible and/or remove it from the website. Please Ask the Library: https://uba.uva.nl/en/contact, or a letter to: Library of the University of Amsterdam, Secretariat, Singel 425, 1012 WP Amsterdam, The Netherlands. You will be contacted as soon as possible.
Chapter 11
Doel van dit proefschrift
In dit proefschrift is onderzocht waarom cellen micropartikels afsnoeren, en op welke manier micropartikels bijdragen aan de homeostase van cellen en organismen.
Micropartikels en cellulaire overleving
In Hoofdstuk 2 van dit proefschrift is onderzocht of het afsnoeren van micropartikels door endotheelcellen kan bijdragen aan het overleven van deze cellen. Als het afsnoeren van micropartikels werd geremd dan nam de hoeveelheid intracellulair caspase-3 toe, vooral in aanwezigheid van staurosporine dat geprogrammeerde celdood (apoptose) kan veroorzaken. De toename van intracellulair caspase-3 leidde tot apoptose en het loslaten van de cellen. Het afsnoeren van micropartikels die caspase-3 bevatten lijkt daardoor bij te dragen aan het overleven van de cellen.
Om nader te onderzoeken of cellen daadwerkelijk micropartikels gebruiken om het schadelijke caspase-3 te verwijderen, zijn in Hoofdstuk 3 MCF-7 cellen onderzocht. Dit is een borsttumorcellijn, waarvan bekend is dat het geen actief caspase-3 heeft en geen membraanblaasjes kan vormen1. Hoewel in de literatuur het vormen van membraanblaasjes
en het afsnoeren van micropartikels vaak worden gebruikt als synoniem, is het onbekend of het ontstaan van membraanblaasjes daadwerkelijk wordt gevolgd door het afsnoeren van micropartikels. Zo is ook voor MCF-7 cellen onbekend of deze cellen micropartikels kunnen afsnoeren. In Hoofdstuk 3 zijn MCF-7 cellen getransfecteerd met een 29 kDa vorm van caspase-3, omdat deze vorm zichzelf kan “knippen” waardoor actief caspase-3 ontstaat2. Terwijl de niet-getransfecteerde cellen nauwelijks micropartikels afsnoerden,
snoerden de met caspase-3-getransfecteerde cellen wel micropartikels af. Met andere woorden, de expressie van caspase-3 was sterk geassocieerd met het afsnoeren van micropartikels. De micropartikels bevatten caspase-3 en zijn bovendien, in vergelijking tot de cellen, verrijkt in caspase-3 activiteit. Deze resultaten bevestigen de hypothese dat cellen de micropartikels kunnen gebruiken om gevaarlijke en overbodige stoffen af te voeren om op deze manier zelf gezond te blijven.
In Hoofdstuk 4 is onderzocht of ook micropartikels van ouder wordende bloedplaatjes caspase-3 bevatten. Dit is een interessante vraag omdat micropartikels afkomstig van bloedplaatjes de meest voorkomende zijn in het menselijk bloed. De
Algemene discussie en samenvatting
11
resultaten tonen aan dat ook deze micropartikels caspase-3 bevatten. Dit duidt erop dat het afsnoeren van caspase-3 bevattende micropartikels een algemeen mechanisme is, wat niet beperkt is tot kernhoudende cellen, maar ook geldt voor kernloze cellen.
Het verpakken van potentieel gevaarlijke of overbodige stoffen in micropartikels lijkt een algemeen mechanisme te zijn dat door cellen wordt gebruikt om te kunnen overleven. Eerder heeft de Gassart aangetoond dat ook exosomen afkomstig van diverse cellen een caspase-3-achtige activiteit bevatten, en ook hij postuleerde dat het verpakken van deze activiteit in exosomen een mechanisme is om het overleven van cellen te bevorderen3. Er zijn diverse andere studies waarin wordt aangetoond dat micropartikels zijn
verrijkt in voor cellen gevaarlijke of overbodige stoffen, ten opzichte van de cellen. Voorbeelden zijn het complement C5b-9 complex4 en cytostatica5;6. Door micropartikels af
te snoeren en exosomen af te geven die hoge concentraties van dergelijke stoffen bevatten, beschermen de cellen zich tegen het ophopen van gevaarlijke of zelfs dodelijke concentraties stoffen in de cel. Het verpakken van gevaarlijke stoffen in micropartikels en exosomen lijkt dus bij te dragen aan het overleven van cellen en mogelijk ook aan de bescherming van de omgeving tegen de blootstelling aan deze stoffen.
Andere mogelijke functies van micropartikels
Meerdere studies hebben aangetoond dat micropartikels verschillende processen kunnen initiëren of bevorderen, zoals stolling, ontsteking en angiogenese. Alhoewel deze processen vaak worden geassocieerd met pathologische omstandigheden, zijn ze uiteraard ook van belang voor de normale bescherming van een organisme tegen gevaren uit de omgeving. In veel ziektebeelden zijn processen als stolling, ontsteking en angiogenese uit balans. Een voorbeeld is zwangerschapsvergiftiging of preeclampsie, een ziekte die wordt gekenmerkt door een verhoogde stollingsneiging, een verhoogde ontstekingsactiviteit en een verlaagde angiogenese respons in vergelijking tot gezonde zwangeren. Hoewel de exacte onderliggende ontstaansmechanismen van preeclampsie niet bekend zijn, zijn er aanwijzingen dat een zuurstoftekort in de placenta leidt tot een verhoogde afgifte van placenta “debris” aan het bloed van de moeder7. Dit ”debris”, beter bekend als
ontstaan van preeclampsie, welke leidt tot een verminderde functie van het endotheel, en een verstoorde stolling, ontsteking en angiogenese8.
In de Hoofdstukken 5 en 6 is het verband onderzocht tussen circulerende micropartikels, angiogenese en ontsteking in preeclampsie. Uit Hoofdstuk 5 blijkt dat plasma monsters van preeclamptische patiënten hogere aantallen micropartikels bevatten die de receptor voor vascular endothelial growth factor (VEGF-R1), ook wel FMS-like tyrosine kinase (Flt-1) genoemd, exposeren ten opzichte van plasma monsters van gezonde zwangeren. Deze Flt-1- exposerende micropartikels zijn afkomstig van bloedplaatjes en de placenta. Wij veronderstellen dat door het wegvangen van het in plasma aanwezige VEGF door Flt-1-exposerende micropartikels minder VEGF beschikbaar is om te kunnen binden aan VEGF receptoren op endotheelcellen, hetgeen uiteindelijk leidt tot minder angiogenese. In een onlangs verschenen onderzoek wordt eenzelfde model gepostuleerd. Deze onderzoekers laten zien dat er hoge concentraties endogline-exposerende micropartikels aanwezig zijn in een perfusaat afkomstig van gezonde placenta’s9. Endogline is een
receptor voor “transforming growth factor-β” (TGF-β), dat, net als VEGF, een angiogenese-bevorderende (groei)factor is. Dus, endogline-exposerende micropartikels remmen, evenals micropartikels met Flt-1, waarschijnlijk de angiogenese door een angiogenese-bevorderende factor te binden voordat deze kan binden aan een receptor op endotheelcellen9.
In Hoofdstuk 6 is één van de mogelijke mechanismen onderzocht waarmee micropartikels de ontstekingsactiviteit in preeclampsie zouden kunnen beïnvloeden. Micropartikels uit het plasma van preeclamptische patiënten en gezonde zwangeren zijn toegevoegd aan endotheelcellen, en vervolgens is de expressie onderzocht van ontstekingsgerelateerde genen. Onze resultaten laten echter geen toename zien in de expressie van de onderzochte genen. Anderen hebben aangetoond dat het toevoegen van STMB aan monocyten wel een toename liet zien van de expressie van ontstekingsgerelateerde genen, waaronder interleukine (IL)-12p70, tumor-necrose factor (TNF)-α, IL-8 en IL-610;11. Aangezien STBM ook kunnen binden aan monocyten in het bloed10, kan het zijn dat in experimenten waarin micropartikels uit plasma worden
geïsoleerd, de meest interessante micropartikels niet meer los aanwezig zijn omdat deze al gebonden zijn aan bloedcellen of endotheelcellen in vivo.
Algemene discussie en samenvatting
11
Micropartikels en stolling
Stolling draagt bij aan de homeostase van een organisme door het bloedverlies te beperken en de kans te verkleinen dat ziekteverwekkers kunnen binnendringen. Micropartikels kunnen de stolling op verschillende manieren beïnvloeden, zoals door het exposeren van negatief geladen fosfolipiden waaraan stollingsfactoren kunnen binden, of/en door het exposeren van weefselfactor (tissue factor of TF). Er zijn diverse mechanismen beschreven die de stollingsactiviteit van het TF molecuul kunnen beïnvloeden, waaronder het vormen van complexen bestaande uit twee TF moleculen12, de aanwezigheid van negatief geladen
fosfolipiden als fosfatidylserine (PS) en fosfatidylethanolamine (PE) in de
membraanomgeving van TF13-17, of een door protein disulfide isomerase (PDI)
gemedieerde verandering in de conformatie van het TF molecuul18.
In Hoofdstuk 7 is de fosfolipidensamenstelling onderzocht van endotheelcel micropartikels en hun vermogen om trombusvorming in vivo te initiëren in een veneus stase model in ratten. Micropartikels van IL-1α geactiveerde endotheelcellen exposeren TF en initiëren trombusvorming in vivo, terwijl micropartikels van rustende endotheelcellen geen stollingsactiviteit vertoonden. De micropartikels van geactiveerde endotheelcellen bleken bovendien verrijkt te zijn in PS en PE ten opzichte van micropartikels van niet-geactiveerde endotheelcellen. Omdat PS en PE beide de stollingsactiviteit van TF kunnen stimuleren13-17, tonen deze resultaten aan dat geactiveerde endotheelcellen micropartikels
kunnen afsnoeren die een uitgesproken stollingsbevorderend “profiel” hebben. Hoewel ook de micropartikels van de rustende endotheelcellen PS en PE exposeren, initiëren deze micropartikels geen trombusvorming in de rat, wat suggereert dat niet alleen de aanwezigheid van deze fosfolipiden maar ook die van TF een voorwaarde is om trombusvorming door micropartikels te kunnen initiëren.
In Hoofdstuk 8 wordt aangetoond dat gezuiverde plasma membranen en micropartikels beide tegelijkertijd zowel een stollingsactieve vorm van TF als een niet-stollingsactieve vorm van TF bevatten. Tevens tonen we aan dat de niet-niet-stollingsactieve vorm van TF en PDI samen aanwezig zijn in rafts van zowel plasmamembranen als micropartikels, terwijl de stollingsactieve vorm van TF zich niet in de rafts bevindt. Wij veronderstellen dat, mocht PDI een rol spelen bij het reguleren van de stollingsactiviteit van TF, dit gaat in twee stappen. In de eerste stap wordt het TF door PDI omgezet van een
niet-stollingsactieve conformatie in een niet-stollingsactieve conformatie. Deze stap vindt plaats in de rafts. Het stollingsactieve TF kan hier nog niet daadwerkelijk de stolling activeren omdat er geen negatief geladen fosfolipiden aanwezig zijn die de activiteit van TF kunnen versterken en waaraan andere stollingsfactoren kunnen binden. Vervolgens verplaatst het TF, dat zich in de stollingsactieve conformatie bevindt, zich vanuit de rafts naar de overige membraandomeinen die -ten opzichte van de rafts- verrijkt zijn in PS en PE, waardoor de stollingsactiviteit van het TF wordt geïnitieerd. Omdat PDI ook de stollingsactiviteit van TF kan reduceren via een conformatieverandering18 en tevens de aanwezigheid van PS op
het membranen kan verlagen19, zijn er aanvullende studies nodig om de bijdrage van PDI
aan de stollingsactiviteit van TF verder te ontrafelen.
In Hoofdstuk 9 is onderzocht of een alternatief gesplicede vorm van TF (asTF) is geassocieerd met micropartikels, en is er gekeken of deze vorm van TF stollingsbevorderende eigenschappen heeft. Micropartikels, afkomstig van cellen die asTF tot expressie brengen, bevatten geen asTF. In tegenstelling tot andere onderzoekers20;21
tonen we aan dat asTF niet wordt gesecreteerd en geen stollingsbevorderende eigenschappen heeft. Dit laatste sluit niet uit dat asTF betrokken is bij andere TF-afhankelijke processen, zoals angiogenese22-24.
Klinische relevantie en toekomstige ontwikkelingen
Er is toenemende interesse in de biologische relevantie van micropartikels en andere, van cellen afkomstige, vesicles. De eerste hoofdstukken van dit proefschrift laten resultaten zien die de hypothese bevestigen dat micropartikels betrokken zijn bij het in stand houden van cellulaire homeostase en dus bij het “gezond” houden van de cellen. Daarnaast wordt, door het verpakken van schadelijke stoffen in micropartikels, ook de omgeving beschermd tegen de blootstelling aan deze stoffen. Dus het verpakken van schadelijke stoffen in micropartikels, gecombineerd met efficiënte klaringsmechanismen is een elegant systeem van cellen om gezond te blijven zonder het organisme te belasten. Wanneer er onderzoek wordt gedaan naar de gezondheidsstatus van cellen is het dus zinvol om niet alleen naar de cellen zelf te kijken, maar ook naar de (inhoud van de) micropartikels welke door de cellen worden afgesnoerd. Als bijvoorbeeld endotheelcellen in vitro worden behandeld met een klinisch relevante hoeveelheid simvastatine, een cholesterol verlagend medicijn dat de kans
Algemene discussie en samenvatting
11
op cardiovasculaire aandoeningen vermindert, dan zijn deze cellen ogenschijnlijk niet te onderscheiden van onbehandelde cellen. De met statine behandelde cellen lijken gezond, wat mag worden verwacht op basis van de gunstige effecten van statines in vivo. Toch worden in aanwezigheid van statine twee tot drie keer meer caspase-3 bevattende micropartikels afgesnoerd door de cellen25. Dit suggereert dat de cellen statine
klaarblijkelijk ervaren als een vorm van extracellulaire stress en dit compenseren door meer caspase-3 bevattende micropartikels af te snoeren. Bij andere studies, waarin hogere concentraties statines worden gebruikt, zijn ook nadelige effecten van statines beschreven, wat onze waarneming versterkt dat de cellen misschien minder gezond zijn dan ze lijken te zijn. Omdat ook micropartikels van niet-kernhoudende cellen, zoals bloedplaatjes, caspase-3 bevatten, lijkt het afgeven van caspase-caspase-3 in de vorm van micropartikels een algemeen cellulair beschermingsmechanisme. Mogelijk zijn cellen die meer micropartikels af kunnen snoeren beter bestand tegen bijvoorbeeld cytostatica of statines dan cellen die nauwelijks micropartikels kunnen afsnoeren.
Het feit dat micropartikels een rol lijken te spelen bij het handhaven van de cellulaire homeostase, en bovendien verschillende processen bevorderen die betrekking hebben op het beschermen van het organisme, zoals stolling, ontsteking en angiogenese, geeft een mooie en relevante combinatie van functies. Maar het moet wel duidelijk zijn dat het hier altijd gaat om een balans. Als de balans iets verschuift, dan zijn micropartikels niet langer meer “goed” voor het organisme, maar kunnen ze bijdragen aan het ontwikkelen of verergeren van ziekten, zoals de aanwezigheid van TF-exposerende micropartikels in bloed die betrokken kunnen zijn bij het veroorzaken van diffuse intravasale stolling of veneuze trombose.
Zoals de resultaten van Hoofdstuk 8 laten zien, bevatten micropartikels twee vormen van TF, een stollingsactieve vorm en een stollingsinactieve vorm. De functie van het stollingsinactieve TF op micropartikels is nog niet bekend. Dit maakt het onderzoek complex, maar leidt wel tot een aantal interessante vragen zoals: zijn beide vormen van TF aanwezig op/in micropartikels van bijvoorbeeld tumorcellen en zijn beide vormen van TF overdraagbaar op andere cellen, wat is de functie van de niet-stollingsactieve vorm van TF, is deze activiteit overdraagbaar op cellen, enz.
De detectie van micropartikels is nog steeds erg lastig door hun geringe grootte en grote heterogeniteit. Flowcytometrie is nu de meest gebruikte techniek om micropartikels te detecteren, maar deze techniek kan alleen de grote micropartikels detecteren omdat kleinere micropartikels onder de detectielimiet liggen. Naar schatting wordt slechts 2% van alle aanwezige micropartikels gedetecteerd met flowcytometrie26;27. Een verbetering van
technieken om micropartikels te detecteren is dan ook een vereiste voor aanvullend en meer gedetailleerd onderzoek. Een verbeterde detectie maakt de weg vrij om micropartikels te gaan gebruiken als diagnostische of prognostische merker. Wanneer ook kleine hoeveelheden micropartikels betrouwbaar detecteerbaar zijn, kunnen micropartikels mogelijk ook al aan het begin van de ziekte worden gedetecteerd en kan er mogelijk worden vastgesteld of micropartikels de oorzaak of het gevolg zijn van de ziekten.
Ook de onderliggende mechanismen van het afsnoeren van micropartikels zijn vrijwel onbekend. Meer inzicht in deze mechanismen en de invloed van medicijnen hierop kunnen helpen bij een verbeteren van de balans in cellulaire homeostase en het gezond blijven van het organisme.
Ten slotte, een meer gedetailleerd onderzoek naar en het vergelijken van de samenstelling en functies van subpopulaties vesicles, ingedeeld in onder andere micropartikels en exosomen, is vereist om de onderliggende mechanismen van het afsnoeren van deze vesicles beter te begrijpen. Aangezien ook prokaryoten vesicles gebruiken voor onderlinge communicatie en bescherming tegen de omgeving, ligt het voor de hand te veronderstellen dat er algemeen geldende en geconserveerde mechanismen ten grondslag te liggen aan het afgeven van micropartikels en andere typen vesicles aan de omgeving. Deze kennis kan er mogelijk voor zorgen de formatie en functie van vesicles in eukaryoten beter te begrijpen. Tegenwoordig is de aanwezigheid van micropartikels en andere typen vesicles wel aanvaard in de literatuur en worden deze gezien als een belangrijke schakel in biologische en cellulaire processen.
Algemene discussie en samenvatting
11
Referenties
1. Janicke RU, Sprengart ML, Wati MR, Porter AG. Caspase-3 is required for DNA fragmentation and morphological changes associated with apoptosis. J.Biol.Chem. 1998;273:9357-9360.
2. Meergans T, Hildebrandt AK, Horak D, Haenisch C, Wendel A. The short prodomain influences caspase-3 activation in HeLa cells. Biochem.J. 2000;349:135-140.
3. de Gassart A., Geminard C, Fevrier B, Raposo G, Vidal M. Lipid raft-associated protein sorting in exosomes. Blood 2003;102:4336-4344.
4. Sims PJ, Faioni EM, Wiedmer T, Shattil SJ. Complement proteins C5b-9 cause release of membrane vesicles from the platelet surface that are enriched in the membrane receptor for coagulation factor Va and express prothrombinase activity. J.Biol.Chem. 1988;263:18205-18212.
5. Safaei R, Larson BJ, Cheng TC et al. Abnormal lysosomal trafficking and enhanced exosomal export of cisplatin in drug-resistant human ovarian carcinoma cells. Mol.Cancer Ther. 2005;4:1595-1604.
6. Shedden K, Xie XT, Chandaroy P, Chang YT, Rosania GR. Expulsion of small molecules in vesicles shed by cancer cells: association with gene expression and chemosensitivity profiles. Cancer Res. 2003;63:4331-4337.
7. Knight M, Redman CW, Linton EA, Sargent IL. Shedding of syncytiotrophoblast microvilli into the maternal circulation in pre-eclamptic pregnancies. Br.J.Obstet.Gynaecol. 1998;105:632-640.
8. Redman CW, Sargent IL. Latest advances in understanding preeclampsia. Science 2005;308:1592-1594.
9. Guller S, Tang Z, Ma YY et al. Protein composition of microparticles shed from human placenta during placental perfusion: Potential role in angiogenesis and fibrinolysis in preeclampsia. Placenta 2010
10. Germain SJ, Sacks GP, Sooranna SR, Sargent IL, Redman CW. Systemic inflammatory priming in normal pregnancy and preeclampsia: the role of circulating syncytiotrophoblast microparticles. J.Immunol. 2007;178:5949-5956.
11. Messerli M, May K, Hansson SR et al. Feto-maternal interactions in pregnancies: placental microparticles activate peripheral blood monocytes. Placenta 2010;31:106-112.
12. Donate F, Kelly CR, Ruf W, Edgington TS. Dimerization of tissue factor supports solution-phase autoactivation of factor VII without influencing proteolytic activation of factor X. Biochemistry 2000;39:11467-11476.
13. Bach R, Rifkin DB. Expression of tissue factor procoagulant activity: regulation by cytosolic calcium. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 1990;87:6995-6999.
14. Greeno EW, Bach RR, Moldow CF. Apoptosis is associated with increased cell surface tissue factor procoagulant activity. Lab Invest 1996;75:281-289.
15. Le DT, Rapaport SI, Rao LV. Relations between factor VIIa binding and expression of factor VIIa/tissue factor catalytic activity on cell surfaces. J.Biol.Chem. 1992;267:15447-15454. 16. Le DT, Rapaport SI, Rao LV. Studies of the mechanism for enhanced cell surface factor
VIIa/tissue factor activation of factor X on fibroblast monolayers after their exposure to N-ethylmaleimide. Thromb.Haemost. 1994;72:848-855.
17. Wolberg AS, Monroe DM, Roberts HR, Hoffman MR. Tissue factor de-encryption: ionophore treatment induces changes in tissue factor activity by phosphatidylserinedependent and -independent mechanisms. Blood Coagul.Fibrinolysis 1999;10:201-210.
18. Ahamed J, Versteeg HH, Kerver M et al. Disulfide isomerization switches tissue factor from coagulation to cell signaling. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 2006;103:13932-13937.
19. Popescu NI, Lupu C, Lupu F. Extracellular protein disulfide isomerase regulates coagulation on endothelial cells through modulation of phosphatidylserine exposure. Blood 2010;116:993-1001.
20. Bogdanov VY, Balasubramanian V, Hathcock J et al. Alternatively spliced human tissue factor: a circulating, soluble, thrombogenic protein. Nat.Med. 2003;9:458-462.
21. Szotowski B, Antoniak S, Rauch U. Alternatively spliced tissue factor: a previously unknown piece in the puzzle of hemostasis. Trends Cardiovasc.Med. 2006;16:177-182.
22. Hobbs JE, Zakarija A, Cundiff DL et al. Alternatively spliced human tissue factor promotes tumor growth and angiogenesis in a pancreatic cancer tumor model. Thromb.Res. 2007;120 Suppl 2:S13-S21.
23. Signaevsky M, Hobbs J, Doll J, Liu N, Soff GA. Role of alternatively spliced tissue factor in pancreatic cancer growth and angiogenesis. Semin.Thromb.Hemost. 2008;34:161-169.
24. van den Berg YW, van den Hengel LG, Myers HR et al. Alternatively spliced tissue factor induces angiogenesis through integrin ligation. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 2009;106:19497-19502.
25. Diamant M, Tushuizen ME, Abid Hussein MN et al. Simvastatin-induced endothelial cell detachment and microparticle release are prenylation dependent. Thromb.Haemost. 2008;100:489-497.
26. Lacroix R, Robert S, Poncelet P, Dignat-George F. Overcoming limitations of microparticle measurement by flow cytometry. Semin.Thromb.Hemost. 2010;36:807-818.
27. van der Pol E, Hoekstra AG, Sturk A et al. Optical and non-optical methods for detection and characterization of microparticles and exosomes. J.Thromb.Haemost. 2010;8:2596-2607.
