Het management van draagmerries in een commercieel embryotransfer programma

HET MANAGEMENT VAN

DRAAGMERRIES IN EEN

COMMERCIEEL EMBRYOTRANSFER

PROGRAMMA

Aantal woorden: 12510

Laura Naudts

Studentennummer: 01204834

Promotor: Jan Govaere

Promotor: Ilse Gerits

Onderdeel van de Masterproef voorgelegd voor het behalen van de graad master in de diergeneeskunde

Universiteit Gent, haar werknemers of studenten bieden geen enkele garantie met betrekking tot de juistheid of volledigheid van de gegevens vervat in deze masterproef, noch dat de inhoud van deze masterproef geen inbreuk uitmaakt op of aanleiding kan geven tot inbreuken op de rechten van derden.

Universiteit Gent, haar werknemers of studenten aanvaarden geen aansprakelijkheid of

verantwoordelijkheid voor enig gebruik dat door iemand anders wordt gemaakt van de inhoud van de masterproef, noch voor enig vertrouwen dat wordt gesteld in een advies of informatie vervat in de masterproef.

Voorwoord

Hierbij wil ik van de gelegenheid gebruiken maken om enkele personen te bedanken die geholpen hebben bij het tot stand komen van deze masterproef.

Vooreerst wens ik mijn promotoren dr. Jan Govaere en dr. Ilse Gerits te bedanken. Dankzij hen was het mogelijk om een eigen onderwerp te verkrijgen ondanks een verstreken deadline. Tevens wil ik hen bedanken voor het actief meedenken, de begeleiding en de vele suggesties.

Graag wil ik ook dr. Maarten Hoogewijs, Marlon Savat en Annelore Roegiers bedanken, het is namelijk dankzij hen dat mijn onderzoek uitgevoerd kon worden. Enkele maanden aan een stuk zijn zij wekelijks overstelpt met vragen en afspraken om de merries en veulens op te meten. Hartelijk dank voor jullie tijd.

Daarnaast wil ik mijn broer Joeri heel erg bedanken voor het menig nalezen. Zonder hem was het schrijven van deze literatuurstudie niet mogelijk.

Ten slotte wens ik mijn ouders en vriend Mathieu te bedanken voor alle steun tijdens de gehele opleiding en het realiseren van mijn droom om dierenarts te worden.

Deze literatuurstudie is geschreven tijdens de corona-crisis. Dit had geen directe weerslag op het onderzoek aangezien alle metingen eind 2019 waren afgerond.

Inhoudsopgave

Samenvatting ... 1 1. Inleiding ... 2 2. Literatuurstudie ... 7 2.1 Geslachtstractus draagmerrie ... 7 2.2 Cyclusopvolging draagmerrie ... 9 2.3 Epigenetica ... 11 2.3.1 Wat is epigenetica ... 11 2.3.2 Signalement draagmerrie ... 11 2.3.3 Huisvesting draagmerrie ... 17 2.3.4 Ontworming draagmerrie ... 18 2.3.5 Vaccinatie draagmerrie ... 18 3. Onderzoek ... 22 3.1 Probleemstelling en doelstelling ... 22 3.2 Materiaal en methoden ... 22 4. Resultaten ... 25 5. Discussie ... 29 6. Referentielijst ... 32 7. Bijlagen ... 37

Samenvatting

Embryotransplantatie is een veelgebruikte artificiële voortplantingstechniek bij paarden. Hierbij wordt een embryo van een donormerrie overgeplant in een draagmerrie en maakt deze zijn ontwikkeling door in diens uterus, dewelke vaak een ander ras betreft dan de donormerrie en dus genetisch verschilt van de foetus. Deze techniek kende in de jaren ’90 een commerciële doorbraak omwille van de vele voordelen zoals bijvoorbeeld de registratie van meerdere veulens van eenzelfde merrie per jaar. Regelmatige transrectale echografische controle van de donormerrie is van belang voor de embryocollectie, welke rond dag zeven of dag acht wordt uitgevoerd. Vervolgens wordt het embryo via een niet-chirurgische transcervicale manier ingebracht in de draagmerrie.

De literatuurstudie van deze masterproef legt de nadruk op de draagmerrie. Een goede keuze en een optimaal management vóór en na de transfer zijn uiterst belangrijk. De ideale receptormerrie is tussen de vier en tien jaar oud, in goede lichaamsconditie, makkelijk te hanteren en heeft een geslachtstractus vrij van abnormaliteiten. Een correct vaccinatieschema, ontwormingsprotocol en een goede huisvesting dragen bij tot succes.

De draagmerrie is vaak een Franse Draver of Volbloed omwille van hun gunstige reproductieve eigenschappen. Veel auteurs beschrijven transfers tussen merries met morfologische verschillen. In het tweede deel – het onderzoek – wordt onderzocht hoe de groeicurve van de nakomelingen tot zes maand leeftijd verloopt; namelijk Arabische Volbloedembryo’s en Belgisch Warmbloedembryo’s in Franse Draver receptor merries. Aangezien de genetische aspecten van het embryo reeds zijn aangelegd, ontstaat bijgevolg de vraag: hebben bepaalde factoren ‘boven het gen’ nog een invloed en zo ja, in welke mate beïnvloedt dit het exterieur en ontwikkeling van de nakomeling? Foetomaternaal contact, gewicht van de placenta en duur van de dracht zijn gecorreleerd met het geboortegewicht. Het onderzoek duidt op een positieve correlatie tussen het gewicht van het veulen na geboorte en het gewicht van de merrie. Op zes maand leeftijd is er enkel een positieve correlatie gevonden tussen het gewicht van het veulen en het gewicht van de zelfdragende, biologische merrie. Dit zijn slechts tendensen. Vanwege een beperkte dataset dient er verder onderzoek te gebeuren om concrete besluiten te bekomen.

Trefwoorden: embryo transplantatie, draagmerrie, drachtpercentage, management, epigenetica, ontwikkeling foetus, groeicurve nakomeling

1.

Inleiding

Embryotransplantatie (hierna genoemd ET) is een goed ingeburgerde artificiële voortplantingstechniek waarbij een embryo van een donormerrie uit de baarmoeder wordt gespoeld en vervolgens overgeplant wordt in een draagmerrie. Deze techniek wordt reeds decennia lang toegepast bij paarden. De geboorte van het eerste veulen na embryotransplantatie vond plaats in 1972 (Oguri & Tsutsumi, 1972). Pas in de jaren ’90 kende ET een echte commerciële doorbraak en werd deze techniek vooral in Argentinië bij polopony’s toegepast (Kraemer, 2013).

Deze manier van voortplanting heeft tal van voordelen en biedt heel wat mogelijkheden; er kunnen nakomelingen verkregen worden van bijvoorbeeld: merries met een beperkt reproductievermogen (subfertiliteit, uterus pathologie, herhaaldelijk drachtverlies, hogere leeftijd), merries in competitie die moeten blijven presteren, merries met locomotorische problemen en van jonge (+ twee jaar) beloftevolle merries alvorens ze in training worden gebracht. Door ET is het mogelijk om het generatie-interval te verkorten, dewelke bij het paard vrij lang is (acht tot twaalf jaar) en verlengd wordt door een eventuele sportcarrière (Vandenberghe et al., 2012). Tevens nog een voordeel van deze techniek is dat – hoewel er bij natuurlijke voortplanting slechts één veulen per jaar per merrie wordt geboren en geregistreerd – ET er daarentegen voor zorgt dat er jaarlijks meerdere veulens van eenzelfde merrie kunnen geregistreerd worden. Bij warmbloedpaarden heeft ET een belangrijk aandeel aangezien de sportpaarden vaak tot op hoge leeftijd blijven presteren en bijgevolg in die periode niet drachtig kunnen zijn (Hinrichs, 2018). Bepaalde stamboeken laten meerdere registraties niet toe zoals Jockey Club, de Thoroughbred Association en de Franse Draver (Stamboek regelement van de Franse Draver).

Praktisch bekeken behelst deze techniek verschillende aspecten. Het standaardprotocol voor embryocollectie en –transfer betreft twee belangrijke kenmerken: een veelvuldige controle via rectale echografie en een uitgevoerde procedure via een niet-chirurgische transcervicale manier. Deze procedure is goedkoper, sneller en ethisch meer verantwoord voor de receptormerrie ten opzichte van de chirurgische methode, namelijk laparotomie via de linea alba of de flank (Stout, 2006; Wilsher & Allen, 2010a). Door dagelijks een echografie van de uterus en ovaria tijdens oestrus uit te voeren verkrijgt men informatie over het tijdstip van ovulatie (dag 0), welke belangrijk is voor het moment van kunstmatige inseminatie. Vers sperma wordt één à twee dagen voor ovulatie geïnsemineerd en diepvries sperma zes tot acht uur na ovulatie (Dascanio & McCue, 2014). Er wordt al dan niet gewerkt met behulp van een GnRH-analoog of hCG (1500 IE Chorulon ®(MSD Animal Health)) toediening om een ovulatie te induceren. Na ovulatie komen de eicellen terecht in het oviduct en gaat ter hoogte van de ampulla de bevruchting door (McCue & Squires, 2015). Aangezien de ovulatie beperkt is tot de ovulatiegroeve kan dit een oorzaak zijn van het falen in multipele ovulaties (Allen, 2005). Allen (2005) beschrijft ook dat het gonadale weefsel van paarden lagere concentraties aan eCG-receptoren bevat, dewelke een tweede oorzaak zou kunnen zijn voor het beperkte succes van superovulatie. Door multipele ovulaties kunnen er meer embryo’s geproduceerd worden en zorgen voor een vergroting van de economische efficiëntie van ET (Losinno et al., 2001). Op dag zeven of dag acht wordt het embryo uit de donormerrie gespoeld (Hinrichs, 2018). Indien men zou spoelen op dag negen of later, kan er eventueel schade optreden door een minder vlotte manipulatie van het embryo vanwege de inmiddels bereikte grootte (Wilsher et al., 2010c). Na het grondig wassen van het perineum van de donormerrie wordt een steriele foleykatheter ingebracht in de uterus. Hierop is een cuff aangebracht die kan worden opgeblazen om zodoende het ostium internum cervicis af te sluiten (Wilsher & Allen, 2010a). De hoeveelheid vloeistof die men aanwendt

voor de spoeling is afhankelijk van de pariteit van de merrie, grootte van de uterus en voorkeur van de uitvoerder (McCue et al., 2010; McCue & Squires, 2015). Het uitspoelen kan met een eenvoudige ringerlactaat oplossing, waar al dan niet 0,5% foetaal kalfserum werd aan toegevoegd (McCue et al., 2003). Tegelijkertijd bevindt de arm van de uitvoerder zich in het rectum om zo de geballoneerde uterus te voelen en vloeistof te laten circuleren over de gehele baarmoeder, zodat het embryo uit de endometriale plooien wordt losgemaakt (Squires et al., 1999). De ingebrachte vloeistof wordt afgeheveld en dit proces wordt drie tot zes maal herhaald. Het meermaals spoelen zou de kans verhogen op het effectief verkrijgen van een embryo (Hinrichs, 2018). Er kan oxytocine (20 IU, intraveneus) toegediend worden tijdens de procedure om uteruscontracties te stimuleren en te helpen bij het verwijderen van de vloeistof. Ook kan spierrelaxerende medicatie (i.e. Buscopan® (natriummetamizol + butylhyoscine bromide; Boehringer Ingelheim)) gebruikt worden om het masseren te vergemakkelijken (McCue & Squires, 2015). Eveneens wordt het aangeraden om de donormerrie na de embryospoeling te behandelen met prostaglandines (i.e. cloprostenol sodium, 250 microgram, intramusculair). Het doel hiervan is om luteolyse van het corpus luteum te bekomen en zo de merrie terug in oestrus te krijgen. Alsook heeft dit een positief effect op het verwijderen van achtergebleven vocht uit de baarmoeder en het minimaliseren van het per ongeluk introduceren van bacteriën in de baarmoeder van een merrie in di-oestrus. Door prostagladines toe te dienen gaat ook de luteale fase verkort worden; waardoor de merrie opnieuw kan gedekt worden indien nog een ET cyclus gewenst is. Als laatste reden is het feit dat indien de embryo flush negatief was, omdat het embryo niet werd gecollecteerd of pas laattijdig indaalde in de uterus, er geen kans op dracht is bij de donormerrie (McCue et al., 2010). Er zijn twee manieren beschreven van spoelen (niet-chirurgische procedure): een gesloten methode en een open methode. Het verschil zit in het feit dat bij de gesloten methode het embryo rechtstreeks doorheen een filter gaat door middel van een Y-vormig spoelsysteem (Figuur 1). Dit in tegenstelling tot de open methode waar men na het opvangen de spoelvloeistof in een laboratorium handmatig filtert (Squires et al., 1999). Bij de volgende stap wordt de inhoud van de filter overgebracht op een petrischaal en met behulp van een lichtmicroscoop wordt gezocht naar het embryo (Stout, 2006). Wanneer deze gevonden is krijgt het embryo een gradatie aan de hand van zijn morfologie door gebruik te maken van een vastgelegde schaal (McKinnon & Squires, 1988). Deze schaal kan van belang zijn aangezien de drachtpercentages na transfer in direct verband staan met de kwaliteit van het embryo (Carnevale et al., 2000). Het embryo wordt na het microscopisch onderzoek herhaaldelijk gewassen in een speciaal samengesteld medium (McCue & Squires, 2015). Na het wassen kan het embryo onmiddellijk overgeplant worden of gekoeld getransporteerd worden. Er is geen verschil in percentages drachtverlies tussen dag zestien en dag vijftig voor onmiddellijk getransfereerde of getransporteerde embryo’s (McCue & Squires, 2015).

Figuur 1: De niet-chirurgische embryo collectie procedure: de gesloten methode. De cuff van de katheter is opgeblazen en gepositioneerd net voorbij de cervix. Y-slangen verbinden de katheter aan een flush medium en aan de embryofilter. (Uit: Equine Embryo Transfer, 2015)

Een veelvuldig gebruikte niet-chirurgische techniek om het embryo in de receptormerrie te brengen is de conventionele transcervicale techniek. Via transcervicale weg wordt het embryo in de draagmerrie geplaatst, die gelijktijdig (0) tot drie dagen na (-3) ovulatie van de donormerrie heeft geovuleerd (McKinnon & Squires, 1988; Carnevale et al., 2000; Squires et al., 2003; Stout, 2006; Wilsher & Allen, 2010; Wilsher et al., 2010c; Panzani et al., 2016) . Het effectief synchroniseren van de cyclus bij een merrie – bijvoorbeeld met behulp van prostaglandines – is moeilijk. Vandaar wordt er in de praktijk vaak gewerkt met meerdere draagmerries per donormerrie, om op deze manier altijd een draagmerrie op het juiste moment van de cyclus beschikbaar te hebben. In de literatuur wordt beschreven dat de draagmerrie twintig minuten voor de transfer licht gesedeerd wordt met acepromazine 10mg IV (Wilsher & Allen, 2010a), doch is dat niet altijd nodig in de praktijk. Er is een tweede techniek mogelijk waarbij de transfer van embryo’s uitgevoerd wordt met gebruik van hulpmiddelen, namelijk een Wilsher forceps (een paar speciaal vervaardigde langwerpige getande weefseltangen) en een Polansky speculum (eendenbek-vormig vaginaal instrument) (Wilsher & Allen, 2010a) (Figuur 2).

Deze techniek resulteert in minder irritatie en inflammatie, meer zekerheid in het correct plaatsen van het embryo in het baarmoederlichaam, potentieel lagere prostaglandine vrijstelling en minder onopzettelijke contaminatie van de uterus door de procedure (Card, 2018). De techniek vereist wel enkele zaken zoals een Wilsher forceps en Polansky speculum, alsook twee mensen om de transfer uit te voeren en sedatie van de draagmerrie. Toch resulteert deze techniek in een hoger drachtpercentage dan de conventionele techniek, zelfs met onervaren personen (retrospectieve studie Cuervo-Arango et al., 2018a). Het embryo bevindt zich in een inseminatiepipet en is omgeven door een 2,5ml holding medium, waardoor de kans verkleint dat het embryo aan de pipet blijft kleven (Allen, 2005). Bij de conventionele, meest gebruikte techniek in België, bevindt het embryo zich in een 0,25-0,5ml rietje (Vandenberghe et al., 2012). Een cassoutransferpipet wordt dan in de uterus gebracht, transcervicaal. Deze pipet is omgeven door een steriele, harde plastic beschermhuls en daaromheen een flexibel omhulsel (Vandenberghe et al., 2012). Dit wordt doorprikt – eenmaal in de cervix – en zo wordt de pipet opgeschoven in de baarmoeder (Daels, 2007). Rectaal wordt – via palpatie – gecontroleerd of de pipet mooi door de cervix is gepasseerd en tot in de baarmoeder werd opgeschoven. Eventueel kan de cervix rectaal gemanipuleerd worden om de pipet verder op te schuiven. Profylactisch kan de draagmerrie behandeld worden met 10 mg crystalline penicilline intraveneus direct na transfer en de twee volgende dagen intramusculair met een langwerkend benzylpenicilline (Wilsher & Allen, 2010a). Sommige studies beschrijven het positief effect van toedienen van niet-steroïdale ontstekingsremmers voor het inhiberen van cyclo-oxygenase of hormonen zoals hCG om de progesteronproductie te stimuleren. Doch, antibiotica, hormonen of NSAIDS kunnen achterwege gelaten worden zonder verminderde resultaten (Vandenberghe et al., 2012). Drachtdiagnose bij de draagmerrie wordt op dag zes of dag zeven na transfer van in vivo embryo’s vastgesteld en bevestigd met een tweede echografische controle tien à twaalf dagen later. Daarna kunnen de controles volgen op dag 35, 45 en 60 van de dracht (Vandenberghe et al., 2012). Drachtpercentage na transfer, percentage drachtverlies en percentage van het aantal nakomelingen zijn drie belangrijke aspecten om een ET al dan niet succesvol te noemen. Op zich kan het succes worden berekend met een simpele formule: ET drachtpercentage per cyclus = embryo collectie percentage x drachtpercentage na transfer. Over het algemeen bedraagt het embryo collectie percentage 50 tot 65% per cyclus, met variabiliteit afhankelijk van de inherente vruchtbaarheid van merrie en hengst, soort sperma, et cetera. Drachtpercentage na transfer bedraagt ongeveer 70 tot 90%, met variabiliteit afhankelijk van ervaring van de uitvoerder, kwaliteit embryo en factoren geassocieerd met de draagmerrie (McCue & Squires, 2015). Bijgevolg bedraagt het voorspelde succes (i.e. een drachtige draagmerrie) per ET cyclus 35 tot 95%. Daarnaast is er ongeveer 8 tot 10% dracht verlies tussen eerste detectie (i.e. dag 12 tot dag 16) en uitgerekende partusdatum. Het percentage drachtverlies is vergelijkbaar tussen ET draagmerries en merries die hun eigen veulen dragen (McCue & Squires, 2015). De aangenomen norm voor succes op dracht is gemiddeld één veulen per drie inseminaties (Wilsher & Allen, 2010c).

Uiteraard zijn er een aantal factoren die invloed hebben op de overlevingskans van het embryo na transfer alsook beperkingen betreffende ET als geassisteerde voortplantingstechniek. Recovery van embryo’s vereist een functioneel gezonde geslachtstractus van de donormerrie met een normale cyclus, oviduct en uterus die bevruchting en ontwikkeling van het embryo tot dag zeven of acht na

ovulatie kunnen ondersteunen. Inseminatie van de donormerrie vereist een volledige inseminatiedosis van goede kwaliteit sperma (Hinrichs, 2018).

Belangrijke factoren betreffende de overlevingskans zijn: embryo kwaliteit, embryo grootte, graad van synchronisatie tussen ovulatie donormerrie en die van draagmerrie, leeftijd donor- en draagmerrie, moment van het jaar, gelijktijdig gebruik van medicatie op moment van transfer, zoals bijvoorbeeld antibiotica, progesteron/progestagenen en NSAIDS aan de draagmerries (Card, 2018). In deze literatuurstudie zal verder worden ingegaan op de factor ‘draagmerrie’. Om een succesvol ET programma te bekomen moeten zowel donormerrie als draagmerrie optimaal zijn. Met andere woorden, er moet aandacht besteed worden aan een correct management alsook aan de techniek voor het uitvoeren van de procedure (collecteren en overbrengen) (McCue & Squires, 2015). De draagmerrie is één van de meest belangrijke factoren die invloed hebben op drachtpercentage na embryo transfer. Het geslachtsstelsel dient uiteraard grondig te worden onderzocht en negatieve factoren moeten worden uitgesloten en eventueel verholpen (Vandenberghe et al., 2012). Vervolgens is het van belang om kennis te hebben omtrent de cyclus. Het is onder andere bewezen dat de kans op dracht na ET verhoogd is bij draagmerries met een lange voorafgaande oestrus ( Mateu-Sánchez et al., 2016; Cuervo-Arango et al., 2018b). Een derde belangrijk gegeven is het aspect van de epigenetica, de erfelijke veranderingen in genexpressie, zonder wijzigingen in de DNA-sequentie. Welke factoren van de draagmerrie hebben effect op de ontwikkeling van het veulen, hetwelk andere genetische eigenschappen bezit. Factoren zoals signalement, ras, afkomst, huisvesting, ontworming en vaccinatie zullen eveneens verder besproken worden. Hierbij hoort ook een onderzoek om groeicurves van veulens te vergelijken.

2.

Literatuurstudie

2.1 Geslachtstractus draagmerrie

Het is heel belangrijk om de draagmerrie in gezonde conditie te hebben aangezien het veulen door haar wordt grootgebracht. Een goede draagmerrie wordt geselecteerd op verschillende eigenschappen: zo zijn de body condition score (Bijlage 1), lichaamsbouw, een goede perineale conformatie, goede moedereigenschappen, een normale cyclus en een gezond geslachtstractus van groot belang. Van craniaal naar caudaal worden de verschillende structuren overlopen (Figuur 4). De ovaria, vastgehangen aan het mesovarium, bevinden zich in het dorsolateraal deel van het abdomen. Rond de ovaria bevindt zich een stevig kapsel “tunica albuginea” en ter hoogte van de ventrale rand de ovulatiefossa, afgelijnd door germinale cellen. Na ovulatie worden de oöcyten opgevangen in het oviduct. Het oviduct bestaat uit drie delen: infundibulum, ampulla en isthmus. Het infundibulum omhelst de ovulatiefossa en helpt bij het opvangen en transporteren van de eicellen, waar dan later de bevruchting zal plaatsvinden in de ampulla. Ter hoogte van de isthmus gaat het oviduct dan over in de uterushoorn, genaamd de uterotubulaire junctie. De uterus met hoornen heeft een Y-vormig lichaam. Deze staat in voor belangrijke zaken zoals het ondersteunen, voeden en beschermen van het embryo, functionele en structurele ondersteuning voor de placenta en het veroorzaken van de uiteindelijke contracties met daaropvolgend de uiteindelijke partus. De baarmoederwand bestaat uit drie lagen: buitenste serosalaag, myometrium (bestaande uit twee lagen glad spierweefsel) en tenslotte het endometrium, dewelke klieren bevat. Aan het einde van het baarmoederlichaam bevindt zich de cervix. Deze vormt de verbinding tussen de uterus en de vagina en heeft een lengte van 7,5 à 10 centimeter in di-oestrus. Tijdens de verschillende fases van de cyclus verandert de cervix qua tonus en eigenschappen aangezien het een dikwandig gespierde structuur is. In oestrus is deze zacht, met andere woorden een minimale tot geen tonus, door de invloed van verhoogde oestrogeen gehaltes in combinatie met afwezigheid progesteron. In tegenstelling tot di-oestrus – gekenmerkt door verhoogde progesteronwaarden – wanneer de cervix zich zal sluiten (Cuervo-Arango et al., 2018b). De grootste functie van de cervix is een fysieke barrière te vormen. Op de bodem van het vestibulum bevindt zich de ingang naar de blaas. Het meest caudale gedeelte van de gehele geslachtstractus is dan de vulva, bestaande uit twee labia, dorsale en ventrale commissuren en de clitoris. De vulva en omgeving worden benoemd als het perineum.

Een goede perineale conformatie is van groot belang als criteria van de draagmerrie. Idealiter bevindt de vulva zich in een verticale positie, waarvan minimaal 80% zich onder de bekkenbodem bevindt (Figuur 3). Een minder ideale conformatie – zoals kantelen van het dorsaal aspect van de vulva naar craniaal en minder goede tonus – vergroot de kans op het ontstaan van uteriene infecties (McCue & Squires, 2015; Schnobrich, 2018) (Figuur 5). Er zijn nog aspecten die een indicatie kunnen zijn van een suboptimale uteriene omgeving (Carnevale et al. 2000), deze beschrijven een associatie van verminderde drachtpercentages – en een mogelijk verhoogd

embryonaal verlies – met een verminderde tonus van de uterus _{Figuur 3: Een voorstelling van een ideale}

en cervix voorafgaand aan ET. Deze verminderde tonus zou gecorreleerd zijn aan een verlaagd circulerend progesterongehalte (Carnevale et al., 2000). Een belangrijke factor in de selectie van een receptormerrie is dus ook de uteriene tonus (Squires et al., 2003).

Figuur 4: Tekening van het voorplantingsstelsel van een merrie. (Uit: Equine Embryo Transfer, 2015)

Figuur 5: Een slechte perineale conformatie met een gezonken anus en kanteling van de vulva. (Uit: Schnobrich, M.R., 2018)

Uteriene cysten, uterien vrij vocht, lucht of debris in de uterus, ovariële tumoren en andere abnormale ovariële karakteristieken zijn ook allemaal negatieve aspecten van een geslachtsstelsel om een dracht te volbrengen en zijn dus niet gewenst bij een receptormerrie (Schnobrich, 2018). Merries die al een partus zonder problemen hebben doorgemaakt en goede moedereigenschappen vertonen naar het veulen toe, zijn tevens goede kandidaten (Riera, 2009). Nullipare merries kunnen op zich gebruikt worden als draagmerrie, mits er meer aandacht wordt besteed rond het moment van de partus. Pluripare merries bezitten namelijk een grotere baarmoeder en dus endometrium oppervlak met microcotyledonen dan primipare merries (Allen et al., 2004).

De pariteit is gelinkt aan de leeftijd en daarbij horende negatieve gevolgen. Er kan een uitrekking en tonusverlies van de perineale spieren optreden omwille van pluripariteit. Tijdens de partus kan het veulen bij de merrie verwondingen veroorzaken waardoor de perineale conformatie slechter wordt aangezien er nog meer verlies is in de vulvaire tonus en appositie van de labia (Schnobrich, 2018). Een ander belangrijk aspect betreffende de keuze en het management van de draagmerrie is de voedingstoestand, welke invloed heeft op vele aspecten zoals de perineale conformatie en de partusproblematiek. Ernstig verlies van lichaamsconditie – zoals bij drachtige merries die niet voldoende worden gevoederd in de winter of tijdens lactatie – leidt tot een gezonken anus en kanteling van de vulva (Figuur 5) waardoor de barrières minder efficiënt zijn en er een hoger risico is op ontstaan van pneumovagina en contaminatie van het voortplantingsstelsel (Schnobrich, 2018). Tevens kan een minderwaardige body condition score leiden tot een dysmatuur veulen bij de geboorte (Schnobrich, 2018). Besmetting tijdens het middelste of laatste trimester van de dracht kan leiden tot abortus en neonatale septicemiën als gevolg van een ascenderende (bacteriële) placentitis (Giles et al., 1993). Volgens Riera (2009) zijn de belangrijkste factoren die invloed hebben op drachtpercentages na transfer de selectie, het management en de voeding van de draagmerrie. Merries die gewicht verliezen na ET kunnen drastisch de percentages negatief beïnvloeden (Riera, 2009). Merries met ernstige aandoeningen (bijvoorbeeld chronische diarree of neoplasie), een slechte bodyconditie score met gevorderde leeftijd en merries met een buikverband (bijvoorbeeld na een koliekoperatie of hydrops) hebben mogelijk geen adequate abdominale contracties. Merries die niet over adequate abdominale contracties beschikken, kunnen mogelijk een vertraagde fase twee – de uitdrijvingsfase – van de partus bekomen en dus risico lopen op een dystocie (Schnobrich, 2018).

2.2 Cyclusopvolging draagmerrie

Het natuurlijk dekseizoen is van april tot september, welke overeen komt met het graasseizoen en dus de meest gunstige periode is om als veulen geboren te worden (Hughes et al., 1975). De fysiologische drachtduur bij paarden bedraagt namelijk gemiddeld elf maanden. De merrie is polyoestrisch en het jaarritme wordt geregeld door toename/afname van de fotoperiode, temperatuur en beschikbaarheid van voedsel. In de lente worden de nachten korter, hierdoor neemt de duur van de melatonine secretie af en zal de hypothalamus GnRH productie opstarten (Ginther,1993). Paarden zijn dus zogenoemde ‘long day breeders’. Tijdens het seizoen bevinden er zich follikels en luteale structuren van verschillende fases – ontwikkeling en regressie – in de ovaria. Een dominante follikel zal verder uitgroeien met drie à vijf millimeter per dag. Van zodra deze 40 à 45 millimeter bereikt kan deze ovuleren. De grootte van de pre-ovulatoire follikel is ras afhankelijk (Arabische Volbloeden: 35 à 45mm; Volbloeden 40 à 45 mm; Belgische Trekpaarden 50 à 60 mm). Ter hoogte van de ovulatie fossa ontstaat een ruptuur van de wand van de dominante follikel tijdens ovulatie om deze vervolgens op te vullen met bloed (i.e. corpus haemorrhagicum). Hier wordt het corpus luteum gevormd (geluteïniseerde granulosacellen) met een diameter van 20 à 30 millimeter; hetgeen dat overblijft na lyteolyse – geïnduceerd door prostaglandine – is het corpus albicans. (McCue & Squires, 2015).

In deze studie wordt echter dieper ingegaan op het aspect van de draagmerrie in een commercieel embryotransfer programma. Betreffende de cyclus en de opvolging zijn er bepaalde factoren die invloed hierop uitoefenen. Draagmerries die van nature in cyclus zijn, hebben betere drachtpercentages in vergelijking met acyclische merries die met hormonen werden behandeld

(McCue & Squires, 2015). Een mogelijke techniek om invloed uit te oefenen op de cyclus is de paarden onder artificieel licht plaatsen. Vanaf december kunnen draagmerries onder artificieel licht geplaatst worden om zodoende de ontwikkeling van follikels te stimuleren en zo een vroege ovulatie in het jaar te bekomen (McCue & Squires, 2015).

Eens de cyclus op gang is zal deze nauw opgevolgd worden aan de hand van transrectale echografie. Verschillende zaken kunnen vastgesteld worden met een link naar de ‘ideale’ draagmerrie. Transitionele merries met follikels > 25 millimeter en/of endometriaal oedeem vormen betere draagmerries dan anoestrus merries aangezien deze dus al aan estradiol zijn blootgesteld (Oliveira Neto et al., 2018). Een onderzoek van Cuervo-Arango et al. (2018b) heeft aangetoond dat er een positieve correlatie is tussen de lengte van de folliculaire fase en daaropvolgende vruchtbaarheid gelinkt met ontwikkeling van de eileiders (i.e. oöcyt kwaliteit en optimale omgeving eileider), uterus ontvankelijkheid en de uiteindelijke ontwikkeling en overlevingskansen van het embryo. Merries die voorafgaand aan de transfer drie of meer dagen oedeem vertonen in de uterus tijdens de oestrus, hadden klaarblijkelijk een hogere kans op dracht in vergelijking met merries die minder dan drie dagen oedeem vertoonden. Het tweede dat werd aangetoond betreft het feit dat de kans op dracht verhoogd was bij merries met twee of meer corpora lutea op het moment van de transfer (Cuervo-Arango et al., 2018a). Zes tot zeven dagen na ET wordt de draagmerrie opnieuw gecontroleerd om de staat van uterus te bekijken en uiteraard de dracht vast te stellen. Merries die een groot volume van vocht accumuleren na de transfer worden niet aanzien als goede draagmerries om opnieuw in te zetten. Tevens worden merries die hun dracht verliezen na 35 dagen (i.e. na vorming van de endometriale cups) dat seizoen niet meer gebruikt (McCue & Squires, 2015). Het is bijgevolg heel belangrijk om een goede draagmerrie te hebben met een gezond voorplantingsstelsel en een correct verloop van de cyclus – met een goede echografische opvolging – om een succesvolle embryotransplantatie te bekomen. Het moment van ovulatie van de draagmerrie is van belang zodat het embryo op de juiste moment kan getransfereerd worden.

2.3 Epigenetica

2.3.1 Wat is epigenetica

Zoals reeds eerder besproken, hebben verschillende factoren een invloed op zowel de draagmerrie als de drachtpercentages daaropvolgend, doch zijn er eveneens factoren afkomstig van de draagmerrie zelf. Net dit gegeven wordt nu specifiek in vraag gesteld. Wat is de invloed van het ras van de draagmerrie op het geboortegewicht en de ontwikkeling van het veulen? Met andere woorden: hoeveel effect heeft epigenetica bij deze veelgebruikte techniek in de paardenfokkerij? Epigenetica is de studie van erfelijke veranderingen in genexpressie, zonder wijzigingen te vooroorzaken in de DNA-sequentie. Er treedt bijgevolg een verandering op in het fenotype zonder een verandering in het genotype te veroorzaken. Dit fenomeen is een normaal en natuurlijk gegeven, al kunnen zaken zoals leeftijd, milieu en gezondheidstoestand wel degelijk een effect uitoefenen (Korochkin, 2006). Hoewel er rapporten zijn gepubliceerd over de morfometrie van veulens geproduceerd door embryotransplantatie van in vivo verkregen embryo’s van atypisch grote of kleine draagmerries; is er nog weinig informatie beschikbaar omtrent de vergelijking van morfometrie van nakomelingen door natuurlijke bevruchting ten opzichte van diegene na ET (Valenzuela et al., 2018). Eveneens zal de placenta een grote rol spelen eenmaal het embryo ingebracht is bij de draagmerrie. De communicatie in utero tussen merrie en foetus gebeurt ter hoogte van het placentale contactoppervlak en met name bij paarden worden de verschillen in grootte en competentie van de diffuse, niet-invasieve epitheliochoriale placenta weerspiegeld in foetale groei en geboortegewicht van veulens. Het oppervlak aan placentale microcotyledonen alsook het totaal oppervlak van foetomaternaal contact over de hele placenta spelen een rol (Allen et al., 2004; Peugnet et al., 2014).

2.3.2 Signalement draagmerrie

Het signalement van een merrie is een belangrijk gegeven betreffende de keuze voor het gebruik als draagmerrie. In grote lijnen is de ideale draagmerrie van jonge leeftijd (drie tot twaalf jaar oud), in goede fysieke conditie, heeft deze een gezond voortplantingsstelsel, is ze makkelijk in de omgang en heeft ze een zachte ingesteldheid. Oudere merries met een minder goede conditie en nukkig van karakter zijn bijgevolg minder geschikt voor het gebruik als draagmerrie (McCue & Squires, 2015). In een studie van Carnevale et al. (2000) werd geconcludeerd dat de ideale leeftijd van de receptormerrie onder de tien jaar is; ondanks dat de leeftijd van de receptormerrie de drachtpercentages op dag twaalf en dag vijftig niet beïnvloedde (Carnevale et al., 2000). Het endometrium heeft bij oudere merries een hogere incidentie van inflammatoire en degeneratieve verandering (Carnevale et al., 2000; Wilsher & Allen, 2002).

Embryotransplantatie is inmiddels een veelgebruikte commerciële techniek en meestal worden bepaalde rassen als draagmerrie gekozen, zoals Franse Draver of Volbloeden. Dit is een bewuste keuze omwille van onder andere hun gunstige reproductieve eigenschappen. Alsook hebben paarden van dit type ras inmiddels reeds een sportcarrière achter de rug en kunnen ze vervolgens ingezet worden als draagmerries. Men heeft vastgesteld dat deze paardenrassen over zowel een hoog drachtpercentage per cyclus als een hoge ovulatie ratio bezitten (Nath et al., 2010). Een goed en intensief management zorgt ervoor dat ze geschikt zijn om gedoneerde embryo’s te ontvangen. Vandaar dat veel wetenschappelijke onderzoeken uitgevoerd zijn met deze rassen als draagmerries.

Sommige auteurs vermelden rasverschillen in de lengte van de dracht, waarbij volbloeden een langere drachtduur zouden hebben in vergelijking met trekpaarden en pony’s (Bos & van der Mey, 1980; Allen et al., 2004). De drachtduur bij de merrie is beïnvloed door de daglichtlengte (Hodge et al., 1982; Sharp, 1988). Dat is bijgevolg waarschijnlijk de reden dat Volbloeden in het noordelijk halfrond een kortere drachtduur hebben dan paarden gehuisvest in het zuidelijk halfrond (Mariella et al., 2018).

Naast het gekozen ras en de geschikte leeftijd, dient men rekening te houden met de pariteit en daaraan gelinkte zaken zoals de eigenschappen van de uterus en de placenta. Merries die voor de eerste keer een partus doorstaan of al eerder veulens gehad hebben kunnen beide goede kandidaten zijn als draagmerrie (McCue & Squires, 2015). Primipare merries vertonen wel een duidelijk significante vermindering in placentavolume ten opzichte van pluripare merries (Wilsher & Allen, 2002). De hypothese – gesuggereerd door Wilsher en Allen (2002, 2010) en dan door Elliott et al. (2009) – is dat de uterus bij paarden eerst op een of andere manier dient te worden voorbereid door een eerste dracht, vooraleer het zijn volledige potentieel kan bereiken om de groei van de foetus te vergemakkelijken. Dit ‘priming’-effect van een eerste dracht zou zorgen voor een significante toename in het aantal microcotyledonen per oppervlakte. De pariteit bleef significant gecorreleerd met het geboortegewicht van het veulen maar er was geen associatie met het placentaal gewicht (Elliott et al., 2009). Acht jaar later toonde een experiment aan dat de ontwikkeling van microcotyledonen en de totale oppervlakte-dichtheid van de villi aanzienlijk verhoogden bij pluripare merries, net zoals de vascularisatie en samenstelling van de placenta (Meirelles et al., 2017). Betreffende de grootte van de neonati is ook een significant verband gevonden; doch niet meer na het eerste jaar, waarschijnlijk omdat omgevings- en genetische factoren bijdragen aan de postnatale groei (Meirelles et al., 2017). De ontwikkeling van de placenta wordt beïnvloed door onder andere het vetmetabolisme en voedingsstatus van de merrie en is tevens ook verschillend tussen de rassen (Fowden et al., 2009; Howell & Powell, 2017).

Normaliter bedraagt het placenta gewicht (bij voldragen dracht) 11% van het gewicht van het veulen (Pascoe, 2003). Bij alle rassen – Volbloeden, Warmbloed en Amerikaanse Dravers – was het gewicht van het veulen positief gecorreleerd met het placenta gewicht (Mariella et al., 2018). Voor de paardenindustrie (economisch en sportgericht) zijn parameters zoals gewicht en hoogte van het veulen bij geboorte belangrijk (Elliott et al., 2009; Peugnet et al., 2016a). Postnataal genetisch potentieel van veulens wordt – volgens wetenschappelijke studies – beïnvloed door de maternale omgeving (Allen et al., 2004; Tischner en Klimczak, 2010; Wilsher en Allen, 2010b). De schofthoogte van de receptormerrie zou geassocieerd zijn met de grootte van de uterus en dus effect hebben op de grootte van het veulen (Allen, 2005). Zelfs in 1938 werd de impact op intra-uteriene en postnatale ontwikkeling aangetoond via kruisingen tussen grote Shire paarden met kleine Shetland ponies (Walton et al., 1938). Meer dan vijftig jaar later heeft Hinrichs (1993) een studie uitgevoerd waarin pony-embryo’s werden overgeplant in trekpaardmerries. De uitkomsten werden vergeleken met broers en zussen die natuurlijk ter wereld werden gebracht. Hieruit is geconstateerd dat veulens – pony embryo’s in trekpaardmerries via ET – bij de geboorte groter waren en tevens proportionele afwijkingen ter hoogte van de lange beenderen hadden (Hinrichs, 1993). Volgens Stout (2006) zou een aanzienlijk verschil in schofthoogte tussen donormerrie en draagmerrie invloed hebben op de grootte van het veulen en in het slechtste geval leiden tot verhoogde mortaliteit tijdens de intra-uteriene ontwikkeling en de ontwikkeling na de geboorte (Stout, 2006). In de praktijk worden meestal draagmerries gebruikt die net niet dezelfde grootte en/of ras hebben als de donormerrie. Dit kan leiden tot fysiologische aanpassing die invloed kan hebben op de pre- en postnatale ontwikkeling van de nakomelingen(Peugnet et al., 2016b).

De belangrijkste operationele controlemechanismen – waardoor de ontwikkeling van de foetus gerelateerd is aan de grootte van de moeder – zijn dus het placentaal gebied, het gewicht van de placenta en het aantal microcotyledonen (Wilsher & Allen, 2002). De grootte van de baarmoeder (en dus de grootte van de merrie) bepaalt het beschikbare contactoppervlak tussen placenta en het endometrium; hetgeen de voeding verzorgt van de foetus (Peugnet et al., 2014). Alle voorafgaande gegevens zijn samengevat in Tabel 1.

Bij paarden zorgen microcotyledonen met intense vertakking voor maximaal contactoppervlak tussen het endometrium en de niet-invasieve, diffuse, epitheliochoriale allantochorion; waardoor maximale hemotrofe uitwisseling wordt gerealiseerd (Allen & Wilsher, 2009). Experimenten met embryo transfer tussen verschillende rassen hebben aangetoond dat er een rechtstreeks verband is tussen het geboortegewicht van het veulen en de oppervlakte van de placenta, het gewicht en het volume; waarvan de bruto oppervlakte van de placenta gerelateerd is aan de grootte en het ras van de merrie (Allen et al., 2004). De verhouding tussen het geboortegewicht van het veulen en het lichaamsgewicht van de moeder varieert ook; van 13,3% bij Shetland-pony’s tot 6,8% bij Shire-paarden (Platt, 1984). Om de placenta functie – als belangrijkste controlemechanisme van de groeiveranderingen van de foetus aan te tonen – werden experimenten uitgevoerd met embryo-overdracht tussen verschillende rassen (Allen et al., 2004; Peugnet et al., 2016b; Robles et al., 2018). Pony(P)-volbloed(V) en pony-trekpaard(T) drachten veroorzaakten een indrukwekkende toename in placentaal gewicht (respectievelijk + 59% en + 80%), in bruto gebied (respectievelijk + 22% en + 160%) en in microscopisch gebied van foetomaternaal contact (+ 83% bij P-V); leidend tot een hoger geboortegewicht (Allen et al., 2004). Dit hoewel er geen veranderingen werden waargenomen bij P-T placentale genen in vergelijking met P-P (Peugnet et al., 2016b). Bij V-P en Warmbloed(W)-P werd foetale groeivertraging gekoppeld aan placentabeperking, met verminderd placentaal gewicht (respectievelijk 39% en 19%), bruto oppervlakte (respectievelijk 30% en 40%), en microscopisch gebied van foetomaternaal contact (30% bij V-P) (Allen et al., 2004). Hoewel het bruto oppervlak van de placenta vergelijkbaar was, was de verhouding tussen microscopisch gebied van foetomaternaal contact en bruto oppervlak vergroot (55%) bij V-P placentae in vergelijking met P-P (Allen et al., 2004) (Tabel 2). Dit benadrukt de interactie tussen moeder en foetus. Uit het onderzoek lijkt het erop dat de receptormerrie als pony een constante placentagrootte heeft, ongeacht het ras van het embryo dat ze draagt. Toch slaagt de foetus van het grootste ras erin om het relatieve microscopisch gebied van foetomaternaal contact te vergroten. Deze toename kan worden veroorzaakt door verlenging of intense vertakking van de villi van de microcotyledonen (Allen et al., 2004).Naast de placenta is de navelstreng van groot belang voor de foetus. De navelstreng vormt de verbinding tussen de merrie en foetus en is verantwoordelijk voor het aanbrengen van nutriënten en zuurstof alsook verwijderen van gedeoxygeneerd bloed en afvalstoffen (Mariella et al., 2018).

In 2014 werd door Peugnet et al. het effect van embryotransfer in een groter of kleiner ras nagegaan met betrekking tot foetale groei, postnatale groei en metabolisme tot aan speenleeftijd. Zes pony(P)-trekpaard(T) veulens vertoonden (in vergelijking met de controlegroep van eenentwintig P-P veulens) een verhoogde foetale groei en bleven zwaarder tot speenleeftijd. Zes warmbloed(W)-P veulens ondergingen een beperkte foetale groei en bleven lichter van gestalte tot speenleeftijd, dit in vergelijking met de andere groep van acht W-T veulens (Peugnet et al., 2014). Betreffende de ontwikkeling na geboorte is er door Peugnet et al. (2016b) een longitudinale studie uitgevoerd omtrent groei en osteo-articulaire status bij veulens geboren via embryo transfer. Bij de zes pony(P)-in-trekpaard(T) veulens was de foetale groei verhoogd en tot een leeftijd van achttien maanden was er overgroei van de meeste lichaamsdelen. Bij zes warmbloed(W)-in-P veulens was de foetale groei eerder verminderd in vergelijking met acht W-in-T veulens. Alsook vermeerderde het

lichaamsgewicht, schouder- en heupbreedte tot aan het spenen trager bij de zes W-P veulens; nadien werd de groei ingehaald. Doch resulteerde W-P – in vergelijking met W-T veulens – op achttien maand in kleinere, lichtere veulens aangezien andere delen van het lichaam niet ingehaald waren. In vergelijking met acht W-T en eenentwintig W-W veulens hadden de zes W-P veulens een hogere incidentie wat betreft osteochondrose; alle waren positief kort na het spenen en twee van hen waren nog positief op de leeftijd van achttien maanden. Hieruit werd besloten dat er wel degelijk invloed is van de intra-uteriene omgeving op de groei, skeletale gezondheid en de mogelijke atletische capaciteiten (Peugnet et al., 2016b).

In een ander onderzoek van Allen et al (2004) werden de nakomelingen gevolgd tot de leeftijd van drie jaar. Zeven veulens ondergingen een ‘beperkt’ baarmoederbestaan – overdracht als volbloedembryo (V) naar pony merrie (P) – en zes veulens ondergingen een ‘luxueus’ baarmoederbestaan – overdracht als ponyembryo (P) naar volbloed merrie (V). Net na de partus was er vijftien procent verminderde of vergrootte groeiparameters waargenomen bij respectievelijk V-P en P-V veulens (Allen et al., 2004). Dit daalde naar vijf procent op de leeftijd van drie jaar. De groei post-partum was beïnvloed door de beperkte of verbeterde groei in de baarmoeder (Allen et al., 2004). Tijdens de eerste zes maanden post partum was het groeipercentage verhoogd bij de V-P veulens en eerder afgeremd bij de P-V veulens; in vergelijking met hun respectievelijke controlegroepen P-P en V-V. Over het algemeen waren er geen grote veranderingen in conformatie (Allen et al., 2004). Gedane onderzoeken en uitslagen betreffende het effect van het ras van de draagmerrie op het fenotype van de nakomelingen zijn ondergebracht in Tabel 3.

Tabel 1: Interacties tussen signalement van de merrie als eigenschappen van de placenta en het signalement van het veulen.

Schofthoogte veulen Geboorte- gewicht veulen Uterus Foetomaternaal contact Gewicht placenta Schoft- hoogte merrie + correlatie (Allen, 2005; Stout, 2006; Peugnet et al., 2014) + correlatie (Allen, 2005; Peugnet et al., 2014) + correlatie (Wilsher en Allen, 2002) Pariteit merrie + correlatie (Meirelles et al., 2017) + correlatie (Elliott et al., 2009) + associatie enkel Volbloeden (Mariella et al., 2018) + correlatie (Meirelles et al., 2017; Wilsher en Allen 2002, 2010; Elliott et al., 2019) Geen associatie (Wilsher en Allen, 2002) Geen associatie (Elliott et al., 2009) Leeftijd merrie + correlatie (Meirelles et al., 2017) Geen associatie (Elliott et al., 2009) + correlatie (Meirelles et al., 2017) Geen associatie (Wilsher en Allen, 2002) Foeto- maternaal contact + correlatie (Meirelles et al., 2017) + correlatie (Wilsher en Allen, 2002) Gewicht placenta + correlatie (Mariella et al., 2018; Allen et al., 2004)

Tabel 2: Kenmerken van de placenta bij embryotransfers tussen verschillende rassen. Percentages ten opzichte van respectievelijk pony-pony, pony-pony, volbloed-volbloed en warmbloed-warmbloed dracht. (Allen et al.,

2004; Peugnet et al., 2016b; Robles et al., 2018) Ras embryo Ras

receptor Gewicht placenta Bruto oppervlakte placenta Microscopisch gebied foetomaternaal contact Pony Volbloed + 59% + 22% + 83% Pony Trekpaard + 80% + 160% / Volbloed Pony - 39% - 30% - 30% Warmbloed Pony - 19% - 40%

Tabel 3: Gevolgen van embryo transfer – in grotere of kleinere rassen – op de foetale en postnatale groei. Ras embryo Ras receptor Leeftijd nakomelingen

Fenotype nakomelingen * Referenties

Pony Trekpaard 1) Geboorte 2) Tot 6 maand 3) Tot 1,5 jaar

1) van alle lichaamsafmetingen 2) groei vóór het spenen 3) Overgroei ( schofthoogte – beenlengte) Tischner et al., 1985. Hinrichs, 1993. Tischner, 2000. Tischner & Klimczak, 2010. Peugnet et al., 2014. Peugnet et al., 2015. Peugnet et al., 2016b.

Pony Volbloed 1) Geboorte

2) 2 jaar

3) 3 jaar

1) meeste lichaamsafmetingen (15% vergrootte parameters) 2) lichaamsgewicht – beenlengte –

diameter metacarpaal been 3) 5% vergrootte parameters

Allen et al., 2002. Allen et al., 2004.

Volbloed Pony 1) Geboorte

2) Tot 2 jaar 3) 2 jaar 1) meeste lichaamsafmetingen (15%) (intra-uteriene groeiachterstand) 2) Disharmonische inhaalgroei 3) meeste lichaamsmetingen (5%) Allen et al., 2002. Allen et al., 2004.

Warmbloed Pony 1) Geboorte

2) Tot 1,5 jaar 3) 1,5 jaar 1) alle lichaamsmetingen (intra-uteriene groeiachterstand) & dysmaturiteit 2) Disproportionele inhaalgroei 3) meeste lichaamsmetingen Peugnet et al., 2014. Peugnet et al., 2016b.

Tabel 3: Kenmerken van de placenta bij embryotransfers tussen verschillende rassen, vergeleken .

* Fenotype nakomelingen bekomen via embryo transfer, in vergelijking met nakomelingen gedragen door de biologische moeder

2.3.3 Huisvesting draagmerrie

Een goed management en huisvesting dragen bij tot de gezondheid van een draagmerrie met positieve resultaten op haar drachtpercentage. De merries in een fokprogramma dienen een optimale lichaamsconditie te behouden tijdens dracht en lactatie, passend aan de energiebehoefte (Peugnet et al., 2016a). Een adequate ondersteuning heeft een positief effect op de fertiliteit en ontwikkeling van de foetus (Brinsko et al., 2011). Het stressniveau moet worden geminimaliseerd door goede voeding, toegang tot proper water, onderdak en leven in kuddeverband (McCue & Squires, 2015). Het is belangrijk om draagmerries na transfer bij hun kudde te laten, aangezien sociale stress – geassocieerd met verplaatsen van een merrie in een nieuwe groep – het drachtpercentage kan beïnvloeden (McCue & Squires, 2015).

Draagmerries worden meestal gehuisvest in een kudde van ongeveer vijftien à vijventwintig merries op een paddock of weide (Brinsko et al., 2011). Stress kan ook worden veroorzaakt door ziekte of verwondingen; welke dus moeten vermeden worden (Brinsko et al., 2011). Een andere vorm van stressfactor is transport. In een onderzoek van Nagel et al. werden hoog drachtige merries op transport geplaatst gedurende drie uur en vergeleken met hoog drachtige merries die in hun stal bleven; om zodoende de stresseffecten – door verhoogd maternaal cortisol gehalte – op het moment van de partus te bepalen. Hieruit bleek dat de geïnduceerde maternale afgifte van cortisol de start van de partus zou kunnen bevorderen (Nagel et al., 2020).

Drachtige merries moeten in goede lichaamsconditie gehouden worden, liefst met een body conditie score van 6/9 of 7/9 (Bijlage 1), ofwel stijgen in gewicht bij het begin van de dracht (Brinsko et al., 2011). Anderzijds merries mogen niet lijden aan obesitas aangezien dit geassocieerd wordt met de geboorte van zwakke, te kleine veulens alsook kan dit leiden tot dystocie (Brinsko et al., 2011). Henneke et al. beschrijven eerder dat – van zodra de energiebalans negatief wordt – de merrie opgeslagen nutriënten mobiliseert om een adequate groei en ontwikkeling van de foetus te verzekeren via de placenta (Henneke et al., 1984). Om de rol van de placenta op de ontwikkeling van het veulen aan te tonen werden diverse onderzoeken gevoerd aan de hand van verschillende voedingspatronen van de drachtige merrie. Volbloedveulens geboren uit merries met een matig dieet hadden een vergelijkbaar geboortegewicht met diegene waarvan de moeder een zwaarlijvig dieet kreeg; doch waren de placentae van deze laatste groep groter (11%) (Ousey et al., 2008). In dit experiment was maternaal gewichtsverlies negatief gecorreleerd met het gewicht van de placenta, bruto oppervlakte en microscopisch gebied van foetomaternaal contact; maar positief gecorreleerd met placenta-efficiëntie (Ousey et al., 2008). Tijdens de laatste drie maanden van de dracht zal 60 tot 65% van de groei van de foetus plaatsvinden en bijgevolg is goede kwaliteit van voeder zeker aangewezen (Brinsko et al., 2011). Over het algemeen lijkt het geboortegewicht van veulens niet te veranderen door matig gewichtsverlies van de drachtige merrie; doch kan het zijn dat het de kwaliteit van het colostrum negatief beïnvloedt, waardoor de passieve immuniteit en het groeipercentage van het veulen wordt verlaagd (Thorson et al., 2010; Peugnet et al., 2016a). In een epidemiologisch onderzoek met volbloeden blijkt dat de gewichtstoename bij lacterende merries leidde tot een snelle groei bij de veulens tijdens de piek (leeftijd van twee à drie maanden leeftijd), met een positieve correlatie tussen body condition score van de veulens en de dagelijkse gewichtsveranderingen van de merries (Pagan et al., 2012). Specifieke voedingsbehoeften voor dragende en lacterende merries zijn te vinden via de National Research Council (NRC), maar deze vallen buiten deze literatuurstudie. Naast voeding is regelmatige controle (en behandeling) van de

tanden aangewezen om goed te kunnen grazen en voedsel te vermalen, zodoende dat de lichaamsconditie blijft behouden en verteringsproblemen voorkomen worden (Brinsko et al., 2011).

2.3.4 Ontworming draagmerrie

Naast goede voeding en een goed management is regelmatige ontworming ook belangrijk. Controle en behandeling van de drachtige merrie tegen gastro-intestinale parasieten zijn cruciaal om ernstige besmetting bij het pasgeboren veulen te voorkomen (Pinto, 2009). Tevens is het belangrijk om zo hun algemeen welzijn en body condition score optimaal te houden, welke dan weer impact heeft op de drachtresultaten zoals reeds eerder besproken. Er zijn verscheidene producten beschikbaar op de markt om de blootstelling aan interne parasieten onder controle te houden en parasitaire besmettingen te elimineren; zoals ivermectine, pyrantel, fenbendazole en dergelijke meer (Brinsko et al., 2011). Over het algemeen zijn antihelmintica veilig bevonden voor drachtige merries tenzij anders vermeld op het label (Brinsko et al., 2011). Het is gebruikelijk om ivermectine aan de merrie toe te dienen op de dag van partus om zo de parasitaire belasting van Strongyloides Westeri te minimaliseren, waarvan de larven overgebracht worden naar het veulen rond dag vier postpartum (Brinsko et al., 2011).

Naast een goed ontwormingsschema is regelmatig onderzoek van faeces aangewezen – om het aantal parasitaire eitjes na te gaan alsook te monitoren op antihelmintische resistentie – en correct weidemanagement (zoals lage densiteit per hectare, regelmatige rotatie, maaien et cetera) te handhaven. Dit allemaal ook om zodoende de besmetting voor het veulen te verminderen (Coles et al., 2006; Pinto, 2009; Brinsko et al., 2011). In de eerste levensweken zijn veulens gevoeliger voor Strongyloïdes en Parascaris, welke worden overgedragen via de huid, melk of de placenta bij prenatale besmetting (Knottenbelt, 2003). Sommige auteurs raden aan om de drachtige merrie dertig dagen en tien dagen voor de partus te behandelen met een volledige dosis. Tien dagen na de partus wordt een larvaciede dosis voorgesteld (Knottenbelt, 2003; Pinto, 2009).

2.3.5

Vaccinatie draagmerrie

Het is van belang om preventieve maatregelen te treffen om de gezondheid van de drachtige merrie te vrijwaren. Regelmatige immunisatie tegen verschillende infectieuze ziekten is belangrijk voor de bescherming van de merrie zelf tegen infectieziekten die haar direct kunnen beïnvloeden en/of abortus veroorzaken. Verder kan dit eventueel bescherming van het pasgeboren veulen bieden door onder andere de kwaliteit van de biest bij de merrie te verbeteren (Pinto, 2009; Brinsko et al., 2011). Fokmerries moeten in de laatste vier tot acht weken worden ingeënt tegen ziekten waarvoor het veulen de eerste levensmaanden een hoog risico loopt (Pinto, 2009). In het colostrum zullen antistoffen geconcentreerd zijn en ter beschikking staan bij start van de lactatie.

Aangezien paarden een diffuse epitheliochoriale placenta bezitten, is er geen overdracht van antistoffen doorheen de placenta. Hierdoor is de opname van colostrum van uitermate belang om hoge levels aan immunoglobuline G bij het pasgeboren veulen te bekomen (Jeffcott, 1974; Kohn et al., 1989; Zou et al., 1998; Giguère & Polkes, 2005; Brinsko et al., 2011). Verschillende auteurs bieden belangrijke richtlijnen aan betreffende vaccinatie protocollen voor fokmerries en veulens (Lunn & Townsend, 2000; Wilson, 2005; Barquero et al., 2007; Pinto, 2009; Brinsko et al., 2011). Kenmerken

van de immuunrespons zoals type en duur – eveneens de doseringsfrequentie – zijn sterk gerelateerd aan het type vaccin (Pinto, 2009). Zo zijn er dode en levende vaccins, maar een verder gedetailleerd beschrijven behoort niet tot deze literatuurstudie.

Een overzicht van het vaccinatieprotocol is weergegeven in Tabel 4. Hier zullen enkel de standaardvaccins gebruikt in België besproken worden. Op sommige stoeterijen met bijvoorbeeld diarree problemen zal er gevaccineerd worden tegen Rota/Corona, maar deze vallen buiten de kwestie voor deze literatuurstudie. Vooreerst is bescherming tegen Clostridium Tetani een vereiste. Tetanus is een sporadische, niet-besmettelijke infectieuze ziekte (Pinto, 2009). Deze ziekte heeft voor zowel de moeder als haar veulen levensbedreigende gevolgen. In vaccinatieprogramma’s dient een vaccin met tetanustoxoïd verplicht te zijn en wordt er tevens één maand voor partus een boostervaccin gegeven, dit om zo een goede concentratie aan antistoffen in het colostrum te bekomen (Pinto, 2009; Brinsko et al., 2011). Een volgend virus dat aandacht vereist is het Equine Herpesvirus (EHV). Het Equine Herpesvirus I en Equine Herpesvirus IV zijn endemische ziekten die wereldwijd aanwezig zijn in de paardenpopulatie. Deze virussen kunnen aanzienlijke economische verliezen veroorzaken omwille van abortus (voornamelijk veroorzaakt door EHV-1); respiratoire aandoeningen zoals rhinopneumonie bij veulens, opgroeiende paarden en soms volwassen paarden; veulensterfte en (eerder zelden) paralyse door neurologische aantasting ( Heldens et al., 2001a ; Smith et al., 2010b; Brinsko et al., 2011; Kapoor, 2014; Loh et al., 2015; Khusro et al., 2020;). EHV-1 infecteert paarden ouder dan twee jaar en verspreidt zich voornamelijk via paard-paard contact of contact met geaborteerde foetus of placenta (Oladunni et al., 2019). Voor drachtige merries is vaccinatie tegen Equine Herpesvirus I van zeer groot belang, abortus door EHV-1 komt namelijk jaarlijks voor. Uitbraken bestaan meestal uit een of twee abortussen maar abortusstormen kunnen resulteren in het verlies van meerdere veulens (Mumford et al., 1987). EHV-1 kan bij primaire blootstelling geen enkele vorm van symptomen vertonen maar een latente infectie veroorzaken. Dit kan nog infecties veroorzaken bij in-contact paarden en verder ook de foetus in gevaar kan brengen. Hierdoor worden deze individuen als het ware “reservoirs” voor het virus en zijn ze verantwoordelijk voor de verdere verspreiding (Allen, 2010). Deze latente infectie kan een periode van re-activatie ondergaan als gevolg van stress (Slater et al., 1994; Brinsko et al., 2011; Oladunni et al., 2019; Khusro et al., 2020) . Abortus komt meestal voor in het laatste trimester, vermoedelijk net door het reactiveren van het latente virus (Heldens et al., 2001a). Perkins et al. (1999) beschrijven dat abortus – als gevolg van EHV-1 – plaatsvindt twee tot twaalf weken na de infectie in de late dracht en volgens Khusro et al. (2020) varieert de incubatieperiode van negen tot honderdtwintig dagen. Ondanks de infectie blijft de geslachtstractus van de merrie onaangetast, maar tijdens de dracht kan de infectie binnen een beperkte periode leiden tot de geboorte van een dood veulen (Perkins et al., 1999). Het virus migreert dus onder andere naar de uterus. Hierbij zullen de geïnfecteerde lymfocyten zich vasthechten aan de endotheelcellen van kleine bloedvaten die de placenta voeden (Smith et al., 1992). EHV-1 is meer endotheliotroop dan EHV-4, aldus gaat de vermenigvuldiging onder andere door in het endotheel van de bloedvaten van het endometrium (Heldens et al., 2001b). Deze geïnfecteerde endotheelcel zal dan eiwitstolsels vormen en zo trombose en schade aan de bloedvaten veroorzaken (Smith et al., 1992). Hierdoor zal inflammatie van de bloedvaten optreden, waardoor er schade ontstaat aan de placenta. Op deze manier kan het virus leiden tot abortus van het veulen (Smith et al., 2010b). Zoals reeds vermeld, blijft de geslachtstractus van de merrie onaangetast tijdens infectie en heeft de geïnduceerde abortus geen invloed op de latere reproductieve carrière van de merrie (Crabb & Studdert, 1995). Het is mogelijk dat er geen abortus

optreedt, dat het veulen levend geboren wordt en kort na de geboorte alsnog sterft door ademhalingsinfecties. Dit kan tevens veroorzaakt zijn door EHV-1 indien het virus op een later moment in de dracht voor een infectie heeft gezorgd (Crabb & Studdert, 1995). Abortus – geassocieerd met EHV-1 infectie – voorkomen blijft controversieel (Brinsko et al., 2011). Door te vaccineren stimuleer je een immuunrespons omdat het lichaam denkt dat er een infectie aan de gang is en als reactie antistoffen en andere immuunmechanismen zal induceren (Kapoor, 2014). Zowel humorale als cellulaire responses zijn essentieel voor een succesvolle vaccinatie tegen EHV-1 infectie (Rusli et al., 2014). Het vaccin beschermt tegen respiratoire infectie, systemische verspreiding van EHV-1 via cel-geassocieerde viremie en reactiveren van het virus (Rusli et al., 2014). Er zijn verscheidene vormen aan virusvaccins zoals volledig geïnactiveerd EHV-1, inert (dood virus, subunit eiwittten of DNA) of geattenueerd virus (Minke et al., 2004). Bijvoorbeeld is er Equip EHV 1,4® van Zoetis in België op de markt, bevattende het geïnactiveerd rhinopneumonievirus. Het is belangrijk dat de merries (vooraleer gebruikt te worden als draagmerrie) een correct gevaccineerd protocol hebben doorlopen: namelijk een eerste vaccinatie tussen de leeftijd van drie en vijf maanden, een tweede immunisatie vier à zes weken later en dan om de drie à zes maanden een eenmalige herhalingsdosis (Khusro et al., 2020). Tijdens de dracht wordt er dan opnieuw gevaccineerd. Het wordt aangeraden om het geïnactiveerd vaccin toe te dienen rond maand vijf, maand zeven en maand negen in de dracht; en op datzelfde moment ook de niet-drachtige merries te vaccineren (Heldens et al., 2001b; Minke et al., 2004; Brinsko et al., 2011). Een geattenueerd levend vaccin wordt bij voorkeur geïnjecteerd na de tweede maand van de dracht en dan nog eens drie maanden later (Brinsko et al., 2011). Nochtans vermelden de bijsluiters van de producten niet dat er bescherming is tegen abortus geassocieerde EHV-1.Het is anderzijds dan wel bekend dat er bij herpesvirussen geen langdurige immuniteit opgewekt wordt en het dus van belang is om boostervaccins toe te dienen (Brinsko et al., 2011). In 2001 hebben Heldens et al. een experiment uitgevoerd om na te gaan wat de klinische en virologische werkzaamheid is van een geïnactiveerd vaccin tegen EHV-1 en EHV-4. Dit werd onderzocht bij zowel jonge veulens als drachtige merries. Hieruit bleek dat het level van antistoffen na een tweede boostervaccin duidelijk gestegen was, doch niet dezelfde hoogte bereikte als na een virusinfectie. Bij gevaccineerde dieren is een duidelijke daling zichtbaar in het vertonen van klinische symptomen, de duur van de virusuitscheiding en de hoeveelheid ervan. Door merries te vaccineren met een EHV1,4 vaccin wordt het risico op abortussen en uitbraken van respiratoire ziekten – veroorzaakt door in het veld circulerende virussen – aanzienlijk verminderd (Heldens et al., 2001b). Door de lokale immuunrespons te stimuleren wordt de kans op overdracht verkleind, doch elimineert dit de reeds bestaande latente EHV-1 infecties niet (Brinsko et al., 2011).

Een derde virus is het influenza A type A1, behorende tot de Orthomyxoviridae-familie. Bij paarden kan influenza bij immunologisch naïeve individuen leiden tot besmettelijke luchtwegaandoeningen. Klinische symptomen zijn onder meer koorts, hoest, sereuze neusuitvloeiing en (in sommige gevallen) lymfadenopathie. Secundaire gevolgen zijn onder meer bacteriële longontsteking, myositis, myocarditis en oedeem ter hoogte van de ledematen (Pinto, 2009). Tevens is er sterfte gemeld bij veulens (Peek et al., 2004). Geïnactiveerde vaccins induceren voldoende productie van antistoffen – gecorreleerd met het beschermingsniveau – maar geen optimale cellulaire respons (Wood et al., 1983; Lunn & Townsend, 2000; Morley et al., 2000; Paillot et al., 2006). Volgens sommige auteurs zouden de geïnactiveerde vaccins het risico op de ziekte niet verminderen bij recent gevaccineerde paarden. Hierbij was de duur van de symptomen wel korter en was er eveneens een totale

onderdrukking van virale excretie met een beschermingsduur van vijf maand na de tweede dosis (Morley et al., 1999; Toulemonde et al., 2005; Paillot et al., 2006).

Naast het vaccineren op regelmatig geplande intervallen, is het uitermate belangrijk om een aangepast management – in verband met bioveiligheid – uit te voeren. Drachtige merries moeten apart gehuisvest worden, het stressniveau moet minimaal zijn, een stabiele groep moet behouden worden (i.e. zonder veelvuldig nieuwe paarden die toekomen en vertrekken), merries die geaborteerd hebben moeten geïsoleerd worden en merries die hiermee in contact zijn geweest dienen een boostervaccin te ontvangen. Strikte hygiëne is uitermate belangrijk (Brinsko et al., 2011; Khusro et al., 2020).

Tabel 4: Vaccinaties bij de fokmerrie (Naar: Equine breeding management and artificial insemination. Pinto, 2009)

Ziekte Drachtige merrie voorafgaand gevaccineerd

Drachtige merrie niet gevaccineerd of ongekende vaccinatie-status Tetanus Jaarlijks 4-6 weken voor de partus Dubbele vaccinatie (4-6 weken tussen)

Hervaccinatie 4-6 weken voor de partus EHV Driedubbele vaccinatie: toedienen in

maand vijf, maand zeven en maand negen van de dracht

Jaarlijks, maar best zesmaandelijks revaccinatie interval voor:

- Paarden <5 jaar

- Paarden op fokbedrijven of in contact met drachtige merries

- Sportpaarden met een hoog risico Influenza Halfjaarlijks met één dosis toe te

dienen 4-6 weken voor de partus

Driedubbele vaccinatie

- Tweede dosis: 4-6 weken na eerste dosis

3.

Onderzoek

3.1 Probleemstelling en doelstelling

Paarden worden geselecteerd op temperament, snelheid, kracht en uithoudingsvermogen. Het onderzoeken van het effect van de maternale omgeving op het genetisch potentieel van het postnataal veulen wordt ook steeds belangrijker (Arnason & Vleck, 2009). Paarden hebben een tweeledig doel als sporter en als gezelschapsdier welke de interesse in genetische effecten verklaart (Johnson et al., 2009). Het onderzoek in deze literatuurstudie stelt zich rond de vraag: wat is het effect van een draagmerrie op de ontwikkeling van het veulen, dewelke andere genen bezit? Deze zogenaamde epigenetische effecten worden getracht in beeld te brengen. Om resultaten te bekomen dienen er gegevens te worden verzameld van zowel donormerries, draagmerries en veulens. Als donormerries worden er Arabische Volbloeden en Belgische Warmbloeden gebruikt, de draagmerries behoren tot het ras van de Franse Dravers. Met deze gegevens trachten we een groeicurve te bekomen van het veulen. Zo zal er in kaart worden gebracht hoe de ontwikkeling en groei van het veulen zich manifesteert met, al dan niet, het effect van de receptormerrie. De bekomen gegevens zijn zelf opgemeten data. Om een representatieve uitslag te bekomen zal een vergelijking gemaakt worden met merries die zelf een dracht hebben doorlopen tot de partus en hun veulens grootbrengen tot speenleeftijd.

3.2 Materiaal en methoden

Oprichting van experimentele en controle groepen

Er werden experimentele en controle groepen opgericht gedurende één fokseizoen, met name van maart 2019 tot december 2019. De drieëndertig merries – donor en zelfdragende, waarvan genetische nakomelingen werden bekomen – bevonden zich per ras op een andere stalling. De Arabische Volbloedpaarden – met hun Franse Dravers als receptormerries – waren gestald in West-Vlaanderen (= stoeterij 1). De Belgische Warmbloedpaarden – met hun Franse Dravers als receptormerries – situeerden zich in Oost-Vlaanderen (= stoeterij 2). In totaal waren er negentien donormerries voor de experimentele groep, vijventwintig draagmerries en vierteen zelfdragende merries voor de controle groep. Er waren twee tweeling embryo’s. De gemiddelde leeftijd van de donormerries was 8,3 jaar (bereik van 4 – 19 jaar). De gemiddelde leeftijd van de zelfdragende merries was 10,9 jaar (bereik van 4 – 22 jaar). De gemiddelde leeftijd van de receptormerries was 8,6 jaar (bereik van 4 – 19 jaar; twee leeftijden niet gekend). Van vijftien receptormerries was de pariteit bekend en dit waren zowel primipare en pluripare merries (tot acht drachten). In totaal werden er vijventwintig veulens geboren na embryo transfer; negen warmbloed-in-draver (W-D) en zestien Arabische Volbloed-in-draver (V-D). Zes warmbloed-in-warmbloed (W-W) en acht Arabische Volbloed-in-Arabische Volbloed (V-V) controle veulens werden gefokt via kunstmatige inseminatie, al dan niet door dezelfde hengsten als bij de embryotransfer. In Figuur 6 werd dit schematisch voorgesteld.