‘’Optimalisatie van amplificatie van Bcelreceptor
transcripten van IgEpositieve Bcellen om de complexiteit
van het IgErepertoire in kaart te brengen door
grootschalige parallelle sequencing.’’
Bachelor eindproject.
Samenvatting
In dit experiment is gezocht naar een methode om IgE transcripten te amplificeren uit gezond donor materiaal om het IgE repertoire voor gezonde donoren in kaart te brengen. Een variatie op de ARTISAN PCR methode met drie ronden seminested PCR is optimaal gebleken. Het doel is het IgE repertoire op te bouwen uit minimaal 5000 sequenties verdeeld over 10 gezonde donoren. Uit de eerste 28 IgE sequenties, verdeeld over 3 donoren, bleek sprake te zijn van een hoog mutatieratio (8,2%) in het V domein van de IgE Sequenties. Daarnaast is er reeds sprake van één kloon in de eerste 28 IgE sequenties.
Inhoudsopgave
Inleiding
4
Materiaal & Methoden
7
Opzet van samples. 8 mRNA isolatie. 12 cDNA synthese. 12 PCR. 13 Gel electroforese. 15 PacBio/Sanger sequencing. 16
Resultaten
17
Geoptimaliseerd protocol. 17 IgE repertoire van gezonde donoren. 23Discussie
24
Dankwoord
24
Literatuur
25
Bijlagen
26
Inleiding
B cellen behoren tot de klasse witte bloedcellen, waarin B cellen de functie hebben antilichamen te produceren die lichaamsvreemde antigenen te herkennen om een humorale afweerreactie in gang te zetten (Parham, 2009). Iedere B cel produceert een uniek antilichaam welke dient als receptor op het celmembraan en specifiek kan binden aan een antigen. Binding tussen een antilichaam en antigen activeert de bijbehorende B cel, waarop er proliferatie van deze B cel plaatsvindt en differentiatie tot plasma cellen, die dit antilichaam uitscheiden om de bijbehorende indringer effectief te verwijderen (Parham, 2009). Antilichamen zijn immunoglobulinen en bestaan uit een lichte en zware keten met elk een variabel en constant domein, waar B cellen door de variabele delen een grote variëteit aan unieke antilichamen produceren (Parham, 2009). De verscheidenheid in het variabele deel van het antilichaam transcript ontstaat door recombinatie van verschillende gen segmenten, die verdeeld over het chromosoom liggen (Parham, 2009). Het variabele domein voor de zware ketens van immunoglobulinen zijn opgebouwd uit de variabele(V), diversiteits(D) en verbindende(J) gen segmenten, waar individuele delen uit de segmenten zich combineren tot één functioneel variabel domein voor de zwarte keten (Parham, 2009). De lichte keten kent een vergelijkbaar proces, maar dan zonder het diversiteits(D) segment. Recombinatie tussen de V(D)J gen segmenten heet somatische recombinatie en tezamen met het koppelen van verschillende zware en lichte ketens levert dit een totaal van 1,6 miljoen mogelijke antilichamen (Parham, 2009). Behalve de recombinatie van gen segmenten dragen recombinatie enzymen, die de aparte gen segmenten aan elkaar koppelen, bij aan de diversiteit van de antilichamen. Zo worden in de verbindingen tussen V,(D) en J van de zware en lichte ketens willekeurige nucleotiden ingebouwd, wat de totale diversiteit met een factor 3,0.107 vergroot (Parham, 2009). Na activatie van een B cel zorgt somatische hyper mutatie voor verdere diversiteit door puntmutaties in de variabele domeinen van het antilichaam te brengen. Waar er verschillende isotypen immunoglobulinen (IgM, IgG, IgA, IgD, IgE) bestaan met elk een functie in het afweersysteem, richt dit onderzoek zich op het antilichaam met als zware keten het isotype IgE (Parham, 2009). IgE heeft als functie een antiparasitaire werking, maar is ook een belangrijke schakel in het ontstaan van allergische reacties (Galli & Tsai, 2012), doordat het onschadelijke antigenen bindt en mestcellen activeert om histamine uit te scheiden, resulterend in allergische symptomen(Parham, 2009). Over het menselijke IgE repertoire is weinig gedetailleerde kennis in vergelijking tot overige isotypen immunoglobulinen (Gadermaier, Levin, Flicker, & Ohlin, 2013). Literatuur wijst uit dat het merendeel van het onderzoek zich focust op allergische patiënten en het meest uitgebreide onderzoek baseert zich op 1366 transcripten verdeeld over 13 patiënten (Appendix A). Wat het lastig maakt IgE van gezonde personen tecellen, T cellen en monocyten (Gadermaier et al., 2013). Door de beperkte kennis en methodologische beperkingen spelen er onduidelijkheden over de genetische samenstelling en het exacte IgE reactieproces, zo is bekend dat het variabele domein van de zware keten in de helft van alle antilichamen is opgebouwd uit genen van subgroep IGHV 3 van de 7 subgroepen in het V gen segment (Gadermaier et al., 2013). Ook binnen het reeds bekende IgE repertoire is aanwezigheid van de IGHV 3 subgroep in het V gen segment gevonden, echter is de relatie tussen de verschillende V(D)J recombinatie en allergische reacties nog niet duidelijk. Een andere onduidelijkheid die bestaat, is de vorming van het isotype IgE. Het is onduidelijk of het IgE antilichaam voort komt uit een directe klasse overgang van IgM naar IgE of met een tweestaps klasse overgang van IgM via IgG naar IgE, waar momenteel te weinig data voor beschikbaar is om uitsluitsel te geven (Gadermaier et al., 2013). De tot noch toe bekende IgE repertoires zijn oligoclonaal, dus er zijn enkele verschillende B cellen waar veel klonen van aanwezig zijn. Echter kunnen deze IgE positieve B cellen geactiveerd zijn door specifieke antigenen en zo zijn er tijdelijk veel klonen van de geactiveerde en prolifererende B cellen aanwezig (Gadermaier et al., 2013). Zo is het oligoclonale karakter van het IgE repertoire niet representatief voor de diversiteit van IgE. Het doel is een methode te ontwikkelen dat sequenties van IgE transcripten van gezonde donoren in kaart kan brengen. Hiertoe dient de methode de capaciteit te hebben om specifieke IgE positieve B cellen te analyseren, die in lage aantallen en concentraties aanwezig zijn in het totaal van PBMCs. Indien een succesvolle en optimale methode is gevonden om IgE sequenties te verkrijgen vanuit in lage concentraties aanwezige IgE positieve Bcellen, kan dit protocol toegepast worden om het IgE repertoire van gezonde donoren in kaart te brengen. Tot op heden is het voornaamste onderzoek naar IgE en het IgE repertoire uitgevoerd op allergische patiënten, daarom is een uitgebreid IgE repertoire van gezonde mensen vereist om dit te kunnen vergelijken (Gadermaier et al., 2013). Op deze manier kan inzicht en kennis in het ontstaan van allergische reacties vergroten en zo bijdragen om allergische reacties beter te behandelen in te toekomst. Het breedst uitgevoerde IgE repertoire experiment omvat een analyse van 1366 transcripten verdeeld over 13 patiënten (Appendix A), waar de intentie van dit onderzoek is om, bij een succesvol ontwikkelde methode, minimaal 5000 IgE transcripten verdeeld over 10 gezonde donoren te verkrijgen. Daarnaast kan het IgE repertoire van gezonde donoren uitsluitsel geven over de twee theorieën in het ontwikkelingsproces van IgE; één daarvan gaat uit van een directe overgang van IgM naar IgE en de andere theorie van een tweestaps overgang van IgM via IgG naar IgE (Gadermaier et al., 2013). Wanneer de karakteristieke recombinaties en mutatieratio’s van IgE, IgG en IgM binnen een gezonde donor vergeleken zijn, dan kan op basis van
somatische hypermutatie ondervinden en de mutaties dus niet representatief zijn voor het isotype klasse overgangsproces (Parham, 2009)(Gadermaier et al., 2013). Tevens biedt een vergelijking met de overige repertoires inzicht of IgE in gezonde donoren op basis van recombinatie en karakteristieken verschilt. In allergische patiënten zijn veelal oligoclonale IgE positieve B cellen gevonden, wat een gevolg is van het activeren van enkele IgE positieve B cellen waarop deze zich prolifereren en vermenigvuldigen. In gezonde nietallergische donoren is de het klonale karakter van de IgE positieve B cellen niet bekend (Gadermaier et al., 2013); het IgE repertoire kan zodoende inzicht geven in het poly, oligo of nonklonale karakter van het IgE repertoire door de frequenties te analyseren waarin dezelfde IgE sequenties voorkomen bij verschillende B cellen. Al met al is het van belang om een betere methode te creëren die IgE onderzoek toegankelijker maakt. Hiertoe is allereerst gekeken naar soortgelijke studies, waarbij IgE sequenties zijn gegenereerd, ter oriëntatie voor mogelijk te testen methoden. De standaard gehanteerde methode is ARTISAN PCR (Appendix B), binnen de kaders van deze methode is geëxperimenteerd om de methode toepasbaar te maken voor het amplificeren van specifieke IgE gen transcripten uit lage cel aantallen en concentraties. Verschillende opties voor de onderdelen van sample samenstelling, mRNA isolatie, cDNA synthese en PCR zijn verkend en geanalyseerd. Dit om tot een succesvolle en optimale methode te komen die valide is om IgE transcripten te ampliceren ten behoeve van het IgE repertoire van gezonde donoren. Elk specifiek punt van de ARTISAN PCR is nader uitgewerkt in de ‘Materiaal en methoden’, waar het plan richting een optimale en succesvolle methode is uitgewerkt om het amplificeren van IgE gen transcripten uit gezonde nietallergische donoren te realiseren.
Materiaal en methoden
ARTISAN PCR
Om specifieke gen transcripten voor immunoglobulinen te verkrijgen dienen de verschillende stappen van de ARTISAN PCR methode (Appendix B) doorlopen te worden. Zo is het gewenste celmateriaal allereerst geïsoleerd vanuit de kweek of PBMCs waarin deze zich bevinden. Hierop volgend zijn de cellen gelyseerd, waarbij het celmateriaal vrijkomt, en is het mRNA geïsoleerd uit deze oplossing met al het celmateriaal. Het isoleren van het mRNA vindt plaats door magnetische ‘Dynabeads’ aan de poly(A)staarten van het mRNA te binden en het mRNA met Dynabeads met een magneet te scheiden van het overige celmateriaal. Vervolgens zijn het mRNA en de Dynabeads gescheiden door hitte. Het mRNA is vervolgens gebruikt in de cDNA synthese, waar het enzym reverse transcriptase complementair DNA synthetiseert tegenover het mRNA door een gen specifieke reverse primer in het constante deel van de immunoglobuline sequentie te binden. Door het uiteinde van het cDNA te verlengen met enkele C nucleotiden en hier complementair G nucleotiden tegen te plaatsen is, kan een ‘forward anchored primer’ binden buiten het variabele deel van de immunoglobuline. Wanneer deze verlenging niet zou gebeuren dan dient voor verdere amplificatie in de PCR de forward primer in het variabele gedeelte te binden, waardoor de forward primer gemuteerde transcripten in het variabele deel niet bindt en deze transcripten niet terugkomen in het resultaat. Nu het cDNA van de coderende immunoglobuline genen is verkregen is het cDNA product geamplificeerd met de PCR methode. De mRNA streng laat los van het enkelstrengs cDNA door de temperatuur te verhogen tot het product denatureert. Een forward primer bindt het cDNA en vanaf daar synthetiseert een polymerase het geheel tot dubbelstrengs DNA en nieuwe rondes van denaturatie, binding van primers en synthese resulteren uiteindelijk in kopieën dubbelstrengs immunoglobuline transcripten DNA eindproduct. Een agarose gelelektroforese kan tot slot analyseren of vanuit de geïsoleerde cellen met de PCR inderdaad de gewenste producten zijn geamplificeerd met de juiste basenparen lengte. Tot slot zijn de PCR producten als insert geligeerd in een vector, bestemd voor het transformeren van bacteriën, om ze gereed te maken voor de Sanger Sequencing waarmee de specifieke immunoglobuline sequenties zijn achterhaald. Optimalisatie ARTISAN PCR voor IgE positieve B cellen Binnen de verschillende onderdelen van de procedure zijn variaties in technieken en hoeveelheden mogelijk, deze variaties zijn getoetst op optimaal resultaat met het uiteindelijke doel om IgE sequenties uit IgE positieve B cellen te analyseren. Om tot verscheidende theorieën en methoden te komen zijn soortgelijke studies onderzocht (Appendix C) en in de
MACS selectie vereist om alleen met B cellen te werken voor de amplificatie van IgE transcripten of slechtst IgE positieve B cellen door IgE FACS selectie. Binnen de onderdelen van mRNA isolatie en cDNA synthese is eveneens geëxperimenteerd op de juiste hoeveelheid en gen specifieke cDNA primers tegenover oligo(dT) primers die cDNA maken tegenover al het mRNA. In het PCR onderdeel, met als functie de IgE transcripten te amplificeren, is eveneens getest op verschillende PCR methoden om een beter resultaat te verkrijgen; zoals touchdown PCR, seminested PCR of een reguliere PCR methode. Tussentijdse resultaten van gebruikte methoden zijn geanalyseerd, waarop onderbouwde wijzigingen in de methodiek zijn aangebracht ter optimalisatie van de gen amplificatie uit lage concentratie cel aantallen. De materiaal en methoden bieden een kijk in de werkwijze en technieken die zijn gebruikt, echter is alleen verder gewerkt met werkbare resultaten die nieuw inzicht verlenen, hierom zullen enkele methoden die niet hebben bijgedragen aan verder onderzoek of aan het uiteindelijke resultaat niet uitvoerig terugkomen in de resultaten. De verschillende methodologische stappen zijn hieronder nader gespecificeerd. Opzet van samples De eerste stap is de aard van het beginmateriaal waar mee gewerkt is; cellen zijn oftewel afkomstig uit monoklonale B cellijnen of uit PBMCs uit bloed van gezonde donoren. De monoklonale B cellijnen zitten in een kweekflacon en PBMCs zijn ingevroren; Monsters nemen van B cellijnen en het ontdooien van de PBMCs zijn als protocol opgenomen in de bijlagen, respectievelijk ‘Appendix D’ en ‘Appendix E’. Bij het ontdooien van de PBMCs is het belangrijk het nieuwe medium gradueel toe te voegen en het DMSO, dat tegen kristalvormig is bij het invriezen, niet de kans geven de cellen te beschadigen. Vervolgens valt de hoeveelheid cellen die het sample bevat te variëren en in het geval van de PBMCs is er de keuze het materiaal in verschillende degradaties te scheiden van overige soort cellen. De hoeveelheid cellen in het startmateriaal is te bepalen volgens het ‘cell count’ protocol (Appendix D) en het doel van de cel isolatie is om een x aantal (B) cellen te isoleren, waarna deze worden gelyseerd en beschikbaar zijn voor de mRNA isolatie. Het sorteren en scheiden van de B cellen kan via de CD19 MACS (Appendix E) en FACS methoden (Appendix F). Bij de soortgelijk verrichte onderzoeken is veelal gebruik gemaakt van ongezuiverde PBMCs of B cel selectie via de CD19 MACS methode; het zuiveren van het beginmateriaal door IgE positieve B cellen te isoleren met de FACS methode is niet geschikt gevonden (Appendix C). Aangezien IgE receptoren weinig aanwezig zijn op het celmembraan van IgE positieve B cellen is het binden van fluorescerende antilichaam APCIgE tags aan IgE receptoren lastig en daarom is de FACS methode in theorie niet effectief. Echter kan een intracellulaire staining FACS methode goed werken, aangezien de IgE receptoren intracellulair wel voldoende aanwezig zijn, maar vanwege het permeabel maken van de IgE
kwalitatieve meerwaarde voor het experiment, aangezien niet gekeken is naar de bijbehorende lichte ketens sequenties van de IgE positieve B cellen. Verdunningsreeksen en celmateriaal sortering Literatuur onderzoek (Appendix C) wijst uit dat veelal gebruik is gemaakt van pure PBMCs voor het verkrijgen van IgE transcripten, hierbij vermeldt dat PBMCs van allergische patiënten tot wel 10% IgE positieve B cellen van de totale B cellen kunnen bevatten en dit het verkrijgen van resultaat vergemakkelijkt ten opzichte van gezond donor materiaal met 0,1 1% IgE positieve B cellen (Gadermaier et al., 2013). Vanwege de lage concentraties IgE cellen waar het donormateriaal uit bestaat, kan het verkrijgen van werkbaar PCR product lastig worden. Hierom is met monoklonale B cellen een reeks verdunningen gemaakt, waarmee de ARTISAN PCR methode op het minimaal benodigde celmateriaal getoetst is. Ook zijn verdunningsexperimenten uitgevoerd die het oppikken van IgE transcripten testen, terwijl de IgE positieve B cellen zijn omringd met overig celmateriaal, om de samenstelling van het gezond donor materiaal na te bootsen. Door pure PBMCs en CD19 MACS geselecteerde B cellen afzonderlijk als beginmateriaal te testen, blijkt wat succesvol is. In theorie zorgt het lyseren van PBCMs wellicht voor teveel overig cel materiaal ten opzichte van de IgE positieve B cellen, wat de efficiëntie van de ARTISAN PCR kan verminderen, omdat de gen specifieke primers de mRNA IgE transcripten niet ‘vinden’ vanwege het vele overige mRNA. Echter kan te weinig overig celmateriaal of mRNA de efficiëntie ook verminderen, omdat de dynabeads of gen specifieke primers het mRNA niet binden door de lage concentraties mRNA in de oplossing. Hiertoe zullen verdunningsreeksen inzicht geven in de juiste combinatie van beginmateriaal en cel aantal. Voor de praktische uitvoering van een verdunningsreeks is een voorbeeld toegevoegd in de bijlagen (Appendix G). IgE repertoire + FACS analyse donormateriaal De intracellulaire FACS methode zal niet geschikt zijn om de cellen te sorteren, maar de FACS intracellulaire methode is wel bruikbaar om het gezonde donoren materiaal te meten op percentages B cellen en IgE positieve B cellen in het PBMC materiaal (Appendix F). Een FACS analyse is belangrijk om het aantal IgE positieve B cellen in donoren te achterhalen. Dit is nodig om met een werkbare hoeveelheid IgE positieve B cellen te beginnen binnen de grenzen van het geoptimaliseerde protocol. De fluorescente APCA:IgE antilichamen binden aan de IgE antilichamen en de fluorescente FITCA:CD19 antilichamen binden aan de CD19 receptoren, kenmerkend voor B cellen. Wanneer beide golflengten bij een cel zijn waar te nemen, is het aannemelijk dat het een IgE positieve B cel betreft. Daarbij zijn de forward en sideward scatter van de cellen
zijn de fluorescente antilichamen te binden. De resultaten van de FACS analyse zijn weergeven in tabel 1. De gehele FACS analyse is te vinden in de bijlagen (Appendix H). Tabel 1. FACS analyse van PBMCs van gezond donormateriaal. Donor %IgE van totaal aantal B cellen (strikte meting) %IgE van totaal aantal B cellen (ruime meting) Aantal IgE+ B cellen in 2,0.106 B cellen 1 0,10 0,51 2000 10230 2 0,11 0,09 1831 2200 3 0,08 0,25 1660 4981 4 0,15 0,65 3000 13020 5 0,06 0,30 1200 5940 6 0,08 1,03 1600 20541 7 0,09 0,56 1800 11282 8 0,27 0,78 5400 15575 9 0,12 0,73 2400 14671 10 0,24 0,70 4800 13984 Veel metingen met een positief signaal voor IgE en CD19 vielen bij een relatief hoge forward en sideward scatter. Wanneer een striktere grens genomen is, waarbinnen signalen gemeten zijn voor de forward en sideward scatter, dan liggen de percentages voor IgE positieve B cellen van het totaal aantal B cellen lager. De gemeten data met de FACS analyse komen overeen met de 0,1 tot 1 % IgE positieve B cellen als percentage van het totaal aantal B cellen in gezonde personen (Gadermaier et al., 2013). Eveneens vielen het percentage gemeten B cellen van de PBCMs in de 3 tot 15 % spreidingsbreedte (Appendix H). De FACS meting voor donor 1 bij een ruime grens voor de forward en sideward scatter waarbinnen gemeten is, is weergegeven in figuur 1.
Figuur 1. FACS analyse donor 1 (Appendix H). In figuur 1 is linksonder waar te nemen dat 87,6% van de metingen cellen betroffen die negatief zijn voor zowel IgE als CD19, dit betreffen de cellen die niet B cel zijn, zoals T cellen, natural killer cellen en monocyten. Linksboven bevinden zich cellen die positief testen op IgE, maar negatief op CD19 waardoor er niet sprake is van B cellen. Deze categorie betreft hoogstwaarschijnlijk mestcellen die IgE binden (Galli & Tsai, 2012). De twee rechter vlakken in figuur 1 weergeven B cellen, aangezien de cellen positief meten op de kenmerkende CD19 receptoren voor B cellen. Rechts bovenin zijn de metingen voor cellen die IgE positief en CD19 positief zijn; de IgE positieve B cellen. Dit percentage is 0,059 van de totale gemeten cellen in de PBCMs, wat laag is en een CD19 MACS B cel selectie een valide optie lijkt om dit percentage te verhogen in de samples. Om het klonale karakter van het IgE repertoire te onderzoeken is de opzet om per gezonde donor vijf aparte monsters uit hetzelfde materiaal te nemen en op deze manier te zoeken naar overeenkomstige sequenties tussen de verschillende monsters. Als dezelfde aminozuur transcripten in eenzelfde monster zijn gevonden dan zegt dit niets over de klonaliteit. Dezelfde transcripten kunnen immers van één B cel afkomstig zijn, maar simpelweg meerdere malen geamplificeerd zijn. Zodra een transcript in verschillende monsters voorkomt, is te concluderen dat tenminste twee IgE positieve B cellen hetzelfde IgE
mRNA isolatie Het doel van de mRNA isolatie is om het aanwezige mRNA uit de cellen te halen en te scheiden van het overig celmateriaal. Belangrijk is om RNAse vrij te werken, aangezien deze enzymen het mRNA afbreken, hiertoe is het materiaal vooraf met RNAse verwijderende spray behandeld. Voor de uitvoering van de mRNA isolatie is gebruik gemaakt van het pakket ‘Dynabead mRNA DIRECT Kit’ van ‘Life Technologies’. Gedurende deze mRNA procedure (Appendix I) zullen magnetische oligo (dT) beads met een reeks T nucleotiden binden aan de poly(A) staarten van de aanwezige mRNA moleculen en met een magneet van het overige celmateriaal gezuiverd worden. Hiertoe dienen de cellen eerst opengebroken te worden zodat het celmateriaal zich in de oplossing verspreidt. Allereerst zijn de magnetische oligo beads gewassen met Lysis buffer om de beads oplossing te ontdoen van zijn conserveringsvloeistof, welke niet gewenst is in de volgende stappen. De beads dienen ten alle tijden vochtig te blijven en niet droog te vallen, dit vermindert de werking van de beads. De cellen, afkomstig uit de cel isolatie in 600 µl fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) medium voor de juiste pH, zijn vervolgens opengebroken met Lysis/Binding buffer, waar zich onder andere een een zoutoplossing in bevindt die de cellen via osmose openbreekt. Via osmose gaat teveel water de cel in en breekt open. LiDS inhibeert enzymen en zorgt dat RNase de mRNA moleculen niet afbreekt. LiDS is een sterke enzym inhibitor, dus belangrijk dat deze goed weggewassen is voor de volgende stappen. Na het openbreken van de cellen kunnen zich lange slierten DNA gaan vormen in de oplossing, hierin kunnen de beads blijven hangen terwijl juist de bedoeling is dat deze zich aan de mRNA gaan hechten, daarom wordt de lysis + cel oplossing goed op en neer gespoten met een spuit. Zodra de beads + mRNA gescheiden zijn van het overige materiaal, wordt deze pellet opgelost in 15 µl elution buffer. De oplossing wordt 2 minuten op 80℃ gebracht zodat de mRNA en beads loskoppelen, te lang kan schadelijk zijn voor mRNA. Wanneer de oplossing op een magneet wordt gebracht na de 80℃ fase, zit het mRNA in de oplossing en de beads in het pellet. Zo is het mRNA geïsoleerd en aanwezig in de elution buffer. Via een nanodrop meting (Appendix J) van het verkregen product uit de mRNA isolatie is gecontroleerd of de procedure correct is verlopen en de hoeveelheid verkregen mRNA uit het celmateriaal overeenkomt met de opbrengst volgens het protocol (Appendix I). cDNA synthese Het doel van de cDNA synthese is om complementair DNA te synthetiseren tegenover enkelstrengs mRNA afkomstig uit het celmateriaal van de samples. Het gevolgde protocol is toegevoegd in de bijlagen (Appendix K). Echter zijn enkele variaties in synthese methoden en hoeveelheden onderzocht op een
slechtst de specifieke immunoglobuline genen. Via oligo(dT) primers voor de cDNA synthese kan tegenover al het mRNA uit de cel complementair DNA gesynthetiseerd worden, in dit geval bindt de reverse primer aan de poly(A) staart van de mRNA moleculen, waardoor de primer aan alle mRNA moleculen kan binden. Een totale mRNA cDNA synthese kan optimaler zijn voor de latere PCR, omdat het vele cDNA als een buffer werkt in de PCR, er is dan geen hinder van een te lage concentratie cDNA die de polymerases minder goed synthetiseren. Daarbij kan het lastig zijn de immunoglobuline mRNA transcripten te binden met genspecifieke primers te midden van veel overig mRNA materiaal en kan een oligo (dT) primer hier uitkomst in bieden (Appendix L). Deze opties en theorieën zijn getoetst en weergeven in de resultaten. Zowel de oligo(dT) als de gen specifieke reverse primers verlengen het cDNA transcript met enkele C nucleotiden, waartegenover G nucleotiden zijn geplaatst en zo de forward primer ‘SA’ in de PCR op een constante sequentie kan binden buiten het variabele deel van het immunoglobuline transcript. Op deze manier is er geen sprake van ‘primerbias’ voor alleen niet gemuteerde regio’s in het variabele deel. MgCl2 is een cofactor voor de polymerase en DTT breekt disulfide bruggen van het RNA en verhindert het vormen van secundaire structuren, daarbij initieert DTT de transcriptie. De oplossing met primers en mRNA wordt eerst op 72℃ gehouden om secundaire structuren van het mRNA tegen te gaan, daarna een snelle daling naar 4℃ waarop de primers binden en vervolgens naar 42℃ zodat het enzym Reverse transcriptase de synthese kan uitvoeren. Voor de cDNA synthese zijn de gevalideerde ‘oligo (dT)’, ‘EL primer mix’ (IgE + lichte ketens kappa/lambda)(4µM ε.rt, 2µM κ.rt en 2µM λ.rt) en de ‘5 primer mix’ (heavy: IgM,IgG,IgA + lichte ketens kappa/lambda) reverse primers gebruikt. Het verkregen product vanuit de cDNA synthese bestaat uit één streng mRNA met één streng complementair DNA met een verlengd stuk nucleotiden buiten het variabele deel. Dit product is verder geamplificeerd in de PCR. PCR Het doel van het PCR onderdeel is het verkregen immunoglobuline transcript uit de cDNA synthese te amplificeren, waarmee het aantal gen transcripten sterk toeneemt en het product bruikbaar is voor analyse en verdere sequencing. Het gevolgde PCR protocol is toegevoegd in de bijlagen (Appendix K), wijzigingen en aanvullingen op het protocol zijn in dit onderdeel opgenomen. Allereerst is de streng cDNA van de streng mRNA gescheiden door dit molecuul te denatureren, waarop de forward SA (pcr) primer aan het enkelstrengs DNA bindt en er vervolgens een dubbelstrengs DNA transcript wordt gesynthetiseerd. Verdere amplificatie
Alvorens de PCR rondes beginnen is de oplossing gedurende 2 minuten verwarmt op 98℃ om het materiaal uit de cDNA synthese goed te degraderen. De cycli zelf bestaan in dit onderzoek uit een fase van 98℃ voor 1 seconde, waarbij de dubbelstrengs DNA moleculen denatureren. Daaropvolgend een ‘annealing’ fase van 69℃ voor 15 seconde, waarin de primers binden aan de enkelstrengs transcripten. Van deze temperatuur is in sommige PCR afgeweken, aangezien de ‘annealing’ temperatuur voor verschillende primers kan verschillen. Tot slot eindigt een cyclus met een periode van 72℃ voor 15 seconde. Het meerdere malen doorlopen van deze cyclus verhoogt het aantal verkregen PCR product van het gewenste gen transcript. Echter betekent een hoger aantal PCR cycli ook een hoge kans op mutaties die door de PCR worden geïmplementeerd in de gen transcripten. Een optimum vinden in het juiste aantal cycli om enerzijds genoeg product te krijgen en anderzijds het product niet veel te muteren is een deel van het onderzoek. Mocht blijken dat alleen met een hoog aantal cycli genoeg PCR product is te verkrijgen dan kunnen de geïmplementeerde mutaties tijdens de PCR eventueel onderscheiden worden van oorspronkelijke mutaties. Deze data analyse kan door een groot aantal sequenties te vergelijken en unieke puntmutaties, die niet nog een keer voorkomen in een andere sequentie, te bestempelen als mutaties door de methodiek. Nested PCR Een methode binnen de PCR om de amplificatie te optimaliseren is het uitvoeren van (semi)nested PCR. Bij deze methode is PCR niet in één ronde met vele cycli uitgevoerd, maar in meerdere rondes van relatief minder cycli en per nieuwe ronde zijn andere primers gebruikt. In het geval van nestedPCR zijn zowel de forward als reverse primers anders ten opzichte van de forward en reverse primers van de vorige ronden, is slechts één van de forward of reverse primer anders dan heet het seminested PCR. Voor het uitvoeren van (semi)nested PCR zijn nested primers benodigd, die binnen de sequentie van het amplicon hechten die de voorgaande primers hebben geamplificeerd. Het gebruik van nested reverse primers verkort het gen transcript aan deze kant per nested PCR. Op deze manier gaat steeds een stuk van het constante deel van de sequentie verloren. De sequentie voor het variabele deel blijft intact, want de forward SA primer blijft gelijk gedurende de seminested PCR. Voor dit onderzoek zijn nested reverse primers ontworpen en gevalideerd (Appendix M) en de ligging van de nested primers op het constante deel van het IgE transcript zijn weergeven in figuur 2. Bij het ontwerpen van de primer sequenties is rekening gehouden met primer zelfbinders en goede bindingseigenschappen voor de reverse primers. Zo ligt een ideale primer lengte tussen de 18 22 basenparen, dit is specifiek genoeg om ‘offtarget’ binding te voorkomen en niet te lang om binding te bemoeilijken. Verder dient de annealing temperatuur niet te hoog te liggen, wat de opbrengst verlaagd, en ook niet laag, wat tot veel mismatch offtarget amplificatie leidt. Ook kan een ‘GC clamp’ aan het 3’ uiteinde van de reverse primer de werking van de primers verhogen, in het ontwerp zijn hier dan meerdere G
de IgE sequentie te ontwerpen is verkent, maar het ontwerp bleek niet valide voor een IgE positieve B cellijn (Appendix M). Hoogstwaarschijnlijk vormde secundaire structuren. Figuur 2. Reverse primers voor het IgE amplicon. Rechts meest buitenste primers, links de binnenste. Het uitvoeren van een seminested PCR heeft enkele voordelen ten opzichte van een ‘singlerun’ PCR. Zo raakt een PCR naar teveel cycli verzadigd en neemt het hoeveelheid nieuw product per cycli niet meer toe, daarom kan het doorlopen van meerdere korte PCR ronden met een kleine hoeveelheid product meegenomen uit de vorige PCR de efficiëntie verbeteren. Teveel PCR product doornemen naar volgende ronde kan remmend werken omdat bij het inbouwen van dNTP’s de afgesplitste fosfaatgroepen inhiberend werken op het polymerase. Door het gebruik van nested primers die binnen de sequentie van de voorgaande primers liggen wordt verdere offtarget amplificatie uit vorige PCR ronden voorkomen. Touchdown PCR Een andere methode die bij kan dragen aan de optimalisatie van het amplificeren van IgE sequenties uit IgE positieve B cellen is de touchdown PCR methode (Don et al., 1991). Tijdens touchdown PCR begint de reactie eerst een paar graden boven de annealing temperatuur zodat er slechts weinig maar wel heel specifiek product wordt geamplificeerd. Vervolgens daalt de temperatuur gradueel tot onder de annealing temperatuur zodat de primers steeds makkelijker binden. Aangezien er in het begin al een voorsprong is gemaakt met het amplificeren van zeer specifiek product zullen de primers gedurende de temperatuur verlaging eerder aan het specifieke gen binden, dan aan offtarget stukken. Op deze manier is de hoeveelheid offtarget product verminderd, maar kan door de lage temperatuur meer primer binding optreden. Gel electroforese Het doel van de agarose gelelectroforse (Appendix N) is om het PCR product te analyseren op de aanwezigheid van product van de juiste grootte. Hierbij is gebruik gemaakt van 100 ml (1%) agarose gels, gemaakt door 1 mg agarose(EUROGENTEC) op te lossen in 100 ml TBE Buffer en om het DNA te kleuren is ethidiumbromide toegevoegd, zodra de oplossing is
de gel electroforese ongeveer 40 minuten op 140 mV uit te voeren is de gel onder UVlicht belicht, waardoor het ethidiumbromide dat aan het DNA gebonden is waarneembaar is. Met behulp van geladen SF en LF ladders zijn de lengten van het product te bepalen. Indien het PCR product gewenst is mee verder te werken, is het waarneembare bandje uit te snijden om vervolgens in een nieuwe seminested PCR ronde te gebruiken. Deze zogeheten ‘cleanup’ stap is uitgevoerd met ‘WIZARD SV Gel and PCR CleanUp System’ van PROMEGA. PacBio/Sanger sequencing Het uiteindelijke PCR product is geligeerd in een vector, getransformeerd in een E.coli stam en vervolgens gekloneerd (Appendix O) voor Sanger sequencing, wat de sequenties van de producten oplevert. Met Sanger sequencing worden radioactieve of fluorescente nucleotiden ingebouwd en zo kan de sequentie bepaald worden. Met PacBio is het ‘single molecule real time sequencing’ en zit er per pore een polymerase, dat tijdens het inbouwen van een nucleotide een lichtpuls uitzendt, dus tijdens het synthetiseren wordt al gemeten. Voor PacBio zijn de losse PCR producten voldoende om aan te leveren en dienen niet eerst in een vector plasmide geligeerd te worden.
Resultaten
In de resultaten zijn de belangrijkste tussenresultaten richting een geoptimaliseerd en succesvol protocol voor het amplificeren van IgE sequenties uit gezonde donoren weergegeven. Tot slot is een gedeelte gewijd aan het IgE repertoire voor gezonde donoren.Geoptimaliseerd protocol Verdunningsreeksen Een limiterende factor voor de ARTISAN PCR methode is de capaciteit die het heeft voor lage cel aantallen. Wanneer er te weinig cellen aanwezig zijn in de samples, dan kan geen werkbaar product verkregen worden om te sequencen. Daarom zijn verdunningsreeks experimenten uitgevoerd om de methode geschikt te maken voor lage cel aantallen en cel concentraties, omdat het uiteindelijke doel is om transcripten van lage concentraties IgE positieve B cellen te amplificeren. Allereerst is een verdunningsreeks gemaakt (Appendix G) met de monoklonale B cellijn TMD8 om de ARTISAN PCR methode te testen op het bereik dat de methode heeft voor het aantal cellen. Te verwachten is dat bij te lage cel aantallen geen waarneembaar product is op de agarose gel, maar ook teveel celmateriaal kan de capaciteit van de methode overschrijden en het proces niet efficiënt doen verlopen. De resultaten zijn weergeven in figuur 3. Voor elk afzonderlijk sample van 106 tot N is mRNA isolatie en cDNA synthese uitgevoerd. 5 μl cDNA voor de PCR (40 cycli, 69℃ annealing) met 1 μl SA(pcr) en 1 μl reverse IgM primer (beide 10 μM). Figuur 3. ARTISAN PCR met verdunningsreeks van de TMD8 cellijn.
Uit figuur 3 blijkt dat de amplificatie met 1,0.105 en 1,0.104 B cellen in het beginmateriaal het effectiefst is verlopen, dit levert de sterkste banden met het meest product op. Bij 1,0.103 cellen is slechtst een heel vaag bandje waarneembaar en vanaf 1,0.102 niet meer, waaruit valt op te maken dat dit te weinig cellen zijn om IgM transcripten mee te amplificeren met de
aanwezig zijn in samples met overige B cellen. Dit experiment is weergegeven in figuur 4. De IgE positieve B cellen zijn steeds met een factor 10 verdund, maar de basis in elk sample zijn 1,0.106 B cellen die met CD19 MACS zijn geselecteerd. De basis van 1,0.106 B cellen bevatten van zichzelf dus 1000 tot 10.000 (0,1% 1%) IgE positieve B cellen en daar bovenop zijn IgE positieve B cellen toegevoegd vanuit een IgE positieve cellijn. Er is gekozen voor twee ronden PCR van elk 30 cycli, waarbij voor de eerste ronde PCR 16 μl cDNA is gebruikt per sample met reverse primer ‘Nested 3’(Appendix M). Deze hoeveelheid blijkt optimaal om ook bij weinig cellen genoeg cDNA van de IgE transcripten in de PCR te kunnen amplificeren (Appendix P). Verder is voor de cDNA synthese de gen specifieke reverse primer mix ‘EL’ gebruikt die de IgE transcripten en lichte ketens bindt. Voor de tweede ronde PCR is 5 μl van het eerste ronde PCR product doorgeladen en is de reverse primer ‘e.pcr’ gebruikt (Appendix M). Er is gekozen voor het gebruik van de ‘e.pcr’ primer voor de tweede ronde PCR in plaats van de ‘N2’ nested primer, die ongeveer op dezelfde hoogte als ‘e.pcr’ bindt (figuur 2). Deze voorkeur komt door de sterkere werking van ‘e.pcr’ ten opzichte van de ‘N2’ primer (Appendix M). 2x30 cycli PCR met eerste reverse primer ‘Nested3’(N3) primer en tweede reverse nested primer ‘e.pcr’. Sample 106 bestaat uit 1,0.106 IgE+ B cellen en 1,0.106 B cellen; Sample 105 bestaat uit
1,0.105 IgE+ B cellen en 1,0.106 B cellen, etc. Figuur 4. Twee ronden PCR voor verdunningsreeks van IgE+ B cellen. In figuur 4 is waar te nemen dat het signaal vanaf 1,0.102 toegevoegde IgE positieve B cellen sterk verzwakt. In dit sample zitten 1,0.106 B cellen, naar schatting dus 100010.000 IgE positieve B cellen, maar de methode van 2x30 cycli is niet geschikt om deze hoeveelheden naar behoren te amplificeren te midden van overige B cellen. Voor verdere optimalisatie voor een succesvolle methode om IgE transcripten te ampliceren is verder gekeken naar andere technieken, zoals oligo(dT) primers voor cDNA synthese en een derde ronde seminested PCR. Drie ronden PCR In voorgaande experimenten is twee ronden PCR niet voldoende gebleken, daarom is een experiment opgezet met drie ronden seminested PCR. Hiertoe zijn als startmateriaal de PBMCs gebruikt van donor nummer 1 (Appendix H). Deze PBMCs zijn voor B cellen geselecteerd via CD19 MACS en onderverdeeld in 2 aliquots van 2,5.106 B cellen en 1 aliquot van 0,5.106 B cellen. Na de cDNA synthese zijn de eerste twee aliquots
gebruikt. Voor sample 3 is 16 μl* cDNA uit het aliquot van 0,5.106 B cellen gebruikt. Vervolgens is de 1ste PCR ronde uitgevoerd met 20 cycli en reverse primer N3 (Appendix M). Hiervan is 5 μl product van elke 1ste PCR doorgeladen naar de 2de PCR die eveneens 20 cycli doorloopt met nested reverse primer ‘e.pcr’. Hierna is 20 μl van elke 2de PCR product geladen op een agarose gel en uitgesneden via de ‘cleanup’ methode. Vervolgens is al het opgezuiverd product in 25 μl water opgelost en geladen voor de 3de PCR voor 30 cycli en reverse primer ‘e.pcr’ met een annealingsfase 65℃. Na de 3de PCR is van elke sample 40 μl geladen op een agarose gel, waarvan de resultaten zijn weergeven in figuur 5. Figuur 5. Drie ronden PCR donor 1. 20 cycli (N3) + 20 cycli (e.pcr) + 30 cycli (e.pcr). Te zien in figuur 5 is dat de laan van 32 μl en 16 μl cDNA banden aanwezig zijn rond de 600 basenparen, wat kenmerkend is voor IgE. In de laan van 16 μl* is een sterke band waarneembaar op de verkeerde lengte. De producten zijn opgestuurd voor Sanger sequencing en daaruit bleken 4 IgE transcripten van de 12 producten aanwezig te zijn bij het product van 32 μl cDNA. 1 IgE transcript van de 12 producten aanwezig bij het product van 16 μl cDNA en geen IgE transcripten bij de laan van 16 μl*. Het is dus gelukt IgE transcripten te amplificeren vanuit de PBMCs van een gezonde donor, echter is het totaal aantal cycli 70 en dat is hoog. In verdere experimenten is geprobeerd dit aantal cycli te verlagen. Oligo(dT) vs. Gen specifieke cDNA primers. In dit onderdeel is het gebruik van de gen specifieke EL reverse primer mix bij de cDNA synthese vergeleken met de oligo(dT) primer voor de cDNA synthese. Het idee is dat de oligo(dT) primer wellicht een stuk efficiënter bindt aan de poly(A) staarten van het mRNA dan de gen specifieke IgE reverse primers in staat zijn aan het IgE mRNA transcript te
oligo (dT) primers al het cDNA complementair maken in de cDNA synthese, zijn kleinere hoeveelheden mRNA wellicht beter voor de verdere PCR ronden.
Tabel 2. Hoeveelheden mRNA uit 2,0.106 B cellen(CD19 MACS) voor de cDNA synthese.
1 (gen specifiek) 2 (oligo) 3a 3b 3c 3d N1 N2 mRNA 15 15 0,5 1,0 2,0 8,0 15*(Ne gatief) 0 H2O 0 0 14,5 14,0 13,0 7,0 0 15 Na het uitvoeren van de cDNA synthese volgens het schema in tabel 2 is het cDNA per sample verder genomen voor de 1ste rond PCR. Bij de 1ste ronde PCR is voor elk sample 16 μl cDNA meegenomen en 20 cycli mee doorlopen met reverse primer ‘Nested 3’. Van het product uit de 1ste ronde is 5 μl meegenomen naar de 2de ronde PCR voor eveneens 20 cycli met nested reverse primer ‘e.pcr’. Van het product uit de 2de rond is 5 μl van elk sample doorgeladen naar de 3de ronde PCR voor de laatste 10 cycli met de ‘e.bc’ primers als reverse primers en de ‘SA.bc’ barcoding forward primers met een annealingsfase van 65 ℃ (Appendix M). Het resultaat van dit experiment is weergeven in figuur 6. Figuur 6. Drie ronden seminested PCR met genspecifiek en oligo(dT) priming. Uit figuur 6 blijkt dat in het sample waar gen specifieke reverse primers zijn gebruikt in laan 2 de cDNA synthese een band waarneembaar is rond de 600 basenparen. De vijf daaropvolgende lanen zijn de verschillende hoeveelheden mRNA (tabel 2) die met oligo(dT) primers zijn gebruikt. In de samples met oligo(dT) primers zijn geen producten aanwezig met de juiste lengte, wat resulteert in de conclusie dat de PCR niet succesvol verloopt wanneer al het mRNA is gesynthetiseerd tot cDNA. Hier opvolgend is verder gewerkt met de gen specifieke reverse primer voor de cDNA synthese.
lengte voor IgE te verkrijgen. Er is verder een experiment uitgevoerd met de touchdown PCR methode (Appendix Q), maar deze resultaten zijn minder goed dan de resultaten met de nestedPCR methode. Daarom is begonnen met het verwerken van gezond donormateriaal met de methode van drie ronden seminested PCR. Echter is de gehanteerde methode succesvol in figuur 6 niet altijd een gegarandeerd succes, omdat er sprake is van lage cel concentraties is de methode onbetrouwbaar. In dat geval is het opnieuw uitvoeren van de 2de ronde PCR met 1 μl 1ste ronde product, het 2de ronde product vervolgens op een agarose gel te laden en een ‘cleanup’ stap uit te voeren voor de 3de ronde vaak voldoende om een werkbaar resultaat te verkrijgen. Het resultaat voor het amplificeren van IgE transcripten met 5 parallelle aliquots van 2,0.106 B cellen uit donor 1 is weergeven in figuur 7. Figuur 7. Drie ronden PCR donor 1: 20 (N3)+20 (e.pcr)+10 cycli(e.bc). In figuur 7 zijn vier duidelijke banden te zien rond 600 basenparen, aliquot 5 is gefaald door een experimentele fout, maar is later opnieuw uitgevoerd. Het resultaat in figuur 7 is verkregen door 5 x 2,0.106 B cellen te isoleren via CD19 MACS en hier de standaard mRNA isolatie en gen specifieke cDNA synthese voor IgE voor te gebruiken. Hierop is 16 μl cDNA per aliquot gebruikt voor de 1ste ronde PCR van 20 cycli met reverse primer ‘Nested 3’. Daarna is 1 μl van het 1ste ronde product doorgenomen naar de 2de ronde PCR van 20 cycli met reverse nested primer ‘e.pcr’. Van het 2de ronde PCR product is 20 μl geladen op een agarose gel en rond 600 basenparen uitgesneden via de ‘cleanup’ stap is het product opgelost in 25 μl water. Het gehele gezuiverde 2de ronde product is vervolgens gebruikt in de derde ronde PCR voor 10 cycli met de barcoding reverse primers op een annealing temperatuur van 65℃. Alle resultaten van experimenten samengevoegd hebben geresulteerd in het optimale protocol ter amplificatie van IgE transcripten uit lage concentraties IgE positieve B cellen in tabel 3.
Tabel 3. Geoptimaliseerd protocol IgE amplificatie gezond donormateriaal. Stap Beschrijving Sample bereiding Ontdooi Ficollgescheiden mononucleaire cellen uit perifeer bloed (PBMCs) van gezonde donoren(Appendix H) en verrijk de oplossing vervolgens voor B cellen via CD19 MACS (Miltenyi) volgens ‘Appendix E’. Los 10.106 B cellen op in 3000 µl Phosphate buffered saline (PBS) en maak 5 parallelle aliquots van 2,0.106 B cellen per 600 µl PBS. Neem ook een negatief van 600 µl pure PBS mee naar de mRNA isolatie. mRNA isolatie Lyseert de B cellen en isoleer het mRNA uit de B cellen volgens ‘Appendix I’. De producten zijn 15 µl 10mM TrisHCL Buffer per aliquot met daarin opgelost de mRNA moleculen vanuit 2,0.106 B cellen. cDNA synthese Voeg het geïsoleerde mRNA per aliquot toe aan 1,5 µl SA.rt 8µM forward primer en 1,5 µl EL primer mix (4µM ε.rt, 2µM κ.rt en 2µM λ.rt) en volg ‘Appendix K’ voor de cDNA synthese. 1ste ronde PCR Voer de eerste ronde PCR uit volgens ‘Appendix K’ en stel de PCR per aliquot samen uit: 25,0 µl 2X Phusion Phlash Mastermix, 16,0 µl cDNA, 1,0 µl SA.pcr 10µM, 1,0 µl Nested 3 (N3) 10µM (Appendix M), 7,0 µl ddH2O. Programmeer het 20 cycli PCR programma als volgt: 98℃ 120s, 20x(98℃ 1s, 69℃ 15s, 72℃ 15s), 72℃ 60s, infinite 4℃. 2de ronde PCR Voer de tweede ronde PCR uit volgens ‘Appendix K’ en stel de PCR per aliquot samen uit: 25,0 µl 2X Phusion Phlash Mastermix, 5,0 µl 1ste ronde product, 1,0 µl SA.pcr 10µM, 1,0 µl ‘e.pcr’ 10µM (Appendix M), 18,0 µl ddH2O. Programmeer het 20 cycli PCR programma als volgt: 98℃ 120s, 20x(98℃ 1s, 69℃ 15s, 72℃ 15s), 72℃ 60s, infinite 4℃. 3de ronde PCR Voer derde ronde PCR uit volgens ‘Appendix K’ en stel de PCR per aliquot samen uit: 25,0 µl 2X Phusion Phlash Mastermix, 5,0 µl 2de ronde product, 1,0 µl SA.barcoding 10µM, 1,0 µl ‘e.barcoding’ 10µM (Appendix M), 18,0 µl ddH2O. Gebruik hiervoor een aparte SA forward barcoding primer per donor. Dus SA1 voor donor 1 en SA2 voor donor 2, etc. Gebruik vervolgens per aliquot een aparte e.bc reverse primer, bijvoorbeeld e.bc1 voor aliquot 1 en e.bc3 voor aliquot 2. Op deze manier zijn de sequenties achteraf in te delen.
10x(98℃ 1s, 65℃ 15s, 72℃ 15s), 72℃ 60s, infinite 4℃. Analyse Controleer of een werkbare hoeveelheid product is geamplificeerd volgens ‘Appendix N’. Laadt hiertoe op de agarose gel 20 µl 3de ronde PCR product met 4 µl loading buffer 10% glycerol phenol blue. (Optioneel: ‘cleanup’ stap) Indien bij de analyse stap blijkt dat er geen product verkregen is rond 600 basenparen, dan is een pakket WIZARD SV Gel and PCR CleanUp System’ van PROMEGA behulpzaam om wel resultaat te verkrijgen. Voer de 2de ronde PCR opnieuw uit met 1,0 µl 1ste ronde product en 22,0 µl ddH2O. Laadt 20µl van het 2de rond PCR product op een agarose gel, snijdt de banden rond 600 basenparen uit en voer de ‘CleanUp’ uit. Het product is gezuiverd PCR materiaal in 25 µl water. Voer een 3de ronde PCR uit met 25,0 µl 2X Phusion Phlash Mastermix, 25,0 µl 2de ronde product (cleanup), 1,0 µl SA.barcoding 10µM, 1,0 µl ‘e.barcoding’ 10µM (Appendix M). Sequencing Het overige 3de ronde PCR product, wat niet op de gel geladen is ter analyse, kan tot slot geprepareerd worden voor evenwel Sanger sequencing of PacBio. IgE repertoire van gezonde donoren Het geoptimaliseerde protocol om IgE transcripten te amplificeren uit gezond donormateriaal is uitgevoerd het donormateriaal van de 10 gezonde donoren (Appendix H). Van de eerste 3 donoren zijn reeds IgE sequenties verkregen van in totaal 28 IgE sequenties verdeeld over de eerste 3 donoren (Appendix R). In deze sequenties is in ieder geval sprake van één kloon, want er is een identieke sequentie die voorkomt in verschillende aliquots van eenzelfde donor. Deze sequentie is dus afkomstig van tenminste twee individuele cellen. Verder is in de V domeinen een gemiddelde mutatieratio van 8,2% gevonden met een bereik tussen de 2,5 en 15,5 %. Dit is een hoge mutatieratio en duidt op meerdere passages van de IgE positieve B cellen door het ‘germinal’ center.
Discussie
In de eerste verkregen sequenties is sprake van één kloon, want eenzelfde sequentie is gevonden in twee verschillende aliquots. Dit is te weinig om conclusies te trekken over het klonale karakter van het gezonde IgE repertoire, maar wel is de verwachting meer kloons te vinden aangezien de data slechts 28 transcripten omvatten van de minimaal 5000 IgE transcripten die uiteindelijk beoogd zijn. Ook kan de hoge mutatieratio wijzen dat de IgE positieve B cellen meerdere malen door het ‘germinal’ center zijn geweest, wat duidt op een tweestaps klasse verandering van IgM via IgG naar IgE. De ontwikkelde methode om specifieke genen uit lage concentraties cellen te amplificeren kan, naast gebruik om het IgE repertoire in kaart te brengen, ook dienen voor ander onderzoek met lage cel aantallen. Het protocol is succesvol gebleken bij het amplificeren van IgG4 sequenties uit IgG4 positieve Bcellen, welke eveneens in lage percentages aanwezig zijn in Bcellen. Voor verdere optimalisatie van de methode kan de optie verkend worden om bijvoorbeeld IgM en IgG positieve B cellen via de FACS methode uit de oplossing met B cellen te zuiveren. Zo wordt de oplossing met B cellen verrijkt voor IgE positieve B cellen die, door het verwijderen van overige B cellen, op deze manier in hogere concentraties in het sample aanwezig zijn. Al met al kan geconcludeerd worden dat het experiment geslaagd is een methode op te zetten om IgE transcripten te amplificeren uit gezond donor materiaal. Er is al een kleine start gemaakt voor het in kaart brengen van het IgE repertoire van gezonde donoren, maar verdere amplificatie en sequencing is nodig om 5000 IgE transcripten verdeeld over 10 donoren te bereieken.Dankwoord
Voor dit onderzoek dient in het speciaal Marvyn Koning bedankt te worden als begeleider voor dit stageonderzoek. Verder vallen in het bijzonder te bedanken Kees van Berngen en Valeri Nteleah voor hun hulp bij de FACS analyse. Tot slot is de hulp en feedback in de werkbesprekingen door Dr. M. Griffioen en Prof. Dr. J.H. Veelken te prijzen, die heeft geleid tot het succesvol afronden van dit bachelor onderzoeksproject.Literatuur
Parham, P. (2009). The immune system (3rd ed., pp. 95121, 159184). London: Garland Science. Gadermaier, E., Levin, M., Flicker, S., & Ohlin, M. (2013). The Human IgE Repertoire. Int Arch Allergy Immunol International Archives of Allergy and Immunology, 7791. Galli, S., & Tsai, M. (2012). IgE and mast cells in allergic disease. Nature Medicine Nat Med, 693704. Don, R., Cox, P., Wainwright, B., Baker, K., & Mattick, J. (1991). ‘Touchdown’ PCR to circumvent spurious priming during gene amplification. Nucl Acids Res Nucleic Acids Research, 40084008.
Bijlagen
Inhoudsopgave bijlagen
Appendix A: ‘Supplementary table for the human IgE repertoire’. 27 Appendix B: Protocol voor de ARTISAN PCR methode. 29 Appendix C: Materiaal en methoden soortgelijk IgE onderzoek. 43 Appendix D: Cell count protocol 47 Appendix E: Ontdooien cellen + CD19 MACS B cel selectie 48 Appendix F: Intracellulaire en extracellulaire ‘FACS staining’ 49 Appendix G: Voorbeeld protocol voor het maken van een verdunningsreeks. 50 Appendix H: FACS data en analyse verwerking. 51 Appendix I: Gehanteerd mRNA protocol + protocol fabrikant. 69 Appendix J: Nanodrop meting 83 Appendix K: cDNA synthese protocol + nestedPCR protocol 84 Appendix L: Variaties voor de cDNA synthese. 88 Appendix M: Ontworpen IgE primers en validatie. 89 Appendix N: Agarose gel maken en gebruiken. 90 Appendix O: Ligeren, transformeren en kloneren van PCR product. 93 Appendix P: Verschillende hoeveelheden cDNA voor eerste ronde PCR. 101 Appendix Q: Touchdown PCR resultaten 102 Appendix R: Data van IgE sequenties gezonde donoren. 103
Appendix C: Materiaal en methoden soortgelijk IgE onderzoek. Uit soortgelijk IgE repertoire onderzoek blijkt voor de cel isolatie is de Ficoll–Hypaque density gradient centrifugation gebruikelijk. Bij de mRNA isolatie is meermaals gebruik gemaakt van de method van Chomczynski and Sacchi (1), waar met guanidine en isothiocyanate wordt gewerkt en CsCl gradient centrifugation gebruikt wordt. Bij één onderzoek 2 x108 cellen PBMC’s mRNA isolatie uit opgewerkt met Chomczynski and Sacchi methode(2)(3). Qua purificatie van de PBMC’s waarmee is gewerkt, zijn deze op één na niet verder gezuiverd, maar is de mRNA isolatie begonnen met de gehele PBMC. De meest gebruikte PBMC’s zijn van patiënten dus is te verwachten dat IgE positieve Bcellen in hogere concentraties aanwezig is, waardoor purificatie van het sample niet nodig is. Een seminested, second round PCR komt in meerdere onderzoeken terug. Hierbij ligt de annealing temperatuur van de primers tussen de 5070 graden.
Appendix D: ‘Cell count’ protocol. Het doel van de cel isolatie is om een x aantal (B) cellen uit de celkweek te isoleren, waarna deze worden gelyseerd en beschikbaar zijn voor de mRNA isolatie. Het is nodig te weten hoeveel cellen grofweg geïsoleerd zijn aangezien hierop het aantal benodigde beads in de mRNA isolatie gebaseerd is. Om een schatting te maken van het aantal gezonde cellen per mL kweekvloeistof wordt een monster genomen uit de kweekvloeistof en bewerkt met eosine, welke de dode cellen paars kleurt en de levende cellen wit vertoont onder de microscoop. De eosine en het monster zijn op en neer gepipetteerd om cel klontering tegen te gaan en zo een representatieve telling uit te voeren. Op het kijkglaasje onder de microscoop bevinden zich 144 rasters en hiervan worden er 25 geteld. Het volume van 25 rasters komt overeen met 25*0.04 mm2*0.1 mm = 0.1μL. Er is een verdunning van 2x van de kweekvloeistof omdat het monster uit de kweek is aangevuld met 1op1 eosine. Het aantal gezonde cellen in 1 mL kweekvloeistof komt daarom overeen met: Aantal gezonde cellen in 1 mL kweek = 2 x 10.000 x aantal gezonde cellen in 25 rasters(0.1uL) Met deze formule kan het aantal benodigde milliliters aan kweekvloeistof worden berekend om een x aantal cellen te isoleren in de centrifuge. Na het benodigde aantal milliliters uit de celkweek in een 15 mL Falcon Tube te hebben overgebracht gaat deze 10 minuten in de centrifuge op programma 11. Dit programma loopt op 4 graden waardoor het metabolisme vertraagt, dit is echter geen probleem voor de hoeveelheid mRNA in de cellen omdat de afbraak van mRNA hierdoor ook vertraagd. Na de centrifuge wordt het cel pellet verder gebruikt voor de mRNAisolatie uit de cellen.
Appendix E: Ontdooien cellen + CD19 MACS B cel selectie. 1. Zet klaar: 5 ml Wash buffer: Biowhittaker Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium(IMDM) Lonza, met 2%Fetal Bovine Serum(FBS) en Pen Strep antibioticamix. 5 ml Thaw buffer: 3,75 ml Wash buffer + 1,25 ml Fetal Bovine Serum(FBS)(GIBCO by Life Technologies) circa 25 ml CD19 MACS Running buffer. 2. Ontdooi de ampul met Ficollgescheiden mononucleaire cellen uit perifeer bloed, PBMCs, tot kleurverandering optreedt en de inhoud niet meer vastgevroren is. 3. Maak de ampul schoon met alcohol voordat deze in de zuurkast geplaatst wordt. 4. Zuig de inhoud van de ampul op en zuig daarbij 1 ml Thaw buffer op. 5. Voeg dit in een lege 15 ml flacon en meng. 6. Voeg druppelsgewijs/gradueel de rest van de 5 ml Thaw buffer toe. 7. Voeg druppelsgewijs/gradueel de Wash buffer toe, maar wacht met het toevoegen van de laatst 1 ml. 8. Breng de oplossing op een 40µM singlecell filter (MILTENYI) en voeg de laatste 1 ml Wash buffer toe om het filter te spoelen. 9. 10 minuten centrifugeren op koud programma 11. 10. Spoel de MACS filter (MILTENYI) 2 keer met 1,5 ml MACS running buffer, nadat de MACS filter op de magneet is geplaatst. 11. Na de 10 minuten centrifugeren: Zuig het supernatant af, de cellen zitten in de pellet. 12. Resuspendeer de pellet in 80 μl running buffer per 107 cellen. 13. Voeg 20 μl CD19 HUMAN microbeads (MILTENYI) toe per 107 cellen. 14. Mix de oplossing en incubeer in de koelkast (4 graden) gedurende 15 minuten. 15. Na 15 minuten: Voeg 1 ml CD19 MACS Running buffer toe per 107 cellen. 16. Centrifugeer 10 minuten. 17. Na 10 minuten: verwijder het supernatant en resuspendeer in 500μl MACS Running buffer. 18. Voeg de oplossing op de magnetische MACS filter en vang de doorstroom op in een waste tube. 19. Was de MACS kolom met 2 keer 2,5 ml MACS Running buffer. 20. Verwijder de MACS kolom van de magneet en plaats op een collectie tube. 21. Voeg 5 ml MACS Running buffer toe en duw krachtig met een spuit, zodat de B cellen uit de kolom spoelen. 22. Neem 50 μl van de doorstroom met B cellen en meng met 50μl eosine. 23. Tel het aantal cellen op 25 rasters onder de microscoop.
Appendix F: Intracellulaire en extracellulaire FACS staining.
Appendix G: Voorbeeld protocol voor het maken van een verdunningsreeks.
Appendix H: FACS data en analyse verwerking. Hierboven is de analyse van de 10 verschillende gezonde donoren weergegeven. De HEMIS Code is gerangschikt van respectievelijk donor 1 t/m 10. De tabel ‘Cells/vial’ weergeeft het aantal cellen dat in een 1 ml ingevroren ‘vial’ theoretisch aanwezig is, de tabel ‘Counted cells/vial’ is het daadwerkelijk gemeten aantal cellen per ‘vial’. De tabellen ‘% Bcells in PBCMs’ en ‘% IgE in B cells’ zijn berekend aan de hand van onderstaande FACS gegevens. Waar het aantal CD19 positieve cellen (eg. B cellen) en het aantal IgE positieve en CD19 positieve cellen (eg. IgE+ B cellen) zijn gemeten in aantallen, waardoor het percentage is te berekenen. De bovenste tabel voor donoren weergeeft de meting bij nauwer omlijnde grenzen voor de Forward en Sideward scatter grafiek en de onderste tabel weergeeft de waarden bij de ruimere grenzen voor de Forward en Sideward scatter. Als eerste zijn de FACS grafieken weergeven voor het nauwere gebied waarbinnen gemeten is voor de forward en sideward scatter:
Hieronder volgen de grafieken en data die bij de ruimere omlijnen voor de Forward en sideward scatter horen:
