Mededelingenblad van de Koninklijke Nederlandse Plantenziektekundige Vereniging
Gewasbescherming jaargang 34, nummer 5, september 2003 Pagina 165
Inleiding
Organismen worden in de natuur voortdurend blootgesteld aan toxi-sche verbindingen. Men is bij deze bewering al snel geneigd te den-ken aan bestrijdingsmiddelen, zware metalen en andere contami-nanten die door de mens bewust of onbewust in de natuur worden gebracht. Echter, levende organis-men kunnen zelf ook notoire pro-ducenten van giftige stoffen zijn. Zulke natuurlijk toxische verbin-dingen worden door veel prokayo-ten en eukaryoprokayo-ten geproduceerd. In veel ecosystemen vindt een soort van chemische oorlogsvoe-ring plaats. Producenten van na-tuurlijk toxische verbindingen proberen te overleven door in hun ecologische niche zoveel mogelijk concurrerende organismen te we-ren. Deze pogingen zijn niet altijd succesvol omdat organismen tij-dens co-evolutie afweermechanis-men hebben ontwikkeld waardoor zij ongevoelig zijn geworden voor toxische verbindingen. Weer (pro-ductie van giffen) en afweer (resis-tentieontwikkeling tegen giffen) vormen dus een belangrijke com-ponent van natuurlijke evenwich-ten.
Deze stelling geldt ook voor schimmels. Schimmels zijn beken-de producenten van natuurlijk toxische stoffen als antibiotica, mycotoxinen, en toxinen die
ne-crose van waardplanten induce-ren. Schimmels staan echter zelf ook bloot aan natuurlijk toxische verbindingen die door andere or-ganismen worden geproduceerd. Denk daarbij aan antibiotica die door concurrerende micro-orga-nismen worden uitgescheiden en aan fungitoxische verbindingen die door planten vòòr (phytoanti-cipinen) en na infectie (fytoalexi-nen) worden gevormd. Door co-evolutie hebben
plantenpathogene schimmels zich kennelijk met succes gewapend te-gen fungitoxische verbindinte-gen van hun waardplanten. Bekende mechanismen die hierbij een rol kunnen spelen zijn 1) afwezigheid van de aangrijpingsplaats, 2) mo-dificatie van de aangrijpingsplaats, waardoor deze ongevoelig wordt, 3) detoxificatie, en 4) verminderde accumulatie door een verminder-de opname. Beiverminder-de proefschriften hebben betrekking op een recent ontdekt verdedigingsmechanisme dat berust op verminderde accu-mulatie door een verhoogde secre-tie. De secretie wordt mogelijk ge-maakt door membraanpompen die toxische verbinding bij opna-me herkennen en per kerende post terug transporteren naar de uit-wendige omgeving. Pompactiviteit voorkomt dat verbindingen in het cytoplasma accumuleren tot fun-gitoxische concentraties. Hoe ho-ger de activiteit des te laho-ger de ge-voeligheid van de schimmel voor
toxische verbindingen. Vandaar de naam van de titel van dit artikel: pompen of verzuipen.
Een interessant aspect van mem-braanpompen is dat zij vaak een brede substraatspecificiteit bezit-ten. Als gevolg daarvan spelen membraanpompen niet alleen een rol bij bescherming tegen afweer-stoffen van planten maar ook te-gen synthetisch fungitoxische ver-bindingen. Dit impliceert dat membraanpompen een rol kun-nen spelen bij de virulentie van plantenpathogenen, de effectiviteit van fungiciden kunnen beïnvloe-den en een rol kunnen spelen bij multidrug-resistentie (MDR). MDR betekent een gelijktijdige resisten-tie-ontwikkeling van organismen tegen chemisch niet-verwante ver-bindingen en is vooral belangrijke bij resistentie van tumorcellen te-gen antitumor medicijnen en van bacteriën tegen antibiotica.
Membraanpompen
van M. graminicola
Veel membraanpompen behoren tot de familie van de ATP-bindingscassette (ABC) transpor-teiwitten. ABC transporteiwitten bezitten ATP-bindingsplaatsen waar, door hydrolyse van ATP, energie wordt gegenereerd om transport van substraten tegen een concentratiegradient over mem-branen mogelijk te maken. ABC transporteiwitten behoren tot één van de grootste genfamilies en ko-men in alle levende organisko-men voor. Doel van beide promotieon-derzoeken was om genen die code-ren voor ABC pompen van M. gra-minicola te kloneren enfunctioneel te analyseren. M. gra-minicola (anamorf Septoria tritici)
[
PROMOTIE
Pompen of verzuipen
I. Stergiopoulos, L-H. Zwiers en M.A. de Waard
Op 1 mei 2002 promoveerde aan de Wageningen Universiteit Lute-Harm Zwiers op een proefschrift getiteld: ABC transporters of the
wheat pathogen Mycosphaerella graminicola. Op 20 januari 2003
pro-moveerde Ioannis Stergiopoulos op een proefschrift getiteld: The role
of the ATP-binding cassette (ABC) transporters in pathogenesis and multidrug resistance of the wheat pathogen Mycosphaerella gramini-cola. Voor beide promovendi was Prof. dr. P.J.G.M . de Wit de promotor
en Dr. M.A.de Waard (Wageningen Universiteit, Laboratorium voor Fy-topathologie) de co-promotor.
is de veroorzaker van de septoria-bladvlekkenziekte op tarwe. Het pathogeen werd als studie-object gekozen omdat de ziekte in toene-mende mate een bedreiging is van de tarweteelt, speciaal in gebieden met hoge luchtvochtigheid en ge-matigde temperatuur. Om die re-den is een beter begrip van mole-culaire mechanismen die tijdens de pathogenese een rol spelen en van resistentieontwikkeling tegen fungiciden essentieel. In totaal werden vijf ABC transportgenen gekloneerd (MgAtr1-MgAtr5). Het open reading frame van alle genen is ongeveer 4500 basenparen lang en codeert voor eiwitten (MgAtr1-MgAtr5) die een hoge mate van homologie bezitten met ABC trans-porters van andere schimmels en gisten. Met uitzondering van MgAtr3 kan de expressie van alle genen geïnduceerd worden door natuurlijk en synthetisch toxische verbindingen, zoals antibiotica, se-condaire metabolieten van planten (o.a. fytoalexinen) en azool fungici-den. Deze waarnemeningen sugge-reren dat de transporteiwitten in-derdaad een functie kunnen vervullen bij virulentie en gevoelig-heid voor fungiciden.
Multidrug
pompen
De functie van MgAtr1-MgAtr5 werd allereerst onderzocht door
de gevoeligheid van mutanten van Saccharomyces cerevisiae (bakkers-gist), waarin deze genen tot ex-pressie werden gebracht, te testen voor natuurlijk en synthetisch toxische verbindingen. De gist-transformaten vertoonden een duidelijke verminderde gevoelig-heid voor chemisch niet-verwante verbindingen (azool fungiciden, antibiotica, en fungitoxische met-abolieten van planten), hetgeen er op wijst dat de gecodeerde eiwit-ten functioneren als multidrug pompen met een verschillende doch overlappende substraatspe-cificiteit. De functies van de trans-porteiwitten werden ook onder-zocht door fenotypische
karakterisering van knockout mu-tanten van MgAtr1-MgAtr5 in M. graminicola. Voor de constructie van deze mutanten werd een transformatieprotocol ontwikkeld dat gebruik maakt van Agrobacte-rium tumefaciens. Een verhoogde gevoeligheid voor fungitoxische metabolieten van planten werd al-leen voor knockout transforman-ten van MgAtr5 aangetoond. De overige transformanten vertoon-den geen fenotype. Waarschijnlijk is dit te wijten aan activiteit van andere ABC pompen die het ver-lies van het uitgeschakelde gen kunnen compenseren.
Biotoetsen met antagonistische bacteriën tonen aan dat de MgAtr2 pomp van M. graminicola be-scherming biedt tegen antibiotica
geproduceerd door Pseudomonas en Burkholderia spp. Deze waar-neming is belangrijk omdat het impliceert dat ABC pompen ook belangrijk kunnen zijn bij de over-leving van de schimmel tijdens de saprofytische fase van zijn levens-cyclus.
Virulentie op
tarwe
De functie van MgAtr1-MgAtr5 werd verder geanalyseerd door de virulentie van knockout mutanten te bepalen op zaailingen van tar-we. De virulentie van knockout mutanten van MgAtr4 bleek signi-ficant minder te zijn dan die van het wildtype en de overige knoc-kout mutanten. Histopathologisch onderzoek van het infectieproces toonde aan dat MgAtr4 mutanten substomatale ruimten slecht kolo-niseren. De groeikracht van de MgAtr4 mutant op verschillende media in vitro was niet vermin-derd. Deze resultaten wijzen er op dat MgAtr4 een virulentiefac-tor is van M. graminicola en het pathogeen mogelijkerwijs be-schermt tegen een nog onbe-kende fungitoxische afweerstof van tarwe. Dit verschijnsel is ook gerapporteerd voor ABC pompen van andere plantenpathogenen, waaronder Botrytis cinerea, Gibbe-rella pulicaris en Magnaporthe gri-sea.
Pagina 166 Gewasbescherming jaargang 34, nummer 5, september 2003
Mededelingenblad van de Koninklijke Nederlandse Plantenziektekundige Vereniging
[
Mededelingenblad van de Koninklijke Nederlandse Plantenziektekundige Vereniging
Gewasbescherming jaargang 34, nummer 5, september 2003 Pagina 167
Gevoeligheid voor
azoolfungiciden
Eerder onderzoek met de schim-mels Aspergillus nidulans en B. ci-nerea toonde aan dat laboratori-umstammen met verminderde gevoeligheid voor azoolfungici-den, tevens multidrug-resistentie bezitten tegen uiteenlopende ver-bindingen. Dit fenotype bleek te correleren met overexpressie van specifieke ABC genen en een ver-minderde accumulatie van azool fungiciden ten gevolge van ver-hoogde secretie. Beide promotie-onderzoeken toonden aan dat dit mechanisme bij M. graminicola minder duidelijk is. Azool-resis-tente laboratorium stammen ver-toonden weliswaar een MDR feno-type maar de verminderdegevoeligheid kon niet duidelijk worden geassocieerd met overex-pressie van een specifiek ABC gen. In één van de stammen werd een duidelijke overexpressie van
MgAtr1 gevonden en disruptie van het gen herstelde de wild-type ge-voeligheid voor azoolfungiciden, hetgeen suggereert dat MgAtr1 een factor is die mede bepalend is voor azoolgevoeligheid van M. gramini-cola. Ook in veldisolaten met een sterk uiteenlopende gevoeligheid voor azoolfungiciden kon geen duidelijke correlatie tussen expres-sie van geïdentificeerde ABC ge-nen en accumulatie van azoolfun-giciden worden vastgesteld. De resultaten wijzen er op dat meer-dere mechanismen de verschillen in gevoeligheid van veldisolaten van M. graminicola beïnvloeden.
Conclusies en
vooruitblik
De gegevens van beide proef-schriften tonen aan dat ABC pom-pen van M. graminicola belangrij-ke functies bezitten bij de bescherming van het pathogeen
tegen fungitoxische afweerstoffen van planten. Dit verklaart waar-schijnlijk de ontdekking dat de ABC pomp MgAtr4 een virulentie-factor van de schimmel is op tar-we. Er werden ook aanwijzingen verkregen dat ABC pompen van belang kunnen zijn voor gevoelig-heid en multidrugresistentie tegen azoolfungiciden. Het huidige on-derzoek is er op gericht om mem-braanpompen te vinden die in dit opzicht een meer uitgesproken rol vervullen. Identificatie van ABC pompen die fungeren als virulen-tiefactor kan leiden tot de ontwik-keling van een nieuwe generatie middelen die zelf geen fungitoxi-sche activiteit bezitten maar plan-tenziekten beheersen door een verbeterde exploitatie van afweer-reactie van waardplanten. Identifi-catie van zulke MDR pompen kan leiden tot de ontwikkeling van middelen die de effectiviteit van fungiciden verhogen en MDR re-sistentiemechanismen teniet doen.
