Het werkcollege kraakbeen: een selectie van de eindverslagen

Het werkcollege kraakbeen

Citation for published version (APA):

Technische Universiteit Eindhoven (TUE). Buro Biomedische en Gezondheidstechnologie (BMGT) (1988). Het werkcollege kraakbeen: een selectie van de eindverslagen. (BMGT; Vol. 88.120). Technische Universiteit Eindhoven.

Document status and date: Gepubliceerd: 01/01/1988 Document Version:

Uitgevers PDF, ook bekend als Version of Record Please check the document version of this publication:

• A submitted manuscript is the version of the article upon submission and before peer-review. There can be important differences between the submitted version and the official published version of record. People interested in the research are advised to contact the author for the final version of the publication, or visit the DOI to the publisher's website.

• The final author version and the galley proof are versions of the publication after peer review.

• The final published version features the final layout of the paper including the volume, issue and page numbers.

Link to publication

General rights

Copyright and moral rights for the publications made accessible in the public portal are retained by the authors and/or other copyright owners and it is a condition of accessing publications that users recognise and abide by the legal requirements associated with these rights. • Users may download and print one copy of any publication from the public portal for the purpose of private study or research. • You may not further distribute the material or use it for any profit-making activity or commercial gain

• You may freely distribute the URL identifying the publication in the public portal.

If the publication is distributed under the terms of Article 25fa of the Dutch Copyright Act, indicated by the “Taverne” license above, please follow below link for the End User Agreement:

www.tue.nl/taverne Take down policy

If you believe that this document breaches copyright please contact us at: openaccess@tue.nl

providing details and we will investigate your claim.

BET W'ERKCOLLEGE KRAADEiN

Een .al.cUe van de eindverslagen

Typewerk Mia Lutters

DistributU~: Technische 'Unlversltelt Ein~

Buro

Bioaedische eu.

Gezondheidstechnol~e Postbu$ 513

1. 2. 3. 4. 5. 6.

Wim Winke1mo1en: Het veze1netwerk in gewrichtskraakbeen Peter Deen De opperv1aktestructuur van

gewrichts-kraakbeen

Joost van Rijn: Een-assige trekproef op kraakbeen Wim Winke1mo1en: Gewrichtssmering versus poreuze

1agersmering

Marc Beusenberg: Degeneratie/veroudering van gewrichts-kraakbeen en de veranderingen hierdoor in de mechanische eigenschappen van de matrix van gewrichtskraakbeen

H.J. Jansen Een 1iteratuurstudie naar de mechanische functie van de meniscus

1 19 63 87 105 137

Deze bundel bevat een zestal verslagen, geschreven door studenten die deelgenomen hebben aan het werkcollege "Kraakbeen" gedurende de vier cursusjaren 1983/84, 1984/85, 1985/86 en 1986/87. Dit werkcollege maakte deel uit van het keuzepakket biomedisch-technische vakken aangeboden door de vakgroep Fundamentele Werktuigkunde en Biomedische Techniek van de Faculteit Werktuigbouwkunde.

Bij de samenstelling van deze bundel is een keuze gemaakt, waarbij niet alleen op kwaliteit gelet werd, maar waarbij ook gestreefd werd naar een samenhangend en representatief beeld van de in deze werk-colleges behandelde onderwerpen.

Ter inleiding een enkel woord over de bedoeling en opzet van deze werkcolleges. Beseffend dat het onmogelijk is om studenten in de techniek met belangstelling voor biomedisch-technische onderwerpen door het aanbieden van een beperkt aantal hoorcolleges informatie mee te geven, die een doelmatige voorbereiding biedt voor een mogelijke confrontatie met dit onderzoeksterrein gedurende hun latere beroeps-uitoefening, hebben wij bij de opzet van het keuzevak de nadruk op zelfwerkzaamheid gelegd in een situatie die de beroepspraktijk zoveel mogelijk benaderde.

Daartoe werden aan de studenten aan aantal probleemstellingen voor-gelegd die zij met behulp van opgegeven literatuur moesten bestuderen. Deze probleemstellingen waren aan het interdisciplinaire veld van biologisch, medisch en technisch onderzoek ontleend en daarvoor bleek het onderwerp "Kraakbeen" heel geschikt. Kraakbeen is een materiaal met interessante eigenschappen, die door technici vrij uitvoerig zijn onderzocht. Deze eigenschappen zijn niet alleen vanuit technisch oogpunt gezien interessant, maar spelen ook een rol in talrijke me-dische problemen betreffende het bewegingsapparaat, zodat zij ook voor medici van het grootste belang zijn. Wetenschappelijke publicaties over experimenteel werk en theoretische modelstudies vormen waardevol en dankbaar studiemateriaal, waaruit de beperkingen en mogelijkheden van technische methoden voor de bestudering van levende materialen duidelijk naar voren kunnen komen. Het materiaal nodigt uit tot een kritische analyse, dwingt tot het maken van een vertaalslag tussen de verschillende disciplines en het toepassen van verworven kennis en

technieken. De studenten waren verplicht om over hun bevindingen zowel mondeling als schriftelijk te rapporteren. Het uitwerken van deze opdrachten kostte mede door de van het normale curriculum afwijkende opzet nogal wat inspanning, maar werd door alle deelnemers als zeer zinvol en stimulerend ervaren.

Wij hopen dat deze selectie van de eindverslagen ook voor de lezer interessant materiaal bevat.

Prof.Dr. A. Huson Dr.lr. A.A.H.J. Sauren Dr.lr. C.W.J. Oomens

HET VEZE:LNETWERK IN GEWRICHTSl<RAA.K.BEEN

Wim Winkelmolen

februari 1985

TECHNISCHE UNIVERSITEIT EINDHOVEN

FACULTEIT DER WERKTUIGBOUWKUNDE

Inhoudsopgave

Inleiding 5

1. Beschrijving gewrichtskraakbeen 6

2. Vezelnetwerk volgens Minns en Steven 7

2.1 Algemene preparatiemethoden 7

2.2 Resultaten 7

2.2.1 Verkalkt kraakbeen en bot 7

2.2.2 Middenlaag 8

2.2.3 Oppervlaktelaag 9

2.3 Totaal-overzicht van de vezelstruktuur 9

3. Vezelnetwerk volgens MacConaill 11

3.1 Preparatiemethode 11

3.2 Resultaten 11

3.3 MacConaill-model 11

4. Discussie MacConaill-model 13

4.1 Krachtdoorleiding in MacConaill-model 13

4.2 Discussie experimentele uitgangspunten MacConaill-model 14

5. Discussie Minns en Steven-model 15

5.1 Krachtdoorleiding in Minns en Steven-model 15

5.2 Discussie experimentele uitgangspunten Minns en Steven-model 15

6. Conclusies

Literatuurlijst

16

Inleiding

Ove~ het vezelnetwerk van het gewrichtskraakbeen zijn in de loop der jaren enkele modellen ontstaan. Ik zal in dit verslag aan de hand van enkele artikels twee van deze modellen bespreken en vergelijken. Deze zijn het MacConaill-model en het model dat door Minns en Steven gehanteerd wordt.

Het zal duidelijk worden dat het MacConaill-model, dat dateert uit 1951, volledig achterhaald is en plaats heeft gemaakt voor het model, dat ook Minns en Steven hanteren en dat in grote 1ijnen a1gemeen aanvaard is. Van een serieuze verge1ijking zal dan ook geen sprake zijn.

1. Beschrijving gewrichtskraakbeen

Ret gewrichtskraakbeen behoort tot het hyaline of glasachtige kraak-been. Ret kraakbeen bestaat uit een matrix met daarin ge1egen ce11en: de chondrocyten. De matrix bestaat voorname1ijk uit water, proteog1y-canen en col1ageenveze1s. Van deze veze1s wordt gedacht dat zij een grote rol spe1en bij een be1angrijke functie van het gewrichtskraak-been, n1. de krachtdoorleiding tussen de botten. Rierbij zou dan gebruik worden gemaakt van de grote trekstijfheid van deze veze1s. De chondrocyten zijn verantwoorde1ijk voor de produktie van de ma-trixcomponenten, en 1iggen derha1ve ook verspreid in deze matrix. G1obaa1 kan men het gewrichtskraakbeen op grond van b.v. de veze1-struktuur inde1en in vier 1agen. Deze vier 1agen zijn: de opperv1ak-te1aag, de midden1aag, de diepe 1aag en de 1aag waarin men kan spre-ken van verka1kt kraakbeen. Tussen deze 1aatste twee lagen bevindt zich de zogenaamde "tide mark". Over de veze10rdening in deze lagen zijn de laatste jaren wat meningen gevormd. De verschillende vezelor-dening in deze lagen heeft men proberen te verklaren met behulp van modellen, zoals b.v. het Benninghof-model of het MacConaill-model. Ik zal trachten deze vezelstruktuur aan de hand van Minns en Steven

[lit. 2] enerzijds en MacConaill [lit. 1] anderzijds te beschrijven. Verder zal ik proberen de diverse mechanische consequenties van de modellen te bespreken.

2. Vezelnetwerk volgens Minns en Steven [lit. 2] 2.1 Algemene preparatiemethoden

Voor het onderzoek werden uit het kraakbeen (en een gedeelte van het onderliggende bot) blokjes van 4x4x4 rom gesneden. Hierin werd met een mesje een kleine gleuf gemaakt. Nadat het blokje een bepaalde behan-de1ing had ondergaan werd het zorgvu1dig gedehydreerd met een op1o-pende aceton-concentratie. Deze behande1ing is afhanke1ijk van de zichtbaar te maken struktuur en per 1aag verschi11end. Voor de pre-cieze preparaties, goed uitgewerkt tot in a11e details, wordt verwe-zen naar Minns en Steven [lit. 2].

Na de dehydratie vo1gde de Critica1-Point-Drying. Bij het onderzoek naar de midden- en beneden1aag werd de oppervlakte1aag verwijderd en het b10kje langs de eerder aangebrachte gleuf gesp1eten (fig. 2.1). Nadat op het breukva1k goud-pa11adium was opgedampt werd het bekeken onder de e1ektronenmicroscoop (scanning electron microscope: SEM). 2.2 Resultaten

Hier werd de struktuur zichtbaar gemaakt door het verse kraakbeen (v66r dehydratie) d.m.v. enzymen (papalnase) af te breken en vervo1-gens gedee1telijk te ontka1ken. Hierna werd het op de in par. 2.1 beschreven manier behande1d.

Split line

A

Surface

Fractured face

B

Fig. 2.1: Om de midden- en be-neden1aag te onderzoeken werd de opperv1aktelaag verwijderd en het b10kje gebroken.

In het benig overgangsweefsel zien we grote holten die omgeven zijn door smalle vezelbundels met dikte 1-1,5 ~m.

Als men dan overgaat naar het verkalkt kraakbeen ziet men dikke bundels (tot 55 ~m) die loodrecht op het bot lijken te staan. Deze grote bundels blijken dan bij een grotere vergroting en een aere invalshoek te bestaan uit buizen met radiale fibrillen er om heen (fig. 2.2). Deze radiale fibrillen houden de bundels bij elkaar (zo lijkthet). Wat de functie van deze buizen in het levende weefsel is, is nog een raadsel (misschien zitten er cellen in?).

SO

!"If

Fig. 2.2: Schematische weergave van een vezelbundel in het verkalkt kraakbeen. Deze staat loodrecht op het bot.

De collageen vezels in het middengebied zijn zichtbaar gemaakt m.b.v. minder drastisch werkende enzymen. Door deze enzymen wordt niet al het organische materiaal verwijderd zoals bij par. 2.2.1 maar een

gedeelte van de tussenstof zodat de vezels beter zichbaar zijn. Het gros van de bundels in dit gebied is ongeveer loodrecht op het kraakbeenoppervlak gericht. De bundels onderscheiden zich van elkaar doordat ze een kleine hoek met elkaar maken. Ze bestaan uit een groot aantal fibrillen. De bundels maken hoeken van 15-20° met de loodlijn

(Boyde en Jones, [lit. 3]). De dikte van deze bundels is ongeveer 50-60 ~m terwijl de fibrillen 0,06-0,08 ~m dik zijn.

Voorts blijkt dat de gaten, overgebleven na verwijdering van chondro-cyten (door enzymen), omringd worden door een dichter netwerk van dunnere fibrillen. Dit laatste wordt in Boyde en Jones [lit. 3] betwijfeld omdat de vezelordening zou kunnen zijn verstoord bij het prepareren (enzymatisch verwijderen van de chondrocyten). In een op

een andere manier geprepareerd proefstukje (zonder de proteoglycanen te verwijderen) was dit effect dan ook veel minder goed te zien [lit. 3] .

De vezels in het kraakbeenoppervlak lijken allemaal evenwijdig hier-aan te lopeno In dit vlak is er geen neiging tot organisatie en lopen de vezels kriskras door elkaar.

De chondrocyten die hier liggen z1Jn afgeplat en ovaal, en liggen met de langste as evenwijdig aan het oppervlak. Ook de chondrocyten in de middenlaag lagen met de langste as evenwijdig aan de bundelrichting. De wand die deze chondrocyten omgaf bestond hier evenals in het middengebied uit een dicht netwerk van fibrillen (Minns en Steven,

[lit. 2]).

2.3 Totaal-overzicht van de vezelstruktuur

Om het verloop in de verschillende lagen op elkaar te laten aanslui-ten hebben Minns en Steven een model gemaakt. Dit model gaat ervan uit dat de vezels in het bot zich verzamelen en dan (in de "tide mark") bundels vormen. Deze bundels lopen dan in een boog naar het kraakbeenoppervlak waar ze weer uitwaaieren (zie fig. 2.3). Dit model toont grote overeenkomst met het arcade-model van Benninghof. Dit model verschilt o.a. van het Benninghof-model doordat het niet ervan uitgaat dat de vezels, die op het bot beginnen, hier ook weer terug-keren.

'Tidemark'

Fig. 2.3: De grafische voorstelling van het model van Minns en Ste-ven.

3. Vezelnetwerk volgens MacConaill [lit. 1] 3.1 Preparatiemethode

Het kraakbeen, afkomstig van een os of een mens, dat van het bot is afgehaald, wordt eerst gefixeerd m.b.v. formaldehyde en paraffine. Vervolgens werden er hele dunne plakjes vanaf gesneden (8 ~m) in verschillende richtingen (schuin, radiaal, tangentiaal). Oeze dunne plakjes worden verder behandeld en eventueel gekleurd, (met b.v. potassium-permanganaat), waarna ze onder de lichtmicroscoop worden bekeken. Oit gebeurde door middel van:

1) gewoon licht

2) fase-contrast licht 3) gepolariseerd licht.

Het is duidelijk dat dit onderzoek met lichtmicroscopie (v66r 1951) geheel andere "plaatjes" laat zien dan de elektronenmicroscoop. 3.2 Resultaten

Oe resultaten zoals die vermeld z1.Jn in "The mechanical structure of articulating cartilage" van MacConaill [lit. 1] hebben voornamelijk betrekking op het mechanische aspect van het model zoals dat door de schrijver is geponeerd.

Een belangrijke conclusie die in het artikel getrokken wordt, is dat er veel meer collageen vezels aanwezig zijn in het kraakbeen dan voorheen gedacht werd.

Ook hebben de vezels volgens MacConaill geen specifieke voorkeurs-richting. Oit geldt zowel voor het middengebied als de bovenlaag. Oit blijkt o.a. uit het feit dat als men het preparaat op een andere manier bekijkt (andere doorsnede of andere belichtingshoek), men steeds een andere vezeloril!ntatie "ziet". In het artikel wordt niet expliciet gepraat over de vezeloril!ntatie in de buurt van de "tide mark" of het bot.

3.3 MacConaill-model

Aan de hand van de summiere resultaten, beschreven in par. 3.2 en de mechanische belasting zoals die in par. 4.1 aan de orde komt, poneert MacConaill [lit. 1] zijn model.

Oit model gaat uit van rechte vezels die evenwijdig aan het botopper-vlak beginnen en dan in een rechte lijn naar het kraakbeen opperbotopper-vlak lopen (zie fig. 3.1). Bij dit verloop zou men inderdaad in aIle lagen

(behalve in de calcificatiezone) een random vezel-ori~ntatie aantref-fen.

4. Discussie MacConaill-Model

4.1 Krachtdoorleiding in MacConaill-model

MacConaill gaat ervan uit dat onder invloed van een mechanische belasting F in punt P (zie fig. 4.1) voornamelijk een schuifspanning aanwezig is.

Fig. 4.1: Volgens MacConaill is in punt P alleen een schuifspanning aanwezig. Hierdoor staat de vezel die raakt aan de isobaar onder trekspanning.

MacConaill geeft in [lit. 1] helemaal niet aan hoe hij hieraan komt, en op welke materiaaleigenschappen e.d. dit gebaseerd is. Als we uitgaan van lineair elastisch isotroop materiaal, (wat niet lijkt op kraakbeen) belast door een puntkracht F, krijgen we in punt P juist

g~~n schuifspanning (zie fig. 4.2 en [lit. 4]). Alhoewel we te maken hebben met een volledig ander materiaal, en waarschijnlijk ook een

iets andere belasting, werpt dit toch enkele vragen op bij de "schuifspanning" van MacConaill.

r

Fig. 4.2: Uitgaande van lineair elastisch isotroop materiaal ontstaat in punt P g~~n schuifspanning.

A1s er geen schuifspanning optreedt in het kraakbeen in punt P (fig. 4.1), dan zal de vezel ter p1ekke geen (trek-)be1asting kunnen opne-men. Dit houdt in dat een be1angrijke drijfveer achter het

Mac-Conaill-model, n1. dat de veze1 groeit in de be1angrijkste spannings-richting, (zoa1s ijzervij1sel zich richt naar een magnetisch veld) niet meer van toepassing is voor dit model.

MacConaill heeft het er in [lit. 1] ook niet over we1k deel van het kraakbeen de drukkrachten opneemt. Dat er ook iets moet zijn dat op druk be1ast wordt is niet zo moeilijk te bewijzen. (Denk aan het cremona-diagram).

A1s de col1ageenvezels op trek be1ast zouden worden, zou de rest van de matrix op druk be1ast moe ten worden. De kraakbeenlaag za1 op de plaats waar de kracht inge1eid wordt vervormen en dus dunner worden. Als we het kraakbeen bekijken als een vloeistofachtige substantie

(dus min of meer onsamendrukbaar) zal daardoor op een andere plaats de kraakbeen1aag dikker worden. Dit wordt dan gedeelte1ijk tegenge-gaan door op trek be1aste vezels. Overigens is het ver100p van de vezels (MacConaill-model of Minns en Steven-model) niet zo van be1ang als we uitgaan van dit mechanisme. Door de permeabiliteit van het kraakbeen zal dit na ver100p van tijd weI als samendrukbaar gezien kunnen worden doordat, door het wegstromen van vloeistof uit het kraakbeen, het volume afneemt.

Uit het voorafgaande blijkt dat de mechanische belasting niet zonder meer leidt tot het MacConaill-model, terwijl MacConaill deze mecha-nische belasting wel als een belangrijk argument voor zijn model aanvoert.

4.2 Discussie experimente1e uitgangspunten MacConaill-model

Een van de conc1usies die MacConaill in [lit. 1] trekt is dat er geen vezel-ordening bestaat in de midden- en bovenlaag van het kraakbeen. Dit zou goed een artefact kunnen zijn omdat bij het snijden van de plakjes de veze1s, die onder voorspanning staan, kapot gesneden worden waardoor een wanorde ontstaat.

Een ander punt van kritiek is dat MacConaill geen waarnemingen doet over de veze1ori~ntatiedicht bij het botoppervlak. Hier zouden de vezels volgens het model evenwijdig aan het botoppervlak moe ten lopeno Zonder die zekerheid is het model, ze1fs uitgaande van een wi1lekeurig ver100p in de andere lagen, zeer wi1lekeurig gekozen.

5. Discussie Minns en Steven-model

5.1 Krachtdoor1eiding Minns en Steven-model (MS-model)

De vezels in de midden- en diepe1aag kunnen bij een drukbe1asting op trek belast worden. Dit werd aan het einde van par. 4.1 uitgelegd. Het voordeel van het MS-model t.o.V. het MacConaill-model in dit opzicht is dat de vezels in het MS-model goed "verankerd" liggen in het bot terwijl ze bij het MacConaill-model aIleen maar raken aan het bot.

5.2 Discussie experimentele uitgangspunten MS-model

In tegenstelling tot de preparatiemethode die MacConaill in [lit. 1] gebruikt wordt hier het te "bekijken" vlak niet gesneden maar gebro-ken. Het kraakbeen splijt in de richting van het belangrijkste vezel-verloop. Dit kan men vergelijken met hout dat gespleten is en hout dat in de houtrichting gezaagd is.

De vezelrichting in het MS-model wordt goed onderbouwd door de waar-nemingen [lit. 2] in de verschillende 1agen. Maar het in overeenstem-ming brengen van de vezelrichting in boven- en middenlaag is volgens mij meer op gevoel gedaan. Er zijn immers geen waarnemingen over dit overgangsgebied beschreven in [lit. 2]. Als men uitgaat van vezel-bundels die, aangekomen in de bovenlaag, uitwaaieren (zoals in het MS-model), dan zou men in de bovenlaag plaatsen moeten onderscheiden met vnl. radiaal gerichte fibrillen. Dit werd niet waargenomen. Het "probleem" van de radiaal gerichte fibrillen wordt opgelost als men er van uitgaat dat de fibrillen van verschillende bundels net onder de bovenlaag verstrengelen, zodat men hier een echte random

vezel-ori~ntatie aantreft. Van zo'n zone wordt in Minns en Steven [lit. 2] of Boyde en Jones [lit. 3] geen melding gemaakt.

6. Conclusies

Het MacConaill-model ondervindt zowel vanuit mechanisch oogpunt als vanuit experimentele waarnemingen kritiek. Alhoewel ik natuurlijk niet weet hoe de krachtdoorleiding precies in elkaar zit, is het toch mogelijk om plausibel te maken dat de krachtdoorleiding in het MacCo-naill-model hoogst merkwaardig is. De krachtdoorleiding volgens het model dat door Minns en Steven in [lit. 2] geponeerd wordt levert overigens ook (hoewel minder) problemen op.

De experimentele waarneming die MacConaill gedaan heeft [lit. 1] is waarschijnlijk het gevolg van grote artefacten, terwijl Minns en Steven de preparaties zo zorgvuldig gekozen hebben dat de eventuele artefacten klein blijven. Dit houdt overigens niet in dat hun model op enkele punten, (zoals de overgang tussen midden- en bovenlaag) misschien enkele aanpassingen behoeft.

Literatuurlijst

[1] MacConaill M.A.: (mei 1951): The movement of bones and joints, 4. The

mechanical structure of articulating cartilage: Journal of Bone and Joint Surgery: Vol. 33 B.

[2] Minns R.J., Steven F.S.: (1977): The collagen fibril organisation in

human cartilage: J. Anat.: Vol. 123: pp 437-457.

[3] Boyde A., Jones S.: (1983): Scanning electron microscope study of

cartilage: Cartilage: Vol. 1: pp 105-148.

[4] Lancaster P.R., Mitchel D.: Advanced solid mechanics: 1ste druk: The

Peter Deen

februari 1985

TECHNISCHE UNIVERSITEIT EINDHOVEN

FACULTBIT DER

WERKTUIGBO'lJ\lIDNJ)E

VAKGROEP WFW

Inhoudsopgave Inleiding 23 1. Onderzoekmethoden 24 1.1 Ruwheidsmeting 24 1.2 Lichtmicroscopie 24 1.3 Electronenmicroscopie 25 2. Ruwheidsmeting 27 2.1 Meten op replica's 27 2.2 Directe ruwheidsmeting 27

2.3 Is directe ruwheidsmeting toegestaan? 28

2.4 Discussie 29

3. Lichtmicroscopie 30

3.1 Metingen in vitro 30

3.2 Observaties in vivo 30

3.3 Yaarnemingen in situ direct post mortem 32

3.4 Conclusies 32

4. Electronenmicroscopie 34

4.1 Surface characteristics of human articular cartilage

-a sc-anning electron microscope study 34

4.1.1 Preparatie 34

4.1.2 Resultaten 34

4.1.3 Discussie en conclusies 36

4.2 The morphology of the surface of articular cartilage

in adult rats 36

4.2.1 Materiaal en methoden 36

4.2.2 Yaarnemingen 39

4.2.3 Discussie 44

4.3 Die Ultrastruktur von GelenkknorpeloberflAchen und

ihre funktionelle Bedeutung 45

4.3.1 Materiaal en methoden 45

4.3.2 Resultaten 46

4.3.3 Het oppervlak van gewrichtskraakbeen in normale

belaste toestand 49

4.3.4 Het oppervlak van gewrichtskraakbeen in onbelaste

toestand 49

4.3.5 Discussie 52

4.4 A transmission electron microscopic comparison of the articular surface of cartilage processed attached

to bone and detached from bone 53

4.4.1 Materiaal en methoden 53

4.4.3 Preparatie van groep B 4.4.4 Resultaten

4.4.5 Conclusies

5. Algemene beschouwing en conclusies

Literatuurlijst 54 54 58 59 61

Inleiding

Over de oppervlaktestructuur van gewrichtskraakbeen zijn de onderzoe-kers het nog niet eens. De een beweert dat het glad is en de ander beweert dat het ruw is. Er worden ook veel verschillende onderzoek-en preparatiemethodonderzoek-en gebruikt. Hierdoor zijn de resultatonderzoek-en vaak moeilijk te vergelijken. In dit literatuuronderzoek zal getracht worden de zaken een beetje op een rij te zetten. Het is de bedoeling

een overzicht te geven van wat er allemaal op dit gebied gedaan is, en hierbij eventueel enige kritische kanttekeningen te plaatsen. Omdat niet alle verschijnselen duidelijk verklaard of behandeld worden in de besproken publikaties worden in het laatste hoofdstuk nog enkele aanbevelingen gedaan voor komende onderzoeken.

1. Onderzoekmethoden

Men kan op verschillende manieren het oppervlak van kraakbeen onder-zoeken. Er zijn kwantitatieve methoden zoals ruwheidsmeting en er zijn methoden zoals onderzoek met de elektronenmicroscoop of de lichtmicroscoop die zowel kwalitatief als kwantitatief zijn. In de volgende paragrafen zullen enkele van deze methoden algemeen toege-licht worden. Een meer gedetailleerde uitleg zal in de volgende hoofdstukken gegeven worden.

1.1 Ruwheidsmeting

De ruwheidsmetingen op gewrichtskraakbeen kunnen in twee kategorie~n

verdeeld worden:

- ruwheidsmeting op replica's - directe ruwheidsmeting

Er wordt gemeten met een diamanten naald die men met een konstante snelheid over het oppervlak sleept. De vorm van deze naald varieert per model en merk meetinstrument. De afrondingsstraal van de naald is ongeveer 2 micrometer. De verplaatsing van de naald wordt omgezet in een elektrisch signaal. Dit signaal wordt meestal grafisch geregis-treerd (Fig. 1). .~I-~t--+--l(--+-+-~~. \ mod·

_.

IlIA Fig. 1

In het geval van meten op replica's wordt het proefstuk na isoleren gereinigd met een zoutoplossing. Hierna wordt er een kunststof over gegoten. Als dit uitgehard is kan men het van het proefstuk losmaken. Het stuk plastic is nu een replica van het kraakbeenoppervlak. Hierop kan men nu gaan meten.

In het geval van directe meting wordt het proefstuk direct na isole-ren in een Ringers-oplossing gedompeld. Men doet de ruwheidsmeting nu direct op het kraakbeenoppervlak.

1.2 Lichtmicroscopie

Men kan op verschillende manieren gewrichtskraakbeen met een licht-microscoop onderzoeken. Het kan onderzocht worden in vivo of in

vitro. Bij onderzoek in vivo kan men het gewrichtskraakbeen van een verdoofd dier bekijken. Dit kan gebeuren door direct na het openen van het gewricht het kraakbeenopperv1ak met de 1ichtmicroscoop te bestuderen. Ook kan men het eerst bedekken met PVP (po1yviny1pyrro1y-done). In de juiste concentratie kan dit dienen a1s een vervanging voor synoviaa1v1oeistof. Hierin kan men dan het objectief, beschermd door een perspex conus, hangen. Hierdoor neem je de schittering van het v1oeistofopperv1ak weg, waardoor het onder1iggende kraakbeenop-perv1ak beter zichtbaar wordt.

Bij onderzoek in vitro kan men drie dingen doen. Ten eerste kan men na het iso1eren van het proefstuk dit direct, eventuee1 met behu1p van een PVP-op1ossing, bekijken. Men kan het ook eerst fixeren in een koud gebufferde osmiumzuurop1ossing. Dan kan men het a1s tweede

moge1ijkheid drogen in atmosferische omstandigheden of, ten derde, vriesdrogen.

Fig. 2

uil. O"IIOIMJC~""/lIfIH10'iltddl,,'

li{(hl i//;co,usclJ!'Y. lIIum/tIIIlWIti.fI'f'O'IUkt/byfillillu,,,,,I. MiU:ifllSUII'U: orrxtr'lfIIlly,byIJIt_Ii".1i,IIIIOIIf't'r.

1.3 E1ektronenmicroscopie

Er zijn twee soorten e1ektronenmicroscopie. Name1ijk de Scanning Electron Microscope (SEM) en de Transmission Electron Microscope

(TEM). Beide zijn geschikt om het gewrichtskraakbeenoppervlak te onderzoeken. Bij de SEM krijg je een driedimensionaal beeld van het proefstuk terwijl je bij de TEM een doorsnede hiervan bekijkt. Voor onderzoek met de TEM moet het proefstuk eerst geprepareerd worden omdat een heel dun plakje materiaal vereist is. Ook bij SEM is het gebruikelijk het proefstuk te prepareren voordat je met het onderzoek begint. Het is wel mogelijk om op een vers proefstuk een laagje goud of platina te dampen voor SEM onderzoek. Maar door de hoge temperatu-ren tijdens het electronenbombardement en het vacuUm waarin het

proefstuk zich bevindt zal er aanzienlijke schade hieraan toegebracht worden.

Een veel toegepaste methode om kraakbeen te prepareren voor electro-nenmicroscopisch onderzoek zal nu behandeld worden. Na het snijden van het proefstuk wordt het eerst gespoeld in een mengsel van alde-hyde in een cacodylate-buffer (pH 7,3). Dan wordt het eventueel nog gespoeld in osmiumtetroxide in een cacodylate-buffer. Hierna kan het proefstuk watervrij gemaakt worden met behulp van de vriesdroogme-thode. Een andere manier om het water te verwijderen is het spoelen met alcoholoplossingen van oplopende concentraties (25%-50%-75%-85%-95%-100%). De critical point drying methode (ePD) kan nu gebruikt worden om het proefstuk alcoholvrij te maken. Dit kan ook gebeuren door drogen onder atmosferische omstandigheden. Deze droogmethoden zijn geschikt voor zowel SEM als TEM. Voor TEM-onderzoek moet het stukje kraakbeen ingebed worden in bijvoorbeeld Epon en in ultradunne plakjes gesneden worden. Voor SEM-onderzoek moet op het gedroogde proefstuk nog een laagje goud of platina gedampt worden. De tijd die de proefstukken in de verschillende oplossingen moe ten liggen va-rieert van een tot vele uren.

2. Ruwheidsmeting 2.1 Keten op replica's

We zullen eerst de resultaten van ruwheidsmetingen op gewrichtskraak-been met behulp van replica's bekijken. We doen dit aan de hand van een studie van Walker c.s. [lit.l]. Een opname van de oppervlakteruw-heid van een replica wordt getoond in figuur 3.

~_/",,--_.,..-r~

F~morol e(JIldyl~.6·rntJlllh "J~I'JI

~--...---...-....-""'\".--~,.,~~

....

_.~. '-'---"'"'-~ fClnUHll lOIl<Jylc, lb'/'",1/~ Fig. 3 Scale, Ver Ileal. 10:0 HOrizontal •JOO

Femoral h~ud. b7yeor\

\

~t{

Q,$~o-orthrouc femoral cOlldyl~,bJyl!on

De Ra-waarde van een oppervlak in technische constructies, met bewe-ging van het ene vlak ten opzichte van het andere, varieert van 0,1 tot 0,4 micrometer. De Ra-waarde van gewrichtskraakbeen varieert van 0,7 tot maximaal 5 micrometer (bij osteo-arthrosis). Voor jong kraak-been is de gemeten Ra-waarde ongeveer 0,7 micrometer met een

golf-lengte van 25 micrometer. Bij toenemende leeftijd neemt de golfgolf-lengte soms toe tot 250 micrometer met hierop nog gesuperponeerd kleinere ruwheden.

2.2 Directe ruwheidsmeting

Voor de resulaten van een directe ruwheidsmeting kijken we naar een studie van Sayles c.s. [lit. 6]. De opname van zo'n directe meting wordt getoond in onderstaande figuur.

De gevonden profielen blijken een min of meer Gaussische hoogteverde-ling te hebben (fig. 4). De dichtheid van het powerspectrum neemt kwadratisch toe met de golflengte van het oppervlak. Bij oppervlakken met deze eigenschappen is de ruwheid geen intrinsieke eigenschap maar evenredig met de wortel van de meetlengte. In deze studie varieert de meetlengte nogal maar omgerekend naar een meetlengte van 0,8 mm

Fig. 4

n/r[~~

~

-f'-IO.·S 0 S to IS IW",,' . - ...n L_I)lml " " - . , . * - I ) _

"""lo., """"'.,

· · _ - - - _ 0 1 ...' _ 0._ _ ", ....

----I 1 0 ' - - _. . ._ _..._ - - ' to ui

WI-_....,..,n,''''''''

r _ •.-uwa01. _ _ .

_r.-u-.

technische constructies) komen de waarden van 1,4 tot 1,8 micrometer aardig overeen met die in eerdere studies op replica's [lit. 1]. Het grootste verschil met metingen op replica's is dat hierbij ook nog kleinere golflengten voorkomen. Deze korte golven belnvloeden de gemiddelde ruwheid niet maar kunnen een behoorlijke invloed hebben op andere oppervlakteparameters zoals de gemiddelde helling.

2.3 Is directe meting toegestaan?

We kunnen ons afvragen of de directe meting wel representatieve gegevens levert. Veroorzaakt de druk van de naald geen ontoelaatbare elastische of plastische vervormingen? Ook al is dit zo, dan nog hoeft dit geen grote invloed te hebben op de resultaten. Als alle delen van het oppervlak evenveel zouden deformeren dan is het gere-gistreerde oppervlakteprofiel gelijk aan dat van het oorspronkelijke oppervlak met daarop gesuperponeerd een constant hoogteverschil. Om de invloed van deze deformaties te bekijken worden de volgende expe-rimenten gedaan.

De indentatiehardheid (Meyerhardheid) van een homogeen en isotroop materiaal is ongeveer drie maal de treksterkte. Over kraakbeen zijn geen duidelijke cijfers met betrekking tot de treksterkte bekend. Maar de meest betrouwbare waarde is 34 MPa op een diepte van 100 micrometer onder het oppervlak (Freeman 1973). Dit betekent dus een indentatiehardheid van ongeveer 100 MPa. De vorm van een veel ge-bruikte naald voor ruwheidsmetingen is een afgeplatte pyramide. De afmetingen zijn 8 micrometer in de bewegingsrichting en 3 micrometer in de richting dwars daarop. De resulterende kracht van de naald op het opperv1ak is ongeveer 1 roN. Dit geeft dus een vlaktedruk van 40 MPa op het kraakbeen. Ondanks het feit dat gewrichtskraakbeen noch

homogeen noch isotroop is, zullen de vervormingen hoogst waarschijn-lijk in het elastische gebied blijven. In de studie van Sayles c.s.

[lit. 6] wordt nog een ander experiment gedaan om de invloed van de vervormingen te bekijken. De naald van de ruwheidsmeter wordt van een bepaalde hoogte losgelaten zodat hij vrij op het kraakbeen kan val-len. De verplaatsing van de naald als functie van de tijd wordt geregistreerd, zie figuur 5 .

•

~--~~.... ~ ._.. - ! .__-.._.-1 Fig. 5 leI ~"''''

__'''.'''''''''''daa_d

•.,... eM

...u:.t..:

IIIlI • ...

De valhoogte wordt zo gekozen dat de belasting bij de landing net zo groot is als de normale statische belasting. De resultaten zijn dat het kraakbeen 0,375 micrometer meegeeft in 3 ms. Dit is een orde kleiner dan de gemeten ruwheden in lit. 1. Hieruit kunnen we dus concluderen dat de deformaties van het kraakbeen tijdens directe metingen niet groot genoeg zijn om de resultaten ongeldig te maken. 2.4 Discussie

Een nadeel van het meten op replica's is het ontstaan van artefacten door prepareren en copi~ren. De gemeten gemiddelde krimp van de diameter van de proefstukken was 16% bij vriesdrogen en 2% bij glu-taraldehyde- en alcoholpreparaties. Ook het replicamateriaal introdu-ceert afwijkingen. Bij metingen op replica's van een optisch vlak referentieprofiel constateerde men afwijkingen in vlakheid en ruw-he den van 0,05 tot 0,1 micrometer [lit. 6]. Deze afwijkingen zijn procentueel niet zo groot (3 tot 16%). Een andere foutenbron is de hoge temperatuur van het replicamateriaal tijdens uitharden. Hierdoor zal vocht uit het materiaal verdreven worden en zal de vorm van het oppervlak veranderen. Al met al kost de directe meting veel minder tijd en moeite en levert minstens zo betrouwbare resultaten.

3. Lichtmicroscopie

In een studie van Gardner en McGillivray [lit. 3] werd het opperviak van gewrichtskraakbeen bestudeerd met behulp van de lichtmicroscoop. Men bekeek kraakbeen van mensen, ratten, varkens, muizen, konijnen en kalkoenen. Men heeft zowel dit in vitro als in vivo gedaan.

3.1 Metingen in vitro

Na het isoleren van de proefstukken werden deze in een koude gebuf-ferde osmium-zuur-oplossing geIegd. Een deel van de proefstukken werd aan de lucht gedroogd, het andere deel werd drooggevroren. Het vries-drogen gebeurde door de proefstukken in isopentaan, gekoeid tot -70°C met een alcohol/C0₂ mengsel, te leggen. Hierna werden ze in een

Pearse/Edwards weefseldroger drooggevroren gedurende 24 uur op -60°C. Het kraakbeenoppervlak is bij aIle dieren dof. Bij de drooggevroren proefstukken kon men toch een indruk van de oppervlaktestructuur krijgen door de rode kleur van onder het oppervlak liggende vaten. De Iigging van deze vaten leek samen te vallen met tweede-orde opper-vlakteonregelmatigheden (400 micrometer). Deze onregelmatigheden kwamen niet vaak voor bij rat ten maar werden algemeen waargenomen bij varkens en kalkoenen. Bij de Iuchtgedroogde en drooggevroren proef-stukken waren de tertiaire onregelmatigheden goed te zien, vooral wanneer het oppervlak belicht werd onder kleine hoeken. Bij observa-ties in vivo zijn deze verschijnselen veel slechter te zien.

3.2 Observaties in vivo

Bij de observaties in vivo werden de proefdieren verdoofd, het ge-wricht geopend en de dieren op een stuk kurk op de microscooptafel geIegd. De grotere dieren werden op een grotere, beweegbare operatie-tafel bij de microscoop gelegd.

Zowel bij mens en als bij dieren werden oppervlakteonregelmatigheden gezien. Vooral de waarnemingen gedaan bij rat ten werden uitvoerig beschreven in [lit. 3] (zie fig. 6). Meteen na het openen van het gewricht van het verdoofde dier wordt begonnen met de waarnemingen. Tot 5

a

6 minuten na het openleggen van het kraakbeenoppervlak is er bijna niets te zien. Door de synoviaalvloeistof wordt het opvallende licht te sterk weerkaatst om iets van het kraakbeenopperviak te kunnen zien. Na ongeveer 6 minuten werd het opperviak in zijn geheel zichtbaar. Het kraakbeen is transparant en hierdoor waren vlakken loodrecht op de optische as moeilijk of niet te zien. Er werd een patroon waargenomen van kleine tertiaire onregelmatigheden die lijken op de 20 tot 40 micrometer grote onregelmatigheden waargenomen tij-dens electronenmicroscooponderzoek.

.10. 12 Rat: jemoral condyle. EjJects of ischaemia are shoWII. Circulotion to joint has been cut off, Vessels in

FIG. 4 Rat: femoral condyle, Margin of acutely-angled surface. with tertiary ulldulatiollS seen CIt edge. Leitz illcident IiKht microscope,-. 110.

' I ! i .7 Rat: lower elld ofklllur. Patellar sllrface. exposed

at arthrotomy but u/ltouched. Secondary surface irregulari-ties are clearly seell, Zeiss operatillg microscope. x 2.

II 12. 13

17.18.19 14.15.10 8,9.10 3.4,7

FIG. 13 Rat: femoral condyle. Effects of drying 15 min. after onset of ischaemia. Small, white, refractile surface foci hal'e begun to appeur. Compare with Fig. 14. Size of opaque foci approximates to that of tertiary Sllrface ulldlllations. Leitz illcident light microscope. /. 65.

FIG. 14 Rat: femoral condrle. Compare with Fig. 13. In this photograph the surface appearallces after 30 min. of ischaemia are showlI. Leitz illcidem light microscope. ;<65.

FIG, 15 Mouse: condylar surface of femllr. Surfttce is .'iewed throllgh PVP during life. Both secondary irregular-ities and tertiary IlIldulations call be itlentified. Leitz incident light microscope. x 65.

FIG. 16 Mouse: femoral condyle. Dried specimen. after fixation ill osmic ucid. jor comparison with Figs 15 and 17. Leitz incidem light microscope, x 65.

FIG. 17 foetal mouse: femoral s/IIlace. Compare with Figs 15 cllld 16. The customary pal/em of tertiary III/dula-tiolls is shown on the patellar surface of the fell/III'. Leitz incidellt light microscope. x 65.

nG. 18 Turkey: til>ial cOlldyle. AI ml/rgill of tibia, a coarse ,Pattern of surrace irregularities i.i seen. Dry speci-men. fIXed in oSlllic acid. Leitz incident light micl"Oscope.

x 65.

underlying bone are prominent and congested. Leitz incident light microscope. ;< 65.

FIG.19 Turkey: tihial colltlylur swface. Coarse pattem of secondary ,"urface irregularities and of shallow surfa! e tertiary undulations bears conspicuous, superimposed jibre pattern. Dry specimen. fixed in ol'lnic acid. Leitz incidem light microscope. x 65,

•

..

'.

'

.

.

'

fiG. 8 Rat: femoral condyle, Artic'ular .""face of dead unimul.for comparisoll with Figs7.9,ulld10.Surfuce, not covered with P VP, Il'CI,1exulllilled immediately ajier killillg.

Note tertiary ullelulatiol/s. Leitz illcidel/t lii:ht microscope.

)0 65.

FIG. 10 Rat: !i'lIwl"IIl condyle. For compal'isoll ",ith Figs8

mid 9, /i'esh, Ji'1'l'ze-dried specimen, .i!:oll'ing pattei'll of tertiary sllljilce unduliltiollS. Leitz incidl'm light micro,H'Opl'.

, 65,

..

,., G. I 1 Rat: ji'lIwml cOlldyle, Vasculature of bOl/e /II/llerlyinl: articular cartilaxl', seen i/l imact. ullaesthelized unimal. Pattenr of Mood l'essels corre.vpollds to locatioll of Ol'erlyill!! secondary ,"urjace irregularities. Leil:: incident light mieroscop.,. 65.

\

FIG. 3 Rat: femoral cartl/age. Surface of femoral condyle. showing tertiary sarface undulations. Material fixed in osmic acid and air-dried. Leitz incident light microscope. i. 110.

fiG.9 Ral: fl'lIIorill cOlldyle. For comparison with figs 7,

6 8, 10. Another area displayillg pat/em of tertiary surface /IItdulatiol/s. Leit;: iwident liKht microscope. )0. 65,

Het was mogelijk onder het oppervlak liggende lagen te bekijken door hierop te focusseren. Hierbij werden aan de randen bloedvaten waarge-nomen en op de meer centraal gelegen delen suggereerde het patroon onderliggende vaten. De waarnemingen blijven hetzelfde gedurende een uur na openen van het gewricht. Bij muizen en konijnen zijn de waar-nemingen hetzelfde als bij ratten. Hetzelfde geldt voor varkens met als enige afwijking het feit dat de bij ratten waargenomen onregel-matigheden hier voorkomen in een honingraatprofiel. Ook de afmetingen zijn groter dan de 20 tot 40 micrometer bij ratten. Bij de kalkoen werden geen tweede-orde onregelmatigheden waargenomen. WeI waren longitudinale en dwarsbanden zichtbaar die zelf weer waren bedekt met tertiaire golvingen.

3.3 Waarnemingen in situ direct post mortem

De proefdieren werden eerst verdoofd en de gewrichten geopend. Hierna werden de dieren gedood. Tot 9 minuten na intrede van de dood werden er geen veranderingen waargenomen. Daarna werden voorheen nauwelijks zichtbare onregelmatigheden plotseling ~~n voor ~~n wit. Deze vlekjes werden eerst gezien boven op de knook, maar later ook, zij het in mindere mate, op de andere plaatsen. De vlekjes ontwikkelden zich tot 30 minuten na de dood van het dier. Dezelfde waarnemingen werden gedaan bij levende dieren waarvan het gewricht in een warme lucht-stroom was geplaatst. In beide gevallen verdwenen de witte vlekjes binnen 30 tot 60 seconden nadat het oppervlak bedekt werd met zoutop-lossing of PVP.

Proeven waarbij het objectief in de PVP werd gehangen geven dezelfde resultaten als bij de proeven in vivo waarbij het kraakbeen aan lucht wordt blootgesteld. Het enige verschil was dat bij waarnemingen met behulp van PVP de onregelmatigheden niet zo goed zichtbaar waren. Bij de mens werden onregelmatigheden waargenomen die kleiner waren dan de tertiaire bij dieren. Er werden golvende hoog en laag gelegen delen gezien. Het gewrichtskraakbeen was echter nergens glad.

3.4 Conclusies

In de publikatie van Gardner en McGillivray [lit. 3] werd het volgen-de geconcluvolgen-deerd.

Bij zowel zoogdieren als vogels komt een vast patroon van onregelma-tigheden op het kraakbeenoppervlak voor. Deze structuren die al eerder waargenomen zijn bij SEM-onderzoeken en lichtmicroscopie in vitro zijn dus geen artefacten maar de werkelijke structuur in vivo. Toch zou men bezwaar kunnen maken tegen de vaak rigoreuze preparatie-methoden voorafgaande aan electronenmicroscopie en lichtmicroscopie

in vitro. De resultaten z~Jn waarschijnlijk toch nog acceptabel omdat kraakbeen een avasculair weefsel is. Hierdoor kunnen er geen snelle veranderingen optreden in de structuur tijdens de preparatie.

Bij verschillende proefdieren werden wel verschillen in het patroon van secundaire onregelmatigheden geconstateerd. Maar het patroon van tertiaire onregelmatigheden was bij alle dieren opvallend constant.

Als een laatste opmerking over het uitdrogen van weefsel dat aan lucht wordt blootgesteld. Na 9 minuten werden de eerste veranderingen zichtbaar. Aan de resultaten van beproevingen op mechanische eigen-schappen en metingen ten aanzien van smering moet getwijfeld worden als deze plaatsvinden op kraakbeen dat langer dan 15 minuten zonder bloedtoevoer is geweest.

4. Electronenmicroscopie

In dit hoofdstuk zullen de resultaten van 4 verschillende electronen-microscoop-onderzoeken bekeken worden. De resultaten hiervan zijn in de volgende publicaties opgenomen:

- Surface characteristics of human articular cartilage - a scanning electron microscope study.

Ian C. Clarke [lit. 2]

- The morphology of the surface of articular cartilage in adult rats. Roy D. Bloebaum and Andrew S. Wilson [lit. 7]

- Die Ultrastruktur von Gelenkknorpeloberflnchen und ihre funktionel-Ie Bedeutung.

I. Hesse [lit. 8]

A transmission electron microscopic comparison of the articular surface of cartilage processed attached to bone and detached from bone.

F.N. Ghadially, N.K. Yong and J-M.A. Lalonde [lit. 9]

De eerste twee onderzoeken zijn gedaan met de SEM. Het derde onder-zoek is gedaan met zowel SEM als TEM en het laatste met aIleen TEM. 4.1 Surface characteristics of human articular cartilage - a scanning

electron microscope study

Er werd gebruik gemaakt van menselijk post-mortem materiaal van 32 tot 64 jaar oud. Het werd bewaard op -29°C voordat het werd gefixeerd in een 10% formol-saline oplossing. Daarna werden de proefstukken geprepareerd voor SEM onderzoek volgens de methode ontwikkeld door McCall (1968). Hierna werd een laagje goud-palladium opgebracht. De onderzochte delen kwamen uit zowel de kop als de kom van het

heupgewricht. De proefstukken werden gehaald uit de belaste delen van het kraakbeen. Van het gedroogde proefstuk werd met fijne tangetjes een doorschijnend dun velletje gepeld. Hierdoor kon men zowel het oppervlak als de direct onderliggende structuren onderzoeken. Dit onderzoek werd gedaan op een Cambridge Stereoscan IIA electronenmi-croscoop en foto's werden gemaakt op Ilfore FP4 film.

Op het oppervlak van het kraakbeen werden ribbels waargenomen. De afstand hiertussen varieerde nogal en was afhankelijk van proefstuk en locatie hierop. De afstanden varieerden tussen 1 en 100 micro-meter, dus is het niet aannemelijk dat de ribbels veroorzaakt worden door onderliggende vezelbundels. De ribbels kwamen meestal voor in de

buurt van randen of scheuren in het proefstuk. Ze 1iepen a1tijd evenwijdig aan deze randen. Ver verwijderd van deze randen kwamen de ribbe1s bijna niet voor. Hier werd het opperv1ak gekenmerkt door putjes. Deze kwamen soms ook voor op de ribbe1s. Bij grotere verster-king werd duide1ijk dat de putjes de vorm hadden van een acht (zie fig. 7).

Fig. 7

Zoa1s in figuur 8 te zien is hebben de putjes een diameter die va-rieert tussen 15 en 30 micrometer. De geschatte diepte is tussen 1 en 6 micrometer.

Op het b1ootge1egde opperv1ak was een fijn verdee1d veze1netwerk te zien. Dit had geen bepaa1de ori~ntatie (zie fig. 10+9). De gemidde1de diameter van de veze1s was 200 nm. Ho1tes met een diameter van 10 tot 40 micrometer werden ook waargenomen in het b1ootge1egde opperv1ak. Deze ho1tes waren ondiep en evenwijdig aan het opperv1ak. Soms werd onder in deze ho1tes verschrompe1d materiaa1 gezien wat afkomstig kan zijn van chondrocyten. De ho1tes kwamen vaak voor in paren en ver-toonden dus overeenkomsten met de achtvormige putjes op het opper-v1ak.

De onderkant van het afgepe1de ve11etje zag er hetze1fde uit a1s het b1ootge1egde opperv1ak. Ook hier waren ho1tes en een fijnmazig veze1-netwerk zichtbaar.

Fig. 8

Uit deze studie b1ijkt dus dat de putjes op het opperv1ak veroorzaakt werden door onder1iggende ho1tes. Grotere opperv1akteonrege1matighe-den van 200 tot 400 micrometer zoa1s beschreven door Gardner en Woodward (1969) werden niet gevonden. Het afgepe1de ve11etje bestaat uit een veze1netwerk zonder duide1ijke ori~ntatie. Ribbe1s komen a1tijd in de buurt en evenwijdig aan randen voor. In dwarsdoorsneden hiervan zijn nooit grote veze1bunde1s waargenomen. Hieruit kan gecon-cludeerd worden dat deze ribbe1s artefacten zijn. Ze kunnen bijvoor-bee1d ontstaan tijdens het iso1eren van het proefstuk of door krimpen tijdens het drogen.

Tijdens ruwheidsmetingen werd gevonden dat de oppervlaktestructuur gekarakteriseerd werd door een periodiciteit van 25 micrometer en een afstand van piek tot dal van 2,5 micrometer (fig. 9) [lit. 1]. Deze onderzoekers trachtten dit te verklaren met behu1p van onder het opperv1ak liggende vezelbundels. Maar uit de hier besproken studie b1ijkt dat het aannemelijk is dat deze structuur veroorzaakt wordt door holtes onder het kraakbeenoppervlak.

Fig. 9 ~

IN""

1-1~'" d"", :UIIffl : . . '. .' ' . '. . ,~A.·~,i';N~·~· ~.~","YJ\

1SA

In'l.al lacuna oUlliM

De vraag is nu of de putjes ook in vivo voorkomen. Door de preparatie van het proefstuk is het goed mogelijk dat hierbij het bovenste

ve11etje in de onder1iggende holte wordt gezogen. Gardner en Woodward (1970) hebben deze putjes echter aangetoond in verse proefstukken slechts enkele minuten na de dood. Dit betekent dat, indien na de dood geen p10tselinge veranderingen optreden, deze putjes ook in vivo bestaan.

4.2 The morphology of the surface of articular cartilage in adult rats

Het doel van dit onderzoek was bewijzen dat het opperv1ak van ge-wrichtskraakbeen glad is. Dit zou de bevestiging van eerdere onder-zoeken in vivo moeten zijn. De thio-carbohydrazine (TCH) methode beschreven door Malick en Wilson (1975), werd gebruikt om het kraak-been te prepareren. Tegelijk werden ook andere preparatiemethoden toegepast om de vee1zijdigheid en de doelmatigheid van de TCH methode te beoordelen.

Er werden 7 groepen proefstukken onderzocht die een verschil1ende preparatiemethode ondergaan hadden. De proefstukken waren afkomstig van de kniegewrichten van 3,5 tot 5 maanden oude Wistar ratten. Zodra

het gewricht geopend was begon men continu te spoelen met een normale fysiologische zoutoplossing. De proefstukken bestonden uit een deel van het dijbeen met daarop de gewrichtsknobbel.

Van de 7 groepen werden aIleen groepen 6 en 7 v66r preparatie bloot-gesteld aan atmosferische omstandigheden.

De groepen 1 tIm 3 werden geprepareerd zoals hieronder beschreven. Eerst werden de proefstukken gedurende 72 tot 96 uur gedompeld in een oplossing van 2,5% glutaraldehyde in een 0,1 M cacodylate buffer (pH 7,4). Daarna werden ze gefixeerd in een 2% osmiumtetroxide-oplossing in dubbel gedistilleerd water gedurende 1,5 tot 2 uur. Hierna werden ze 6 keer gewassen in dubbel gedistilleerd water voordat ze werden behandeld zoals verderop beschreven.

GROEP 1:

De proefstukken werden gespoeld in ethanoloplossingen met stijgende concentraties (70-80-90-95-100%), en daarna gedroogd volgens de CPD methode.

GROEP 2:

Hiervoor werd gebruik gemaakt van de aangepaste TCH techniek van Malick en Wilson (1975). De proefstukken werden geplaatst in vers gefilterd 1% TCH (Eastman Kodak) oplossing gedurende 15 tot 20 minu-ten. Dan 6 maal gewassen in dubbel gedistilleerd water en geplaatst in een 1% osmiumtetroxide-oplossing gedurende 1,5 tot 2 uur. Weer 6 maal wassen in dubbel gedistilleerd water en weer geplaatst in 1% TCH geduren 15 tot 20 minuten. Dan worden de proefstukken voor de 1aatste keer 6 maal gewassen in dubbel gedistil1eerd water en verder behan-deld zoals groep 1 om het water te verwijderen en te drogen.

GROEP 3:

Deze proefstukken werden behandeld zoals in groep 2 met a1s enige uitzondering dat de behandeling met 1% TCH werd vervangen door een osmiumtetroxide-oplossing.

GROEP 4:

De preparatiestappen waarbij glutaraldehyde en osmiumtetroxide-oplos-singen werden gebruikt werden bij deze groep weggelaten. De ongepre-pareerde proefstukken werden juist boven het niveau van een katoenen prop, gedrenkt in 2% osmiumtetroxide-oplossing in dubbel gedisti1-leerd water, geplaatst. Het gehee1 zat in een ges10ten vat op kamer-temperatuur. Nadat het proefstuk 2 uur in de osmiumtetroxide-damp had gehangen werd het behandeld volgens de TCH methode beschreven bij groep 2. Hierna werd het gedroogd met behu1p van CPD.

De proefstukken geprepareerd zoa1s groep 2 werden met goud gecoat in een Dynavac CS 300 vacuum coating machine.

De proefstukken uit de groepen 6 en 7 werden voor preparatie geduren-de 1,5 uur blootgeste1d aan atmosferische omstandighegeduren-den. Bepaa1geduren-de opperv1aktestructuren zoa1s depressies, go1ven en ribbels zijn vaak waargenomen na zo'n behandeling. Hierna werden de proefstukken behan-de1d zoa1s hieronder beschreven.

GROEP 6:

Deze proefstukken werden precies zo behandeld als groep 2. Dus fixa-tie in glutaraldehyde en osmiumtetroxide-oplossingen gevolgd door de TCH methode en CPD.

GROEP 7:

Deze proefstukken werden behandeld zoals groep 4. Dus eerst prepara-tie in osmiumtetroxide-damp voordat de TCH techniek en CPD toegepast werden.

Binnen 10 dagen na CPD werden de gewrichtsknobbe1s van het stuk bot gehaa1d en bekeken met een Philips SEM 501 op 12 kV en 25 kV. Foto's werden genomen op I1ford FP4 film.

Bij proefstukken uit groep 1 werden oppervlakteonregelmatigheden gevonden die in hun grootste doorsnede 8 tot 15 micrometer waren

(3000/mm02). Het oppervlak zag eruit a1s een golfbal (fig. 10). Het werd ook bedekt door kleine witte dee1tjes die echter niet uniform in grootte en verde1ing waren.

Proefstukken uit groep 2 hadden een glad opperv1ak met daarop 1ichte en donkere gebieden (2500 1ichte gebieden per mm02). Alleen bij beschadigingen werd een ruw oppervlak waargenomen (fig. 11). Bij behandeling zoa1s groep 3 was het opperv1ak glad met daarop

random verdee1de witte dee1tjes. Deze 1eken op de v1ekken van groep 2 maar waren niet duide1ijk genoeg om geteld te kunnen worden (zie

Fig. 10

.

". ...9\';

"

.-

,~, '

f' ~

~"'""

Surface irregularities(Sf)showing figure-of-eight configuration. These measurex~151'min their largest diameter. From Group I.

Fig.

r

_R'

I

To

~;n":

... ;..""''''::~''''-Lr''/:L..l '1~., +,.,~~j,~

General smoothness of the articular surface in lhe uppcr 2/5 of the illustration contrasts

11with a coincidental surgical lesion which extends from the abrasions (A) in the upper edge

(E)tu a lower edge in whidl some parallel ridges(R)can he seen. Some ehondrocytes(C)are evident in the subjacent matrix(M). From Group 2.

Ook het oppervlak van proefstukken uit groep 4 was glad. Hier werd echter een onregelmatige verdeling van lichte en donkere vlekken gezien. De lichte vlekken hadden een diameter van 8 tot 15 micrometer

(3500/mmt2) (zie figuur 13).

Proefstukken uit groep 5 waren wederom glad. Bij sterkere vergrotin-gen werd de structuur van het oppervlak zichtbaar. Duidelijk was te zien dat oppervlakteonregelmatigheden zoals waargenomen bij groep 1 niet voorkwamen (zie figuur 14).

Fig. 12

Fig. 13 (LM) arc reasonahly well defined. Thc labelGcncral smoothncss of thc surface with distinct moll ling clfce!. Lightly mottled areas(SF)has the same meaning as in the previous legends. From Group 4.

Fig. 14

~.IiJt:.o\!.

_ .

Arlicular surface smoothness and a 'woven texture' arc both evident. From Group 5.

Proefstukken uit groep 6 hadden over het a1gemeen ook een glad opper-v1ak maar er kwamen ook wi11ekeurig verdee1de fijne rimpe1s (0,95 tot 1 micrometer) voor. Grotere opperv1akteonrege1matigheden werden hier niet waargenomen (zie figuur 15).

In groep 7 kwamen deze1fde onrege1matigheden voor a1s in groep 1. Bij sterkere vergrotingen werden ook nog 1ichte golvingen en rimpe1s (0,5 tot 1 micrometer) waargenomen (zie figuur 16).

Fig.

16

In addition to the features described in Fig. 10, 'wrinkles'(W)ami surface irregularilies

(S/),there is an impression of gentle undulation of the surface. Fmm Gmup 7.

Samenvattend kan gezegd worden dat de grote opperv1akteonrege1matig-heden, indien ze voorkwamen, ongeveer 8 tot 15 micrometer groot waren. Ze kwamen qua afmetingen goed overeen met de 1ichte gebieden op in TCH en osmiurndamp geprepareerde proefstukken.

Wat we niet mogen vergeten is dat de proefstukken kwamen uit normaa1 be1aste de1en van het gewricht en geobserveerd werden in onbe1aste toestand.

Voordat deze pub1ikatie verscheen was er in nog geen enke1 SEM onder-zoek aangetoond dat gewrichtskraakbeen glad is. Terwij1 onderonder-zoekers

die gebruik maakten van de TEM keer op keer vonden dat gewrichts-kraakbeen een glad opperv1ak heeft.

Kraakbeen behande1d zoa1s de groepen 2, 3, 4 en 5 1aat een glad opperv1ak zien. Proefstukken uit groep 1 of 7 1aten juist het tegen-overgeste1de zien. De opperv1akteonrege1matigheden (8 tot 15 micro-meter) die hierop voorkomen 1ijken sterk op die beschreven in voor-gaande SEM onderzoeken. A1s we de resu1taten van groep 1 verge1ijken met die van de groepen 2, 3, 4 en 5 dan wordt duide1ijk dat CPD van onvo1doende geprepareerd weefse1 opperv1akteonrege1matigheden veroor-zaakt. De resu1taten van groep 6 waren erg verbazend. Men was ervan overtuigd dat kraakbeen wat gedurende 1,5 uur aan atmosferische omstandigheden had b100tgestaan zeker opperv1akteonrege1matigheden zou vertonen. Dit kan verk1aard worden door het feit dat het proef-stuk na b1ootste11en aan 1ucht behande1d werd met een water bevat-tende op1ossing. Het kan nu zo zijn dat het water eerder het weefse1 bereikt dan het fixatiemidde1. A1s het proces van uitdrogen en

rimpe-len omkeerbaar is, dan is het moge1ijk dat de oude (gladde) toestand a1 weer is teruggekeerd voordat het fixatiemidde1 zijn werk kan doen. Om dit te testen werd materiaa1 beproefd zoa1s beschreven bij groep 7. Het fixatiemidde1 werd hier in dampvorm het proefstuk ingebracht. Hierbij kan er geen water meer bij het weefse1 komen voordat het fixatiemidde1 zijn werk doet. Het proefstuk vertoonde nu we1 opper-v1akteonrege1matigheden. De hypothese dat de artefacten veroorzaakt werden door de osmiumdampen wordt tegengesproken door de resu1taten van groep 4.

4.3 Die U1trastruktur von Ge1enkknorpe1oberf1aechen und ihre funktione11e

Bedeutung

Tijdens dit onderzoek heeft men zich drie dingen afgevraagd.

In hoeverre wordt het norma1e gewrichtskraakbeenopperv1ak belnv10ed door droogmethoden zoa1s CPD, 1ucht- of vriesdrogen? Hoe ziet het kraakbeenopperv1ak eruit in norma1e onbe1aste toestand en, ten derde, hoe ziet het eruit in be1aste toestand?

A1s proefmateriaa1 werden stukken kraakbeen uit het be1aste dee1 van het kniegewricht gehaa1d. Per proefdier werden 3 proefstukken geno-men. Er werden proefstukken genomen van 3 verschi11ende soorten dieren. De eerste groep bestond uit 30 zwartkopschapen (15 tot 18 maanden), de tweede groep bestond uit 35 konijnen en de derde groep bestond uit 16 mensen van verschi11ende 1eeftijden.

De proefstukken werden a1s vo1gt geprepareerd. Eerst werden ze gron-dig met een cacodylate buffer (pH 7,2-7,4) gespoe1d. Daarna werden ze

24 tot 48 uur lang in een aldehydemengsel gefixeerd. Het water werd verwijderd door te spoelen met acetonoplossingen van oplopende con-centratie (25, 50, 75, 85, 95 en 100%). Van de drie proefstukken per dier werd er ~~n gedroogd door middel van CPD, een ander werd droog-gevroren en het derde werd aan lucht gedroogd. Hierna werd er een laagje goud op de proefstukken gedampt en werden ze in een ETEC SEM onderzocht.

Na luchtdroging ziet het kraakbeenoppervlak er steeds oneffen uit. In de buurt van randen zijn lineaire verhogingen en verzakkingen te zien. Loodrecht op deze ribbels heeft het kraakbeen een vezelachtige structuur die zichtbaar wordt bij sterkere vergrotingen (zie figuur 17). In het meer centrale deel van het proefstuk heeft het kraakbeen een structuur van bulten en putten (zie figuur 18).

Fig. 17 a

Die normale GelenkknoJ'peloIJpJ'niif'he n;\('h Lufttrocknung in n"ullHlhen Probellbezirken: a) Es kommen zllhlreirhe Fun'henVOl'.

b) Bei stark"J'f'r Vergr'of3erung zf'igen (Iiese FUl'('hen fasel'>lJ'tige Stt'llktur,," in ra,liiirer V"rlaufs-riehtung.

Fig. 18

a

b Die normale Gelenkkllorpeloberfliiche nach Lufttrocknung in zentralen Probenar»"lell: a) Es sind ~iv...allunt<·rschi...de in Form schwach ausgebildeter "lulden llnd Kuppen zu sehen. b) Bei die.er Probe treten ,lie Klippen llnd Mulden deutlich herVOI""

Na vriesdrogen kornen rege1rnatig scheuren en rirnpe1s op het opperv1ak voor. In de gebieden buiten deze artefacten kornen grove bobbe1s en rimpe1s voor (zie figuur 19).

Na CPD zijn er geen hoogteverschi11en te zien op het kraakbeenopper-v1ak (zie figuur 20).

b

Fig.

s)

b)

19 Die normale Gelenkknorpeloberflache nach Gefriertrocknung:

Dureh die Trocknung hervorgerufene Risse llnd Einziehungen auf der Oberflache.

Fig. 20

Die nOl'male Gelenkknol'pelobe"fiaehe nach Kritischer-Punkt- Trocknung weist keine l:nebenheiten in Form von Furchen, )Iultlen ofl",' Kuppen auf.

Uit de vorige paragraaf bleek dat de oppervlaktestructuur sterk afhankelijk is van de preparatiemethode. CPD leverde de minste arte-facten. Daarom worden proefstukken die bewerkt zijn volgens deze methode gebruikt om het normale oppervlaktepatroon te beoordelen. Op SEM foto's waren geen structuren in de vorm van ribbels, voren, putten of bulten zichtbaar. Bij sterkere vergrotingen werden korre-lige microstructuren waargenomen. Deze bevinden zich op fijne fibril-len of omgeven deze (zie figuur 20).

Op TEM foto's, zoals te zien is in figuur Sb, was te zien dat colla-geenvezels, die in willekeurige richtingen lopen, tot aan het opper-vlak reiken. Ze grenzen echter niet vrij aan de gewrichtsspleet. Ze

zijn bedekt met een electronendicht materiaal. Dit materiaal vormde echter geen continue laag maar was op vele plaatsen onderbroken.

Bij proefstukken die kwamen uit een gewricht dat gedurende korte tijd onbelast was, kon men een herverdeling van de korrelige microstructu-ren waarnemen. Ze bedekten de aan het oppervlak liggende collageen-vezels niet helemaal meer en waren in sommige gebieden helemaal niet meer aanwezig (zie figuur 22).

Fig. 21 Charaktp ..istika der normalen Gelenkknorpplobprflad1P:

a) RasterelektrOllt'lllllikroskopisch sind zahll'pi"hp grallulart> :\lik,'ostrukturpn zu beoba('hten, die teils auf feinpn fibrilliit'pn Gebilden aneinandp,'gpl'piht sind, tpils dipsp umgeben.

b) Transmissionilt'lt>ktl"OllPnmikroskopis"h istZIlspht>n, daB die obp,'l1a"hli"hen kollagenPll Fibril· lenallvielen Stellen VOllelektronetHliehtem~latt>rialilbt' ..lagert sind.

Fig. 22

Fig. 23

OJ .. G..lpnkknOI'pplobprtliiphe eine, kllrzfristig immobilisierten lind entlasteten Gelellk. zp;gt pine l"mvPl'teilllng .Iel' granllliiren Mikl'ostl'uktul'en.

a) Bei einel' mehrwiiehigpn Elltlastung des Gplenks ist auf ,1,,1' Knol'p"lobel'tlaehe ein diehtes geol'dn"tes NetzwE'rk kolhtgener Fibl'illen sichtbal', die gt'anularen ~likrostl'lIktul'enfeWen. b) Vel'gleichendes trunsmissioll8elektronenmikroskopischt's Bild ,let' lintel' 7 a gPL"igten

Als het gewricht meerdere weken achtereen onbelast was geweest waren de microstructuren zelfs helemaal verdwenen. Een dicht netwerk van collageenvezels was nu zichtbaar geworden. Ook op TEM foto's was de electronendichte laag helemaal verdwenen (zie figuur 23).

Nadat het gewricht weer voorzichtig terug in de oude belaste toestand was gebracht keerden de microstructuren ook weer terug. Werd het gewricht na een tijdelijke onbelaste toestand plotseling of zwaarder dan normaal belast, dan werd het vrij aan de gewrichtsspleet grenzen-de vezelnetwerk beschadigd. In het netwerk wergrenzen-den dan holtes en gescheurde vezels zichtbaar (zie figuur 24).

Fig. 24

Hiihl"nbilclungpn unci F"ser"bb,'ii<'h", einpr ges"hiicligten KnorpploberOiiche.

Na luchtdroging werden altijd onregelmatigheden gezien. Bij de randen van de proefstukken waren het voren en ribbels. In de meer centrale delen waren het bobbels en putten. Vele onderzoekers houden dit voor de normale structuur. De ribbels en voren probeerde men te verklaren met vezelbundels onder het oppervlak. In deze studie werd aangetoond dat deze structuur een gevolg was van de manier van prepareren. De bulten en putten werden door andere onderzoekers verklaard met behulp van onderliggende chondrocyten en hun celhoven. Maar dat ook dit artefacten zouden kunnen zijn werd plausibel gemaakt in deze studie. Omdat de celhoven waterrijker zijn dan de rest van de matrix hebben hier de oppervlaktespanningen van de verdampende vloeistoffen een grotere invloed.

Bij CPD treden deze oppervlaktespanningen niet op omdat er dan steeds evenwicht is tussen de gas sen onder druk en de vloeistoffen. Hier treden bovengenoemde artefacten dan ook niet op.

De artefactvorming bij vriesdrogen werd in deze studie verklaard door de verwoestende kracht van de ijskristallen. Omdat kraakbeen nogal waterrijk is heeft dit grote invloed op de structuur.

CPD werd gevonden als de artefact-armste droogmethode. Bij optimale droging werd het gewrichtskraakbeenoppervlak niet als geheel glad waargenomen. Maar de grote oneffenheden zoals door andere onderzoe-kers beschreven werden zeker niet waargenomen. Karakteristiek voor de oppervlaktestructuur waren veel meer de korrelige microstructuren. Mogelijk zijn deze in vivo nog fijner verdeeld dan waargenomen omdat

ten tijde van de waarnemingen het kraakbeen al een tijdje onbelast was.

In deze studie werden 3 mogelijke biochemische structuren van de korrels aangedragen. Ten eerste kunnen ze bestaan uit proteoglycanen die in de chondrocyten gemaakt worden. Ook kunnen ze bestaan uit onderdelen van de synoviaalvloeistof (bijvoorbeeld geagregeerd hy-aluronprote1ne). Ten derde kunnen ze bestaan uit een verbinding tussen substanties uit het kraakbeen en de synoviaalvloeistof.

4.4 A transmission electron microscopic comparison of the articular

surface of cartilage processed attached to bone and detached from bone

Proefstukken van gewrichtskraakbeen kunnen in verschillende vormen ge1soleerd worden. Je kunt alleen een stukje kraakbeen wegnemen of je kunt een stukje kraakbeen ondersteund door een stukje bot wegnemen. In deze studie werden beide manieren vergeleken.

Voor de experimenten werden 6 witte konijnen van 5 tot 6 maanden oud gebruikt. Deze dieren zijn al geslachtsrijp maar de calcificatiezone heeft zich nog niet volledig ontwikkeld.

Na het openen van het gewricht werd dit gereinigd met fysiologisch zout. Hierna werd er een elliptisch plakje van het kniegewricht geschaafd. De afmetingen hiervan waren ongeveer 4 bij 6 mm, de dikte was zo dat ze de calcificatiezone net niet raakten. Proefstukken van deze vorm werden groep A genoemd. Van de andere knie van het proef-dier werd een proefstuk voor groep B ge1so1eerd. Het gewricht werd geopend en een stuk bot met daarop het kraakbeen van ongeveer 1,5 cm werd weggehaald. Het kraakbeen werd constant nat gehouden met fysio-logisch zout.

Bij de helft van de konijnen werd het in deze volgorde gedaan, bij de andere helft werd eerst het stuk bot met kraakbeen en daarna het plakje kraakbeen gelsoleerd.

De plakjes werden direct in 2% glutaraldehyde in 0,1 M cacodylatebuf-fer (pH 7,3) gelegd. Na een uur werden ze weer een uur lang in een oplossing van 2% osmium tetroxide in 0,,1 M cacodylatebuffer gelegd. Dan werd het water verwijderd door ze in alcoholoplossingen van oplopende concentratie te leggen. Daarna werden ze schoongemaakt met propyleenoxide en doordrenkt met een mengsel van propyleenoxide met Epon. Tijdens de laatste behandelingwerden 2 of 3 strippen van 1 rom breed uit de plakjes gesneden. Deze werden ingebed in Epon. Van deze blokjes werden dunne plakjes gesneden die gekleurd werden met tolui-dine blauw. Deze werden met de lichtmicroscoop bekeken. Van hetzelfde blokje werden nu met een diamanten mesje ultradunne plakjes gesneden die gekleurd werden met uraniumacetaat en loodcitraat. Dan werden ze

onderzocht met een Zeiss EM-9S electr~nenmicroscoop.

De stukken bot met daarop het kraakbeen werden in een pot gedaan met 100 ml 2% glutaraldehyde in 0,1 M cacadylatebuffer (pH 7,3). Na 2 uur werden stukjes bot met kraakbeen meteen figuurzaag afgezaagd. Hier-bij werd constant een cacodylatebuffer op het kraakbeen gespoten. De stukken kraakbeen waar weinig of geen hot onder zat sneed men nu

eraf. Men hield stukjes over met een dikte vari~rendvan 3 tot 5 rom.

Deze fixeerde men in 2% osmiumtetroxide in 0,1 M cacodylatebuffer. Na 2 uur verwijderdemen het water met alcoholoplossingen van oplopende concentratie gedurende 48 uur. Door de proefstukken 24 uur in propy-leenoxide te spoelen werden ze schoongemaakt. Toen werden ze geduren-de 2 dagen met een mengsel van propyleenoxigeduren-de en Epon doordrenkt. De stukjes bot met kraakbeen werden ingebed in Eponen dan met een figuurzaag in plakjes (1 tot 2 rom) gezaagd. Hier werden nu stukjes kraakbeen met nog 1 tot 2 rom bot eraanafgehaald. Deze werden wederom in Epon ingebed. Dunne plakjes werden gesneden om met behulp van toluidine blauw onder de lichtmicroscoop te bekijken. Ultradunne plakjes werden gesneden en met uraniumacetaat en loodcitraat met een Zeiss Em-9S onderzocht.

LICHTMICROSCOPIE:

De verse proefstukken uit groep A waren aIle min of meer recht. Tijdens de preparatie trokken ze echter aIle krom. Na preparatie hadden de plakjes dus een C- of zelfs een O-vorm.

De proefstukken uit groep B houden hun globale vorm tijdens de pre-paratie (zie figuren 25 en 26).

ELECTRONENMICROSCOPIE:

Bij zowel groep A als groep B kon men een electronendichte oppervlak-telaag waarnemen. Het daaronderliggende oppervlak werd waargenomen als een laag van collageenvezels. Soms bevond de oppervlaktelaag zich ook tussen de collageenvezels. De dikte van de oppervlaktelaag was moeilijk te meten door het wollige uiterlijk en de onduidelijke grenzen tussen de collageenvezels.

Fig. 25

Group A specimen showing marked curling. At this low magnification the surface appears fairly smooth except in one region (between arrowheads) where a slight irregularity is just discernible. The thickness (as measured between the two arrows) of this processed and hence shrunken cartilage shaving (Zones I-III) is about 0'147 mm. x 170.

Fig. 26 \ . ' -~; . ... 1,-- _.. - - "... 41 • ";~ . - :')'*tO:<1!'- !,;~

".~

,

-

....-"- l»,'':''';:; -'J

Group B specimen, at a stage when cartilage was still attached to bone (i.e. prior to the final removal of bone and ultrathin sectioning). Note the smooth convex surface. The thickness as measured between the two arrowheads of this processed and hence shrunken cartilage (Zones I-IV) is about O· 332 mm. x 170.

-Op plaatsen waar de laag behoorlijk compact en duidelijk begrensd was, kon men diktes meten van 0,03 tot 0,1 micrometer. De diepst gemeten doordringing van de oppervlaktelaag tussen de collageenvezels was 1 micrometer.

In groep A was de oppervlaktelaag vaak beschadigd en gebroken. Op sommige plaatsen was de laag geheel afwezig terwijl op andere plaat-sen de laag opgehoopt was tot een bergje (zie figuren 27 en 28).

Fig. 27 Group A specimen showing an irregular surface covered by a shaggy, broken (arrow-head) surface coat. A depression (arrow) about 0·4I'mdeep is present. x 25000.