Pigment - en chlorophylbepaling in oppervlaktewater

NN31545 , 0 8 8 5 f O TA 88 5 no ve mbe r 1 97 5 Instituut voor Cultuurtechniek en Waterhuishouding

Wageningen

P I G M E N T - EN CHLOROPHYLBEPALING IN O P P E R V L A K T E W A T E R

J. H a r m s e n

N o t a ' s van het Instituut zijn in p r i n c i p e i n t e r n e c o m m u n i c a t i e m i d d e -l e n , dus geen officië-le p u b -l i k a t i e s .

Hun inhoud v a r i e e r t s t e r k en kan zowel b e t r e k k i n g hebben op een eenvoudige w e e r g a v e van c i j f e r r e e k s e n , a l s op een c o n c l u d e r e n d e d i s c u s s i e van o n d e r z o e k s r e s u l t a t e n . In de m e e s t e gevallen zullen de c o n c l u s i e s e c h t e r van voorlopige a a r d zijn omdat het o n d e r z o e k nog niet is afgesloten.

Bepaalde n o t a ' s komen niet voor v e r s p r e i d i n g buiten het Instituut in a a n m e r k i n g

fj . /*J fö / CENTRALE LANDBOUWCATALOGl

' ' i J 5 I 3 J . I||||||||||U

I N H O U D

biz.

1. INLEIDING EN PUNTEN VAN ONDERZOEK i

2. PRINCIPE 1 3 . WERKWIJZE 2 4. BEREKENINGSWIJZE 2 5. RESULTATEN EN DISCUSSIE 4 5 . 1 . Invloed v e r w a r m i n g s t i j d 4 5 . 2 . Phaeophytine 4 5 . 3 . D u p l i c e e r b a a r h e i d en r e p r e d u c e e r b a a r h e i d 7 6. SAMENVATTING EN CONCLUSIE 8 7. LITERATUUR 9

1. INLEIDING EN PUNTEN VAN ONDERZOEK

Het in algen aanwezige pigment b e s t a a t hoofdzakelijk uit c h l o r o -phyl en v e r d e r uit het afbraakprodukt van chloro-phyl, phaeophytine. Het p i g m e n t - en chlorophylgehalte is een m a a t voor de hoeveelheid in het w a t e r zwevende algen.

Deze nota behandelt een methode om het pigment en chlorophyl te bepalen en b e s t e e d t m e t n a m e aandacht aan een aantal a s p e c t e n van de werkwijze en b e r e k e n i n g s w i j z e z o a l s : de invloed van de v e r w a r mingstijd, p i g m e n t c o n c e n t r a t i e en het te gebruiken zuur op de r e s u l -taten en de d u p l i c e e r b a a r h e i d en r e p r o d u c e e r b a a r h e i d van de m e t h o d e .

2. PRINCIPE

De algen aanwezig in het te bepalen o p p e r v l a k t e w a t e r worden af-g e s c h e i d e n door filtratie over een af-g l a s v e z e l f i l t e r . Door v e r w a r m e n van het filter in 80% ethanol gaan de algen kapot en komt het pigment v r i j . Na c e n t r i f u g e r e n w o r d t de extinctie van de v e r k r e g e n oplossing g e m e t e n . Chlorophyl a b s o r b e e r t m a x i m a a l bij 665 nm (fig. 1). Om te c o r r i g e r e n voor a n d e r e gekleurde verbindingen en de t u r b i d i t e i t wordt de extinctie g e m e t e n bij 750 n m en afgetrokken van de e e r s t g e m e t e n e x t i n c t i e . Bij 750 n m a b s o r b e e r t chlorophyl n a u w e l i j k s .

Indien veel phaeophytine aanwezig is m o e t h i e r v o o r g e c o r r i g e e r d w o r d e n , aangezien phaeophytine ook m a x i m a a l a b s o r b e e r t bij 665 n m .

Door aan te z u r e n wordt alle chlorophyl o m g e z e t in phaeophytine. Meting voor en na a a n z u r e n geeft dan de mogelijkheid te c o r r i g e r e n voor de in het w a t e r m o n s t e r aanwezige phaeophytine.

0,350 0,300 0,250 0,200 0,150 0,100 i 0,050 -— 0 a uitgezet o^~~ absorptie Spektra o chlorophyl A phaeophytine

• gemeten extinct e tegen

X in nm spectrofotomer . Spectronic 20 0 ^ " r l . i c / / -i-S

A

E r m o e t een zodanige hoeveelheid m o n s t e r in behandeling w o r -den genomen, dat de extinctie vóór a a n z u r e n komt te liggen t u s s e n 0,1 en 0,7 (100 tot 1000 m l ) . Indien na de m o n s t e r n a m e niet m e t e e n m e t de bepaling kan worden begonnen, dienen de m o n s t e r s bij - 20 C te worden b e w a a r d . Het m o n s t e r wordt onder afzuigen g e f i l t r e e r d over een g l a s v e z e l f i l t e r (Whatman C F / C 0 55 m m ) . Het filter wordt drooggezogen en o v e r g e b r a c h t in een c e n t r i f u g e b u i s j e .

Nadat 10 ml ethanol is b ï j g e p i p e t t e e r d wordt het buisje gedurende 5 minuten onder r o e r e n in een w a t e r b a d van 70 C v e r w a r m d . H i e r n a wordt het afgekoeld in ijs en 1 5 minuten bij 15 000 t o e r e n p e r minuut g e c e n t r i f u g e e r d .

In ca. 5 m l van de h e l d e r e oplossing wordt de extinctie g e m e t e n bij 665 en 750 n m (extinctie r e s p . a en b). Vanaf het v e r w a r m e n moeten de handelingen zo vlot mogelijk a c h t e r e l k a a r g e b e u r e n , d a a r het chlorophyl onder invloed van licht ontleedt.

De oplossing wordt dan a a n g e z u u r d m e t 0,1 m l 4 n zoutzuur, w a a r n a de extinctie direkt wordt g e m e t e n bij 665 en 750 nm (c en d).

4. BEREKENINGSWIJZE

be-r e k e n d volgens (SCHMIDT- VAN DORP): 1 3 , 9 x V x ( a - b) u g/ i ( 1 ) V _o a = extinctie vóór a a n z u r e n bij 665 n m b = " " " " 750 n m V = volume e x t r a c t in m l V = volume m o n s t e r in 1 o

13, 9 = extinctie coëfficiënt voor alcohol e x t r a c t

Indien geen of vrijwel geen phaeophytine aanwezig i s , i s het pig-m e n t g e h a l t e tevens het c h l o r o p h y l g e h a l t e . Dit is het geval als a - b , _ c = extinctie na a a n z u r e n bij 665 n m

c - d d = " " " 750 n m

Als e r wel phaeophytine aanwezig i s , kan het chlorophylgehalte worden b e r e k e n d volgens (GOLTERMAN, 1970):

2 , 4 3 j ( a - b ) - ( c - d ) j x i M x f ug/1 (2)

en het phaeophytinegehalte volgens:

(a - b) - 2.43[(a - b) - (c - d)}l x ^ 1 x -J- u g / l (3) K , 1 = extinctiecoefficiönt chlorophyl = 72 K , = " phaeophytine = 42 K r h l 2 , 4 3 C m Kc h l " Kp h

De extinctiecoefficiënten zijn afhankelijk van het e x t r a c t i e m i d d e l .

ir • ^ i • i - i 1000 - ,

K , , in ethanol is gelijk aan *-> A =72

K h is zodanig dat -r^±± = 1 , 7 (GOLTERMAN, 1970)

F ^ p h

Als de e x t i n c t i e s zijn g e m e t e n kan in fig. 2 d i r e k t de s a m e n -stelling van het pigment w o r d e n afgelezen (GOLTERMAN, 1970).

% Phaeophytin 50 40 10 20 30 40 50 60 % Chlorophyll 70 100 F i g . 2. Relatie t u s s e n s a m e n s t e l l i n g pigment en de e x t i n c t i e s voor en na a a n z u r e n 5. RESULTATEN EN DISCUSSIE 5 . 1 . I n v l o e d v e r w a r m i n g s t i j d

Vijf minuten v e r w a r m e n bij 70 C blijkt voldoende om alle pig-m e n t v r i j te pig-maken (zie fig. 3, blz . 5). Bij l a n g e r v e r w a r pig-m e n wordt de extinctie k l e i n e r door ontleden van de c h l o r o p h y l . De v o l u m e -r e d u k t i e b e d -r a a g t bij 5 minuten v e -r w a -r m e n 1 à 2%.

5 . 2 . P h a e o p h y t i n e

Indien e r phaeophytine aanwezig i s , moet h i e r v o o r w o r d e n g e c o r r i g e e r d bij de b e r e k e n i n g van het chlorophylgehalte d a a r p h a e o -phytine evenals chlorophyl a b s o r b e e r t bij 665 n m . De b e r e k e n i n g van het chlorophylgehalte vindt dan p l a a t s volgens (2). Deze b e r e k e n i n g gaat alleen op, als e r zowel voor als na a a n z u r e n een r e c h t l i j n i g v e r -band b e s t a a t t u s s e n de gemeten extinctie en de hoeveelheid pigment in het m o n s t e r .

.no

2 6 0

-t

0 5 10

F i g . 3 . Invloed v e r w a r m i n g s t i j d op de gemeten extinctie

voor aanzuren • na aanzuren met un HCl na aanzuren met verzadigd oxaalzuur 15 ml monster

F i g . 4. Verband t u s s e n de hoeveelheid m o n s t e r m e t pigment en de extinctie

Bij a a n z u r e n m e t v e r z a d i g d oxaalzuur (SCHMIDT-VAN DORP) is in dit onderzoek geen rechtlijnig verband v e r k r e g e n (fig. 4). Wel is een rechtlijnig verband gevonden bij a a n z u r e n m e t 4 n zoutzuur (fig. 4).

Bij het onderzoek n a a r de r e l a t i e t u s s e n de gemeten extinctie en de hoeveelheid pigment en chlorophyl in. het m o n s t e r is gebruik g e

-m a a k t v a n w a t e r w a a r i n h e t c h l o r o p h y l g e h a l t e v r i j w e l g e l i j k w a s a a n a - b h e t p i g m e n t g e h a l t e , d a a r -r- ^ 1 , 7 ( t a b e l 1 ) . De b e r e k e n i n g v a n h e t c h l o r o p h y l g e h a l t e v o l g e n s (2) g e e f t e e n v e e l g r o t e r e s t a n d a a r d a f w i j -k i n g (S) d a n de b e r e -k e n i n g v a n h e t p i g m e n t g e h a l t e v o l g e n s (1) ( t a b e l 1 ) . Dit w o r d t v e r o o r z a a k t d o o r d a t bij b e r e k e n i n g (2) h e t g e h a l t e op m e e r m e e t g e g e v e n s i s g e b a s e e r d en d a a r d o o r e e n g r o t e r e m e e t f o u t h e e f t . B e r e k e n i n g (1) m o e t in p r i n c i p e g e h a l t e s g e v e n die g e l i j k z i j n a a n of g r o t e r d a n d i e v a n b e r e k e n i n g (2). Dit i s bij m o n s t e r 2 , 5 , 8 en 10 a - b n i e t h e t g e v a l d a a r -r > 1 , 7 . h c - d A l s r ^ 1 , 7 m a a k t h e t w e i n i g u i t of h e t c h l o r o p h y l g e h a l t e b e -r e k e n d w o -r d t v o l g e n s (2) of g e l i j k g e s t e l d w o -r d t a a n h e t p i g m e n t g e h a l t e . De g e h a l t e s l i g g e n i m m e r s b i n n e n e i k a a r s s t a n d a a r d a f w i j k i n g ( t a b e l 1 ) . D a a r de s t a n d a a r d a f w i j k i n g b i j (2) g r o t e r i s d a n die b i j (1) m a g z o l a n g —^—5- = 1. 68 + 0. 0 6 , h e t c h l o r o p h y l g e h a l t e w o r d e n g e l i j k g e s t e l d a a n h e t p i g m e n t g e h a l t e z o n d e r d a t d i t t e n k o s t e g a a t v a n de n a u w k e u r i g h e i d . T a b e l 1. V e r g e l i j k i n g p i g m e n t e n c h l o r o p h y l g e h a l t e s b e r e k e n d v o l -g e n s (1) e n (2) n o . 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 m l m o n s t e r 1 3 5 6 7 9 11 1,5 3 4 , 5 6 7,5 9 1 0 , 5 a - b 0 , 0 6 5 0 , 2 1 4 328 367 487 5 97 689 108 207 3 1 9 4 2 0 520 610 710 c - d 0, 040 0 , 1 2 2 200 221 278 361 427 61 123 186 2 4 9 3 1 4 372 432 c h l o r o p h y l in u g / l v l g . (2) 840 1040 860 820 1010 890 810 1060 950 1 0 0 0 960 940 890 890 g e m . 920 S = 80 p i g m e n t u g / l v l g . 900 990 910 850 97 0 920 870 1000 960 990 970 960 940 940 g e m . 940 S = 45 in (1) g e m . S = a - b c - d 1 , 6 3 1 , 7 5 1 , 6 4 1 , 6 6 1 , 7 5 1 , 6 5 1 , 6 1 1, 77 1 , 6 8 1 , 7 2 1 , 6 9 1 , 6 6 1 , 6 4 1 , 6 4 1, 68 : 0, 06 S = s t a n d a a r d a f w i j k i n g

5 . 3 . D u p l i c c M ' r b a a r l i e i d e n r e p r o d u c e e r b a a r h e i d E e n w a t e r m o n s t e r is v e r d e e l d o v e r 7 f l e s s e n en i n g e v r o r e n . O p v e r s c h i l l e n d e d a g e n is h e t p i g m e n t g e h a l t e b e p a a l d en b e r e k e n d v o l -g e n s (1). De b e p a l i n -g is in d u p l o u i t -g e v o e r d , k o r t n a d a t h e t m o n s t e r o n t d o o i d w a s . Van de m o n s t e r s 2, 3 , 4 en 5 i s t w e e m a a l e e n d u p l o b e p a l i n g u i t g e v o e r d (2^ en 2-, e n z . ). De r e s u l t a t e n zijn w e e r g e g e v e n in t a b e l 2. T a b e l 2. P i g m e n t g e h a l t e in ug in 7 d a g m o n s t e r s M o n s t e r P i g m e n t g e h a l t e G e m i d d e l d p e r m o n s t e r 5 3 , 7 4 7 , 7 2i 5 4 , 3 5 2 , 4 22 5 0 , 0 50, 7 31 4 5 , 9 4 4 , 8 32 4 4 , 9 4 5 , 3 4i 4 9 , 5 5 0 , 6 42 5 0 , 2 4 8 , 5 54 4 9 , 9 4 7 , 1 52 4 9 , 1 4 6 , 4 4 8 , 1 4 6 , 0 4 7 , 0 4 4 , 5 5 0 , 7 5 1 , 9 4 5 , 2 4 9 , 7 4 8 , 1 4 7 , 0 4 5 , 8 G e m . 4 8 , 5 G e m . 4 8 , 3 Sd u p l o = 1»8 S = 2 , 5

De standaardafwijking b e r e k e n d uit de duplo v e r s c h i l l e n was 1, 8 ug of 3,7%. Dit is bepalend voor de d u p l i c e e r b a a r h e i d .

De r e p r o d u c e e r b a a r h e i d van één d a g m o n s t e r is goed, want de duplo's

(2, t. o. v. 2_ enz. ) liggen binnen e i k a a r s standaardafwijking. De r e

p r o d u c e e r b a a r h e i d over alle 7 d a g m o n s t e r s is m i n d e r goed. De s t a n -daardafwijking b e r e k e n d uit de 7 gemiddelde gehaltes was 2, 5 ug of 5 , 1 % . Deze g r o t e r e standaardafwijking wordt niet alleen v e r o o r z a a k t door v e r s c h i l l e n in de a n a l y s e , m a a r ook door v e r s c h i l l e n in m o n s t e r n a m e , m e n g e n , invriezen en ontdooien. Deze l a a t s t e v e r s c h i l l e n z u l -len ook bij nog te nemen m o n s t e r s o p t r e d e n , zodat een standaardaf-wijking van c a . 5% v e r d e r dient te worden aangehouden.

Als het chlorophylgehalte wordt b e r e k e n d volgens (2) is de s t a n d a a r d -afwijking ca. 9% (tabel 1).

De r e s u l t a t e n dienen voorzichtig te worden g e ï n t e r p r e t e e r d , d a a r voor de extinctiecoöfficienten van chlorophyl en phaeophytine in de l i t e r a t u u r v e r s c h i l l e n d e w a a r d e n worden gegeven. De r e s u l t a t e n k u n -nen dus een s y s t e m a t i s c h e afwijking hebben. D a a r de s y s t e m a t i s c h e fout o v e r a l zal o p t r e d e n , mogen de gehaltes wel onderling w o r d e n v e r g e l e k e n .

6. SAMENVATTING EN CONCLUSIE

Het p i g m e n t en chlorophylgehalte is een m a a t voor de h o e v e e l -heid in w a t e r zwevende algen. De hoeveel-heid pigment en chlorophyl k a n na filtratie van de algen en e x t r a c t i e in ethanol c o l o r i m e t r i s c h worden bepaald. Phaeophytine, het afbraakprodukt van chlorophyl, a b s o r b e e r t bij dezelfde golflengte als chlorophyl. Zolang e r n a a r verhouding weinig phaeophytine aanwezig i s , mag het pigmentgehalte gelijk worden g e s t e l d aan het c h l o r o p h y l g e h a l t e . Als dit niet het g e -val i s , is het mogelijk bij de b e r e k e n i n g van het chlorophylgehalte voor de phaeophytine te c o r r i g e r e n . De standaardafwijking voor het pigmentgehalte is ca. 5%. Als e r g e c o r r i g e e r d is voor phaeophytine i s de standaardafwijking voor het chlorophylgehalte ca. 9%.

D a a r bij deze methode niet van een s t a n d a a r d gebruik kan worden gem a a k t , gem o e t rekening worden gehouden gem e t een eventuele s y s t e gem a -t i s c h e afwijking. De gevonden gehal-tes kunnen onderling wel w o r d e n

v e r g e l e k e n a l s van dezelfde extinctiecofifficienten voor chlorophyl en phaeophytine is uitgegaan.

7. LITERATUUR

GOLTERMAN, H. L. , 1970. I. B. P . Handbook no. 8. Methods for c h e m i c a l a n a l y s i s of f r e s h w a t e r , 2 ed.

SCHMIDT-VAN DORP. Analyse voor schrift chlorophylbepaling. H o o g h e e m r a a d s c h a p van Rijnland.