Massaspectrometrische identificatie van twee intermediairen in de afbraakroute van 4-nitrobenzoezuur

(1)

Projectleider: W.A. Traag

Rapport 90.37 Oktober 1990

Massaspectrametrische identificatie van tHee intermediairen in de

afbraakroute van 4-nitrobenzoëzuur

J. A. van Rhijn

In samemverldng met: drs P.E. J. Groene,.,egen, LUH vakgroep levensmidde-lenchemie sectie industriële microbiologie

Goedgekeurd door: ir L. G.H. Th. Tuinst ra

Ri jks-K\val itei tsinsti tuut voor land- en tuinboUivprodukten (RI KILT) Bornsesteeg L1S, 6708 PD Wageningen

Postbus 230, 6700 AE Wageningen Telefoon 08370-75400

Telex 75180 RIKIL Telefax 08370-17717

(2)

Overname van de inhoud is toegestaan mits met duidelijke bronvermel -ding. VERZENDLIJST INTERN: directeur sectorhoofden coördinatoren

afdeling Organische Contaminanten

programmabeheer en informatieverzorging (2x) circulatie

bibliotheek

EXTERN:

Dienst Landbomo1kundig Onderzoek Directie Hetenschap en Technologie

LUH vakgroep levensmiddelenchemie, prof. dr J.A.H. de Bont LU\~ vakgroep levensmiddelenchemie, drs P.E.J. Groene\>legen

(3)

INHOUD

SAMENVATTING

1 INLEIDING

2 HATERIAAL EN HETI-lODEN

3 RESULTATEN EN DISCUSSIE

4 CONCLUSIE

AANHANGSEL

BIJLAGEN

A FIGUREN EN SPECTRA

B REPRODUCEERBAARHElD VAN CID SPECTRA

C HEETRESULTATEN

D FRAGHENTATIEROUTES

blz 3 5 5 7 9

(4)

(5)

-2-SAHENVATTING

In het kader van het onderzoek naar enzymatische afbraakroutes van aromatische nitroverbindingen dat uitgevoerd wordt op de vakgroep in

-dustriële microbiologie van de Landbom/Universiteit te \~ageningen, \<lerd massaspectrametrische identificatie gevraagd van enkele verbin

-dingen, die bij enzymatische afbraak ontstaan. Het betrof de vermoede-lijke produkt en 4-hydroxylamine benzoëzuur ( 4-HABA) en 3, 4-dihydro xy benzoëzuur (3, 4-diHBA).

De componenten werden onderzocht met behulp van direct-eurrent intro

-duc tion (DCI) en ~1S-t-1S. De fragmenten afkomstig van het molecuul ion van de verbindingen \<lerden gemeten na callision induced decomposition

(CID).

De gevraagde verbindingen konden geïdentificeerd Horden in de aangebo

(6)

(7)

-4-1 INLEIDING

Bij de vakgroep industri~le microbiologie van de Landbouwuniversiteit te Hageningen (LUH) Hordt onderzoek verricht naar de enzymatische af -braakroute van aromatische nitroverbindingen. Een voorgestelde af -braakroute voor 4-nitrobenzoëzuur \vordt gegeven in (1 ).

4-,.\1itro-benzo~zuur \vordt daarin afgebroken tot 3, 4-dihydroxy

benzoëzuur via 4-hydroxylamine-benzoëzuur. Het intermediair en het

eindprodukt dienden met behulp van massaspectrametrisch onderzoek te Horden geïdentificeerd.

COOH

__

".

0 OH

(l)

H-1~-0H

OH

4-ni tra 4-HABA 3, 4-dil-IBA benzoëzuur

HH

=

167 153 154

Een HPLC scheiding voor deze component en Has voorhanden bij de LUH evenals het , door de vakgroep gesynthetiseerde 4-HABA en de cammerci -eel verkrijgbare overige stoffen.

2 HATERIAAL EN HETHODEN

De reactieprodukten van de enzymatische afbraak van 4-nitrobenzoëzuur \ve rden met behulp van HPLC gescheiden. De fracties overeenkomend met het elutievolume van de verschillende reactiepraelukten werden uitge -vangen.

In totaal werden 5 fracties uitgevangen en aangeboden ter identi fica -tie van het reactieprodukt.

(8)

-6-Het betrof:

1. HPLC fractie van een standaard 4-HABA

2. HPLC fractie van het reactieprodukt 4-HABA afkomstig uit de afbraak van 4 nitrobenzoëzuur onder invloed van partieel gezuiverd

4-nitrobenzoaatreductase uit pseudomonas species NllA-10.

3. HPLC-fractie van het reactieprodukt 3, 4-dil-ffiA afkomstig uit de

af-braak van 4 nitrobenzoëzuur onder invloed van celvrij exract van

pseudomonas species NllA-10.

4. HPLC fractie van het reactieprodukt 3, 4-diHBA afkomstig uit de

af-braak van 4 -HABA.

5. HPLC fractie van een standaard 3,4-diHBA.

De aangeboden HPLC fracties werden verdund met demilomter tot 10 ml en vervolgens geëxtraheerd met 10 ml ethylacetaat. Na scheiding van de fasen werd zoveel mogelijk ethylacetaat gepipetteerd en in een punt -buisje gebracht. Vervolgens \olerd ingedampt tot 2 ml. De organische laag \olerd gedroogd met ca. 0, 5 g Na

2

so

4 en dit extract werd gebruikt voor de massaspectrametrische bepaling.

Tevens \olerden enkele controlebepalingen uitgevoerd te 111eten: een

ex-tractie van blanco HPLC eluens op dezelfde 111ijze als een monster, ter controle van het achtergrondsignaal en ex tractie van een oplossing van

de verstrekte standaardstoffen in HPLC eluens, ter controle van de

ex-tractie efficiëncy.

De massaspectrametrische bepaling betrof slechts een k111alitatieve

be-paling, derhalve is geen poging tot k\olantificeri ng gedaan.

De massaspectrametrische identificatie 111erd uitgevoerd met behulp van tandem massaspectramet rie na direct current int roduc ti on (DCI). De

component en werden in opgeloste vorm op de DCI pro be gebracht. Na ver-dampen van het oplosmiddel 111erd de probe in de bron van de MS gebracht en de componenten werden gedesorbeerd doordeprobe te ver111armen. Na desarptie werden de componenten geioniseerd met behulp van electron

impact ionisatie (EI). Het moleculair ion van de ven11achte verbinding 111erd met behulp van de eerste quadrupool geselecteerd en in de

botsingskamer gebracht . Na botsing met het Argon gas 1-1erden de ontsta-ne fragmenten gemeten met de t111eede quadrupcol (collision) induced

(9)

Het geregistreerde spectrum afkomstig van het moleculair ion van de standaardstoffen Herd vergeleken met de spectra van de te identifice

-ren component in de aangeboden monsters. Bovendien werd het spectrum vergeleken met referentiespeet ra voor zover beschikbaar, uit de EPA/NIH atlas.

Door toepassing van CID massaspeet romet rie wordt een hoge specifici-teit verkregen, doordat slechts ionen met één massa, overeenkomend met de massa van het moleculair ion, in de botsingskamer \vorden

toegelaten. Daarnaast wordt door CID voldoende structuur informatie verkregen voor identificatie.

De metingen werden uitgevoerd met de Finnigan TSQ-70 massaspectrometer 0 (Finnigan HAT, San Jose, USA). De DCI probe \o~erd veno~armd tot 400 C. De brontemperatuur bedroeg 150°C en de ionisatie vond plaats met

behulp van 70 eV electronen. De quadrupooi massafilters werden op 70°C gehouden.

De druk van het botsingsgas Argon bedroeg 1m Torr en de botsingsener

-gie \o~erd voor 4-HABA ingesteld op -9 eVen voor 3,4-dil-ffiA op -24,5 eV teneinde voldoende structuurinformatie te verkrijgen.

De t\o~eede quadrupcol werd gescand van m/z 50 tot m/z 170 met een snel -heid van 0,5 seconde per scan.

De metingen \o~erden steeds verricht aan ca. 100 ng van de te identifi-ceren stof.

3 RESULTATEN EN DISCUSSIE

Uit enkele oriënterende experimenten bleek, dat de extracten van HPLC fracties teveel storingen bevat ten om DCI-NS te kunnen toepassen. Daarom \•Terd gekozen voor de toepasing van CID massaspectrometrie met DCI introductie.

De extracten van fracties 1, 2 en 4 werden onderzocht op de aamo~ezig

heid van 4-HABA. De ex traeten van fracties 3, 4 en 5 \•le rden onderzocht

op de aanwezigheid van 3, 4-dil-ffiA.

De blanco extracten en de gebruikte ethylacetaat \olerden op beide ver-bindingen onderzocht. De extracten ter controle van de extractie effi-ciency \o~erden alleen op de betreffende verbinding onderzocht.

(10)

-8

-Standaarden van beide verbindingen in ethylacetaat '"erden in vijfvoud geanalyseerd.

Spectra en RIC graphs zijn gegeven in bijlage 1. Tevens bevat bijlage 1 de spectra en RIC graphs van de blanco's.

Bijlage 2 bevat de resultaten van de reproduceerbaarheidsstudie voor

de CID-speet ra.

De resultaten van de metingen in de HPLC fracties zijn weergegeven in

bijlage 3.

Bijlage 4 bevat de fragmentatie schema's. Het valt op, dat de

fragmentatie die met CID verkregen '"ordt, in grote lijnen overeen komt

met de fragmentatie die met EI verkregen wordt, echt er veel minder

reproduceerbaar is.

In fractie 1 en 2 '"erd 4-HABA aangetoond.

In fractie 3, 4 en 5 werd 3,4-diHBA aangetoond. De blanco's geven aan, dat er geen storingen vanuit de gebruikte oplosmiddelen optreden. De extractie efficiency experimenten bevestigen een goede extraheer

-baarbeid van de component en met ethylacetaat .

Uit bijlage 2 blijkt een relatief grote spreiding in de gemeten

inten-siteiten. Er kan dan ook niet voldaan \Wrden aan de EG kriteria ten aanzien van de spreiding in intensiteit, die bij ge\-7one HID meting getolereerd Hordt. De gebruikte techniek, CID tandem massaspectrome-trie leidt onvermijdelijk tot grote spreiding in de gemeten intensi

-teiten omdat de gasdruk in de botsingskaroer niet erg constant gehouden

kan worden, tendjl de invloed van de gasdruk op de mate van fragmen-tatie niet gering is. CID~1S is echter zeer specifiek, doordat alleen het geselecteerde moleculair ion in de botsingskaroer '"ordt toegelaten. Alle gemeten ionen zijn dus fragmenten, die na botsing uit dit

moleculair ion ontstaan. Daarom kan een grotere spreiding in

intensiteit geaccepteerd \•lorden voor identificatie.

De belangrijkste fragmenten kunnen verklaard worden uit een

fragmenta-tie schema. Ion m/z 92 (C

6H6N) ontstaat blijkens parent tandem

massaspectramet rie grotendeels uit een ion met m/z =120, welke niet

(11)

4 CONCLUSIE

Ondanks de grote spreiding in de gemeten intensiteiten kan door de grote specificiteit van CID tandem massaspectramet rie geconcludeerd '"orden, dat 4-hydroxylamine benzoëzuur ( 4-HABA) als zodanig

geïdenti-ficeerd \olürdt in de aangeboden monsters 1 en 2.

3, 4, -Dihydro xybenzoëzuur ( 3, 4-diHBA) \vord t als zodanig geïdentificeerd in de aangeboden monsters 3, 4 en S.

De gevolgde analyseprocedure levert geen blanco bijdrage tot het geme

-ten signaal. Tevens is de extractie efficiency van beide verbindingen met ethylacetaat beHezen.

(12)

Aanhangsel

Naar aanleiding van een nagekomen vraag \verden fracties 2 en 3 tevens onderzocht op de aamvezig heid van 4-ni t r.osobenzoëzuur ( 4-t~SBA).

4-Nitrosobenzoëzuur zou misschien venvacht kunnen worden als interme-diair in de omzetting van 4-nitrobenzoëzuur tot 4-hydroxylamine benzoëzuur.

Fracties 2 en 3 \verden gekozen op grond van het feit, dat het hier HPLC-fracties betrof afkomstig van de afbraak van nitrobenzoëzuur. Hanneer. 4-NSBA gevormd Hordt als intermediair. in de afbraak van nitro

-benzoëzuur tot 4-hyc\roxylamine benzoëzuur, kan deze verbinding in dit extract verwacht \vorden. Hellicht kan 4-NSBA dan ook in één van de HPLC fracties Horden aangetoond.

COOH

0

- -1>

Q

H

(2)

HO

₂

NO

OH

4-ni t ro 4-ni t ro so- 3, 4-dilillA

benzoëzuur benzoëzuur

NH

=

167 MH

=

153 H\~

₌

154

Van de betreffende stof 4-nitrosobenzoëzuur was geen standaard voor-handen. \vel \vas het referentiespectrum bekend van 2-nitrosobenzoëzuur (2-NSBA) en van nitrosobenzeen (NSB).

Uit beide spectra kon afgelezen \VOrden, dat verlies van NO (30) een belangrijke fragmentatie is, tevens bleek uit het spectrum van 2-NSBA geen verlies van OH (1 7) of COOH (45).

Voor de onbekende 4-NSBA \ve rd op grond van deze gegevens eveneens ver-lies van t\TQ venvacht, tenvij 1 geen verlies van OH of COOH verwacht

(13)

Fractie 2 en 3 Herden evenals de standaard 4-HABA onderzocht op de aamo1ezigheid van 4-NSBA. Daartoe Herd het moleculair ion van de

ver-\olachte verbinding (m/z

1

51 )

geselecteerd en in de botsingskamer toege-laten. De botsingsenergie Herdingesteld op -4 eVen de fragmenten af -komstig van het moleculair ion \olerden gemeten door de t\oleede quadru-pooi te scannen tussen m/z 50 en rn/z 170 met een snelheid van O, 5 se -conde per scan.

Uit de resultaten van de metingen blijkt, dat in ieder geval in ZO\vel de standaard 4-HABA als in fractie 2 een component \.;rordt aanget raffen,

die een ion met m/z

151

geeft en tevens verlies van NO

(30)

ui t dat

ion geeft

(151

----

-

>

121).

In fractie 3 Hordt een dergelijke verbinding niet gevonden.

Deze resultaten kunnen niet gehanteerd \olorden als be\'lijs voor de aan -\vezigheid van 4-NSBA. Er is ten hoogste sprake van de aamo1ijzing, dat mogelijken-lijs een dergelijke verbinding aamo1ezig is. Nader onderzoek

is zeker noodzakelijk.

Wanneer be\vezen moet \olorden, dat 4-NSBA aamo1ezig is, zal ten eerste

een standaard beschikbaar moeten zijn. Ten t\oleede zal dan naar 4-NSBA

gezocht moeten Horden i n de HPLC fractie, die overeenkomt met het elu

-ti e volume van deze verbinding ofHel in een ex tra ct, Haarin 4-NSBA

venmcht \vordt en waarop geen HPLC scheiding \VOrdt toegepast, zodat al le intermediairen, uitgangs- en eindprodokten hierin aam-1ezig zijn. Overigens zal het bijzonder moeilijk, zo niet onmogelijk zijn om op

massaspectrametrische \olijze onderscheid te maken tussen 2-NSBA, 3-NSBA

en l1-NSBA.

(14)

fig. la lb fig. 2a 2b fig. 3a 3b fig. 4a 4b fig. 5 fig. 6 fig. la 7b BIJLAGE A

standaard 4-hydroxylaruine benzoëzuur, RIC

standaard 4-hydroxylamine benzoëzuur, CID spectrum van parent ion m/z 153

standaard 3,4-hydroxy benzoëzuur, RIC

standaard 3, 4-hydroxy benzoëzuur, CID spectrum van parent ion m/z 154

geëxtraheerd 4-hydroxylamine benzoëzuur, RIC

geëxtraheerd 4-hydroxylamine benzoëzuur, CID spectrum van parent ion m/z 153

geëxtraheerd 3, 4-hydroxy benzoëzuur, RIC

geëxtraheerd 3, 4-hydroxy benzoëzuur, CID speet rum van parent ion m/z 154

blanco extract, 4-hydroxylamine benzoëzuur gemeten, RIC

blanco extract, 3, 4-hydroxy benzoëzuur, RIC

standaard 4-hydroxylamine benzoëzuur, RIC

standaard 4-hydroxyl~tine benzoëzuurm CID spectrum van pa rent ion m/ z 151

fig. Sa fractie 2 RIC

Sb fractie 2 CID spectrum van parent ion m/z 151

fig. 9 fractie 3 RIC (van parent ion m/z 151)

(15)

p:

Co m m:

Mode:

Oper:

Peak:

Area:

HYDOXY AMINO BENZOAAT

100 NG

TEST REPRO

DCI MS/MS

EI

+DAU LMR

SYNTH GAS

UP LR

HVR

1000.00 mmu

0,

4. 00

Label

wndw:

1 >

20 ~

Baseline

:

0,

3 s

I

n :

.

,

;:

~ t·1 ;, =· ·.=. ''? :

L .:<: s l

DEP

50 >

170

0~

40.

0(1

/. 100

FIG lA

RIC

I!

l

~E+07

11.

16

8

80

60 4-0

i

-,I

I

' I

i

,, l

I

20~

-

I

_l

,

_l

n

~,.A\.

- - .,

,

. ..,

'T""- ··'

·f'• ..

,

,j,/

1 \ ...

r

A'Y ,,

I

~

--.c.- ••.

,,

·• ...

I

"-' 1 r 1 i 1 1 4 i t î I i i • _ 1 j ' 1 i 1 1 ' 1

20

40

60

80

100

120

1 4-0

160

1 :

30

200 j

Sc 3 n numbo::r ;~le·:t.ed:

101 Tir.-.e::

g

i) : •3 ·1 ~- 6

I

CHR01:

(16)

-I

I

SPEC: LUHBONT2 ver 1 on UIC 7 2

HYDOXY AMINO BENZOAAT 100 NG

TEST REPRO DCI

MS

/

MS

17-AUG-90 Elap-:

.

e:

00:01:16.2.

1

0

1 13:25:04

20

0 Samp:

Comm:

Mode:

Oper:

EI

+DAU

153.0@

-9eV

LMR S

Y

NTH

HVR

GAS

8.3se:

92.1

t~orm:

'

32.1

Peak:

1000.00

mmu

100l

80

60

40

20 FIG lB

65.1

78.0

I

Int en

RIC

92..1

81.3 32.6708:3

9255362

108.2.

I

UP LR

Sta ·.-t.

In

1 et

DEP

l-1asses:

50 >

170 #

peaks:

116

153.0 I

136.0 ;.:E+06

1-3

2

0~r---~.-~-.--~~----~~--.-~~.---~~---.--~.---~~-.----~~

60

80

100

120

140

160 I

SPEC4:

I

(17)

Mode:

Op

e:

r

:

Pe:ak:

Area:

/.

:1.00

80

60

40

20 EI +DAU LMR

SY

NTH

GAS UP LR

HVR

1000.00

rnmu

0, 4. 00

Label wnd w: 1

>

8.3sel

i

n e:

_{0 '}

FIG

2A

RIC

3 \

0~

20

40

60

80

100

200 \

_L,

In

l

e

t

t"1asses: Labe:l

120

140

160

1 Scan

numbe:..-

;e:le:ct.ed:

10

3 Time::

1~0: 01:18

CHR01:

DE

?

50 >

170 0,

40.00

~E ~

0 E,

rï5 .-. c:...., I~ • J .._. /

I

· -

~

180

200

.___

__________________________________________

__

..

- -

-

..

(18)

I

SPEC:

LUHBONT18 ver 1 on UIC 7 2

17-AUG-90

Elaps~:

00:01:17.8

103 Samp:

3~4

di-HYDROXYBEN20AAT

100 NG

Start

:

17:12:29

200

Co m m ~

TEST

~:EF'~:O DCI i"lS/MS

Mode:

EI

+DAU

154.0@

-24eV LMR SYNTH GAS UP LR

Oper~

HVF.:

Inlet :

DEP

B.:,·:.e : 1:~:7.0 ~Jorm;

137.0

Peak: 1000.00 mmu

i(Hll

80~

I

E:.

0

4 2:

20 FIG 2B

3.2

55.1 64-.7

...-- r

-81.0

Int en

RIC

1880897

5357298

109.1 I

125.9 Masses:

50 >

170

#

peaks:

119

137.0

15

4.0 I

;o.;E+06

0~~~-,~~-.----~----~--~~--~~--~--~~--~~----~~-,~--~~

-60

80

100

120

140

160 I

SPEC4:

L-

-

--

· =

(19)

-~1o d E: :

EI

+DALI

L

t·1

F.:

S

'

·i t·~

TH

GAS

UP

_LR

Op

e ·r:

H ·,;

F.:

Pe.:.k:

1!330.00

ri, m

u

Label

wnd~

.

.~:

1 >

201 Are a:

0~

4.00 Base:!

i

n

e

.

_9'

3 FIG

3A

~-~

100l

I

RIC

~

:30

60i

40 I

I

0 i

I

t I t 1- / i a T i t I i • i i i i <'-ol·_.,/ i i i i ... , . ... o,.-""'" I"" •

20

40

60

80

100

120 I

·;.:a

n

.. -. ,_. rt:

b ~~

r ;el-=:ct-::d:

10

2 Time:

00:01:17

CHROl:

Inl e:t,

.

t'1asse:-=. :

Label

.

i a i T ' i

140

160 DEP

50 _>

170 0 '

40.00

i i ' i I"" • i i I

*E+07

3.741 1:30

212:11.1

(20)

SPEC:

Samp:

Comro:

Mode:

Oper:

Base:

Norm

:

Pe a k :

100-

80-

60-

40-1

LUHBONT30

ver

1 on UIC

7 2

17-AUG-90 Elapse:

GEEXTRAHEERD 4-HABA

Start

00:01:16.:=: 102.

1C:: 17:11

2.01 4-HABA

EI

+DAU

153.0@

-10eV

LMR

SYNTH

GAS UP LR

HVR

Inl et

DEP

9

? ·ï - . 4

'32. 2

1000.00

mmu

FIG 3B

E.5.1

79.1 Int en

RIC

92.2 11515230

5 37127460

108.2 Masses:

50 >

170

#

peaks:

113

153.1 *E+07

1-1

I

78.1 l

1 1 1

136.2 20-i

I

---,

I

81.1 I I I' 1

105 .

3 I

123. 1

I

0 i

,.

I

" '

I

)I

I'

, i

.

I'

ï ..

!

' .

I

'

I

'

I

0

60

80

100

120

140

160 SPE

C

4:

(21)

Node:

Op

e

·r : Pe.ak: HTE:.a:

EI

+DA

U

LMR S

Y

NTH GAS UP

LR

HV~:

1000.00

rr~ mu

0,

4. 00

FIG 4A

Label

t.Jnd•,

.

•:

Bas el

i

ne

1 >

197 0,

3 In 1

et

~1asse-s. : Label

DEP

50 >

170 0,

40.00 x

100l

~:re

r~

80 I \

~.

60 4-0

\

20 _\

l

~

I

l

.

I

'

- ( .

,

- • ~ 0 lv.-• 'vAo,r--".-... '\ "

~

/ ' - ... <"' ~ r\ =On< ..

· J

0 I T I I"""'"' I ' I I I I I i I i

f=""'

I i I • I i I i I ~ "T" 'i

I

~

r

i

r

i I I

20

40

60

80

100

120

140

160

180

S c .a n n i_, rï, b e r ; e 1 e c t e d : '1

01

T i m e : 0 0 : 0

1 :

1

8

CHR01:

*E+07

2..099

(22)

I

SPEC:

LUHBONT29 ver

1 on

UIC 7

2 Samp

:

GEEXTRAHEERD 3,4-diHBA

1 7 - A U G - 9 0 E 1 a

p -:.

e : 0 0 : 0 1 : 1 7 . ·j

Comm

:

t·1 o d e :

Ope

· r

:

Ba

· ;e

:

t.Jor m: Pe a k :

100 -80

-

60-St

art

:

18:

0 7:06

:3,4-diHBA

EI +DAU

154.0 @

-24eV LMR

S

Y

NTH

GAS

UP

LR

H

V

R

Inl et

137 .

0

137.0 1000.00

m m

•J

FIG 4B

Int en

RIC

6156797

18789676

Masses: #

pe:ak-:.:

137.0

DE~· 5~

>

11.4

154.0

109 .

2

170 40is3

.

1

I

55.2

81 .

1

20 -

r

_I

*

E ~ .: :-~

r

_k

k

I

1-3 I ~· ,..._

~

J ,

,I

1 , .. •

,

I

. .

I

.1.

,

1 2

r

· .

1 •

1 ,

.

I

.

I • 1 @

E:.

0 8 0

1 0 0

1 2 0

1 4 0

1 E

.

0 I

SPEC4:

I

(23)

Mode: EI +DAU L t·1 R S "l't-~ TH GAS UP LR

Op

eT:

HVR

Pe a k :

100(1,00

A·r e a:

_{0' 4.(10}

FIG

5 /. 1(1(3l

RIC

80

60

40

20 mmu

Label wnd'-J: Bas el

i

ne ·

.

In

I

et

.

DEP

1 _>

199

1'-lasse:s:

50 >

170 0'

3

Label

.

0'

40.00 ca

I i·~.----. i i--.. ... ;-·--;,:!, i

,v"<

-,·cL, ... -.--- i .... , . , .... , --: i . ~ •' i---.--- i ~.· -7 i

'\J"•"'

,Y i

v

,- ... ,

·

""i" i v.-,· "1

20

40

60

80

100

120

140

160

180

CHF~01:

*E+

06

(24)

I

CHRO: LCN80NT27 v er 1 on UIC 7 2 17-AUG-90

Elapse::

00:01:17.2 102

.- . • E' L .-. t I -. ) c-y -:-C:• .-. ,-. T

:=-arup

.

H ··~LI ._ .... ,r..H_.

5 t

a r

t

:

1 7

:

5 7

:

2

6 1 9

'3

Comm: 3,4- ,:::iHEA !·1 o d 2 : E I + D A U L r·1 F~ S '··? t--l T H G A 5 U P L R 0

p

e

1- : H · ... i

F. :

Peak : 100 0.00 mmu Area : 0~

4 .12

10

/; 100

80

60 +0

20 FIG

6 RIC

, l

I

J I

i

IJ

1111 f I

I

lil I,

Label

t.olnd~.oJ :

1 >

1'3'3

Baseline

:

0,

3 Inl

et

:

DEP

t'1asses

:

50 >

170

Label

:

0,

40.00 ~

~

lL'

I

Ij IJ

'1 @

r

.'

·:~·1

.

lt~

\

.

\

I '

\~ ~V

:

~

.

\: :

V

:\1

'

ll~

~

.11

~

\!

'I

'

I '

I~

i

'

I

~ ~ ~

I

.

Ir

~

I

'

.

I -'

rlv :

UI :

I

20 40 60 80 100 120 140 160 180

*

E+05

2.489 ICHF~ül

:

I

(25)

Comm:

4-~ITROSOBENZOE2UUR H ::J d .:: :

E

I +

c:.

?t

U L t·1 R 5 'lt-~ T H G A 5 U P L R Ü?eT: Pe.:tk:

A

· r

e a:

~·~ 1 (1(;3

80

63 4G

20

H V F~

100(

1_

:]i:1

0,

4. Gi2

:

FIG 7A

RIC

j;'! fit u

Label

wndw:

Baseline

1

>

0'

... .:1-:2. (15

11,.1

i

I

\~

..

.

I

nl

et

t·1 .:t -:. 'S

e

· :. :

Label

Dë:P 5G

>

:i?C,

0,

40.00

~E+ 0 .7 ~:· ' .-

-ll. .

"t . ..;; ;::

.-

1~, /I .. ,.•, .... . •- j r "J u '.,.- .,/.·.>~, .·• 1 ,u, .. . •

l

.

,

1,

j

·~ .... I,, ~ _.., ____ ,.. . .. - .·. .

u

i· \ ' .,.

1

r-~~ i ' i I . '

r

.,.

I ~· ' ·~ ··'--( i ' i I i ' i I i . ' ' .... i I -- ·;·--·-.. ~· .. ···~

·-i-

·--~

..

· -.

,

...

· ·-·

;-.

..

.

'i

___

_

2.ü 40 60

so

100 12.0 140 1t:.o 1::::c1 2Dü

I

S

·=

3 n --, IJ r11

t

•

e ..- ~ ~

)

e c

t e

d : 1a:18

Time: 00:01:213

CHF:01:

(26)

SPEC:

LUWBONT31

ver

2 on

UIC 7 2

Samp: STANDAARD 4-HABA

Co m m : 4 - N I T R 0 S D 8 E t~ Z 0 E Z U U ~;.

'"· . .., .·. U ,.... '=~ •-:1 E ' - - - •

.1_._,-H cr-_.\:J ! ·:ap·:·t::a GO: tJ1 :. ~ :~

5t.a ·ct

1 :3

~ ~:::.. 2 .-..

Mode: EI

+DAU

151.0@

-

4eV LMR SYNTH

GAS

UP LR

LJ-

p -

t:::

·

l

- •

. H H .. R I r· 1 l t;::-. t , . • -

r·,

·

.-

C... ~·

Base: 151.2

Int en

t--lo-rm

:

151.2 RIC

Pe:.ak:

1000.00

mmu

69468:34

12816114

r·1 Q ·:.

=·

e

=· :

5 0

>

1 :::· _,

#

pE:.~k ·:.: 11:0:::

. . - - - -

.. ·----

-100

FIG 7B

80

60

40

20

12.1.1 I

I

1 51.

::::

13'3.1 11 :::::

205 ;.;E

+

or::.

I

~

I

r

_~

₃

I

L

· ~

· l~

I

'3

51.

1

I

0

I '

I I ' ' I ' I I ' '

11 '

I,'

I_

__

_

-

··

· -·

~

60

80

100

12.0 14-0

~ ':.· L:

·;PEC2:

(27)

t·lo d 2 : E I

+

D A U

L

M R 5

'·-.Jt·

.

J

T H G A S U

F'

L F~

Oper:

Pe.:1k:

fi·r

e

.:s:

H ~;· ~:

1000.00

0,

4. 00

FIG 8A

f;.:I

C

ffl fil Ij L~bel

wndw:

Baseline

1

>

0 '

·'"\ . .:,

Ir

:

l

et

2.04

H

.::t ·:. ·:. ::. ·: : L-~bel

OEr

'

5

0 >

171}

o,

40. (10 ~E

+

ü

ê.

/~

1 c

0 e

lH\

fï

b

. -

. /'t:.

.

4

.

t'

IJ

I

r

,

I

\

l

.-

,

-

.

0~

60 ,'

l

1

f

I

t 1 1 11₁

I

t

~

ri'

11

..-.~,

I

tl 14

r

!\ •

4-0

2.0

, '•.< I ·.·•,

~~

' L

I

'··.I . I I ·.~ .. •. I ·. . I )'• • . . . . I l 1,1 • j· .... ,_J I I '.-· ... _.. .-··. \ ,--: 11 !

0 t .,

'

.

•,

...

(

'j'

~

.

i .... · ·, ·' ... · L·--...i ··- ... , •. ·, ,· · •. · 'i'{' ... t··, .·. _.•, I \,.

V

1-' • .. • ,...

·-~

.

·\ ... I...

I,_,. '

! ...

iJ ....

i i i i i i i i i 'P' i i i i • i i • r" i i i i I i i i i i i i i • • i '1 j' \.• ',( i _I t f, ,• ;•,.-~ ';~ .... \,' 'I

2.0

40

60

80 I ·::: .:

.

:s

ft

r

· .

u r.-.

t·

e

-.

-

sel-:;cted: 1(1'3 Tir.-.~: 1

IC

HF.:Ol:

I

100

12.0

140 00:01:2.0

160 ..

,_, ... ~

·-·

~·

2.

0

C1

(28)

5 P

E

C

:

L U H

B

ü ~-J

T 3 3

•,

)

e

-r

1

o n

U I C

:

7 2.

2.3-

AUG:- '30 El .:.p:.e: ~10: 01:20.:::: 109

Samp:

FRACTIE 2

Start

1 ::::~ L:3: 55

Comm:

4-NITROSOBENZOE2UUR

Mode:

EI

+DAU

151 .

0@

-

4eV

LMR

S~NTH

GAS UP LR

Oper:

H'v'R Inlet.

GEF

8.:1

· ;e:

151.1

t,Jo-rm:

151.1

Pe a k: 100(1. (10 ri.ri, u

100 FIG

8B

80

60

40

20

E:~5 .2

Ir.ten

RI C:

95 .

1 I

l62.'3t-4-:3

54465:30

121.

1

I

i·l

a ·::

.

·::

.

a:: ·::. : 5 0 ..:- ::.. /

C1

#

pe .:ï k·::. :

111

151 .

.

1

13•3. 2

2.

~14 -~

ë:

+

G

~~ ·1

I

r-i

I

0

~

60

80

100

12.0

140

160 SPE C

2 :

-

---

-·-- -·-·- - -

(29)

----t

· t

Cl d

e

:

Op

e

)

-:

Pe.ak:

Are

a:

~{

100

80

60

40

20

0 •::HR01

:

EI

+DAU LMR

S

YNTH GA

S

UP

LR

Hv'R

_DEP

1000.00

mmu

L

abe

l

wnd•

..

J

:

i >

2 0

:3

Inl2t

:

t·1 .a ·::. ·::.

E:

· ::

.

:

50 >

170

[1, +[1_

00 0, 4. 00

FIG

9 RIC

-... -.

Bas el int:

,-;,

..:.;

'

.

-.

..)

L2bt:l

:

11 . ;

l

I

\

.

~

I

.

I

}

~

I

:

1 '

I

i

2.0

4G

60

80 10G

120

140

i

:3

Ci

20ft

~.

I

rlll

~

I

\1 , (

I

111 ,

I\

,11 .

.il

lil

~

I

~

\

11 \ \)

'•i,j

'

I

k

_{~~~~~~~~M~\IIJ~~l.l~·~·~·~}

_;

) uV

_,

16~

- .-1

_·

_{~ ·~·}

;~E

+GE.

1.076

-·· -- -··-

· ---

-

--

-

-·-~-· - -·

---

-

--

·--· ·-· .. ····-·-

--

-

··

---·---~--

(30)

-BIJLAGE B

REPRODUCEERBAARHElD VAN CID SPECTRA

Tabel 1. Reproduceerbaarheid van het CID spectrum van '•-hydroxylamine

benzoëzuur NH = 153. m/z 153 136 108 92 Tabel 2. m/z 154 13 7 109 81 r9037 Intensiteit (%) 1 2 3 4 5 gem. VC% 59,2 34,0 49,3 30,5 59,5 46,5 29,5 20, 5 13, 6 5,4 11, 7 13,9 13, 0 41, 7 32,9 28,8 40,8 25,1 38, 7 33,3 19,7 100 100 100 100 100 100

Reproduceerbaarheid van het CID spectrum van 3,4-dihydrox:y

benzoëzuur NH

=

154. Int en si tei t (%) 1 2 3 4 5 gem. VC% 97,8 100 86,3 89,1 93,4 93,3 6,2 100 96, 7 100 100 100 99,3 1, 5 46,5 30,8 64,3 37,4 25,0 40,8 37, 7 12, 7 10, 7 20,9 11, 6 19,5 15, 1 31, 5

(31)

Fr actie 1, meting 4-HABA m/z meting 1 meting 2 153 63,0 % 80,0 % 136 30, 1 % _{25' 1 %} 108 62,6 % 68,9 % 92 100 % 100 %

Fractie 2, meting l•-HABA

m/z meting 1 meting 2

153 46,5 % 51,8 %

136 15,9 % 23,0 %

108 19,7 % 23,8 %

92 100 % 100 %

Fractie, meting 3, 4-di!IDA

m/z meting 1 meting 2

154 100 % 78,5 %

137 52,9 % 100 %

109 _{19' 6}% _{21' 6 %}

81 11, 5 %

Fractie 4, meting 3,4-di!IDA

m/ z meting 1 meting 2

154 97, 7 % 100 %

13 7 100 % ₉₂_'_{7 %}

109 48, 7 % 38,0 %

(32)

- 2

-BIJLAGE C (vervolg)

Fractie 5, meting 3, 4-diHBA

m/z meting 1 meting 2 15LI 100 % 100 % 13 7 94, 5 % 84,8 % 109 30, 7 % 37, 1 % 81 12,2 % 11,8 % Extractie experiment 3,4-diHBA 4-HABA m/z m/z 154 91, 9 % 153 % 49,9 % 13 7 100 136 % 18,9 % 109 37,0 108 % 48,4 % 81 14,8 92 % 100 % r9037