LINDEMUTHIANUM (SAC, ET MAGNJ BRL ET
CAV- EN GLOEOSPORIUM FRUCTIGENUM
BERK. FORMA HOLLANDICA NOV- FORMA.
PROEFSCHRIFT
TER VERKRIJGING VAN DEN GRAAD VAN DOCTOR IN DE LANDBOUWKUNDE AAN DE LANDBOUW-HOOGESCHOOL TE WAGENINGEN, OP GEZAG VAN DEN RECTOR-MAGNIFICUS A. TE WECHEL, HOOG-LEERAAR IN DE BOSCHEXPLOITATIE EN DE BOSCH-HUISHOUDKUNDE, VOOR EEN — OVEREENKOMSTIG ART. 46, LID 4 VAN DE WET VAN 15 DECEMBER 1917 TOT REGELING VAN HET HOOGER LANDBOUW- EN HOOGERVEEARTSENIJKUNDIGONDERWIJS(STAATS-BLAD No. 700). ZOOALS DIE LAATSTELIJK IS GE-WIJZIGD BIJ DE WET VAN 29 JUNI 1925 (STAATS-BLAD No. 283), — DAARTOE BENOEMDE COMMISSIE UIT DEN SENAAT, TE VERDEDIGEN OP MAANDAG,
16 JANUARI 1927, DES NAMIDDAGS TE 3 UUR DOOR
HENDRIK ROBBERTUS ADRIANUS MULLER
GEBOREN TE ARNHEM
ONDERZOEKINGEN OVER COLLETOTRICHUM
LINDEMUTHIANUM (SACC. ET MAGN.) BRI.
ET CAV. EN GLOEOSPORIUM FRUCTIGENUM
BERK. FORMA HOLLANDICA NOVA FORMA.
Aan het einde van mijne studie aan de Landbouwhoogeschool wil ik alien Hoogleeraren en Docenten, wier lessen ik volgde, mijnen hartelijken dank brengen voor alles, wat zij tot mijne vorming bijdroegen,
In het bijzonder dank ik U, Hooggeleerde ABERSON, HONING, KIELSTRA en REINDERS, voor alles, wat ik van U geleerd heb. Met zeer veel erkentelijkheid zal ik steeds terugdenken aan het-geen ik op Uwe colleges en practica en door persoonlijk contact
met U mocht ontvanlgen,
Uwe colleges in de Tuinbouwplantenteelt en Fruitteelt, Hoog-geleerde SPRENGER, waren voor mij van groote waarde, Gij hebt
mij doen inzien hoe voor alles de kennis van de physiologie der planten de basis van de studie der praetijkhandelingen moet zijn. Naast Uwe colleges hebt Gij mij veel geschonken, wat zoowel voor mijn werk als voor mijn leven van veel nut zal zijn.
Gij, Hooggeleerde GRIJNS, hebt mij zeer aan U verplicht door de vele moeite, die Gij U gegeven hebt bij de publicatie van mijn proefschrift
Hooggeleerde QUANJER, Gij hebt bij mij het verlangen tot diepere studie der plantenziekten doen ontwaken, Zeer erkente-lijk ben ik U, Hooggeachte Promotor, voor de wijze, waarop Gij mij bij het werk op dit gebied steeds hebt gesteunid. Aan den iijd in Uw laboratorium doorgebracht zal ik steeds met zeer veel genoegen terugdenken.
Tenslotte wil ik een woord van dank brengen aan U, Dames e n Heeren Assistenten van het Laboratorium voor Mycologie en Aardappelonderzoek, die mij steeds in zoo ruime mate van Uwe langere ervaring op het gebied der mycologie hebt doen profi-ieeren.
INHOUD.
Biz.
Inleiding 1 Deel L Onderzoekingen over Colletotrichum Lindemuthianum (Sacc.
et Magn.) Bri. en Cav 3 Hoofdstuk L Biologische rassen van Colletotrichum Lindemuthianum. 3
§ 1. Literatuur over het voorkomen van biologische rassen . . 3 § 2. Onderzoek over het voorkomen van rassen van de zwam in
Nederland . , . . , , . . , 4
a. Materiaal 4
b. Werkwijze, . . . , . 5
c. Infectieproeven en bespreking der resultaten . . . . 8
d. Verschillen in de wijze van aantasting door de verschillende
stammen. . . . 12
§ 3. Morphologie-physiologie der biologische rassen . . . . 1 3
a. Literatuur , 13
b. Eigen onderzoek . . . , . , 14
1. Materiaal en werkwijze. . , . . , . , 14 2. Resultaten en bespreking hiervan . . , . 1 4
Appendix 17 •Hoofdstuk II. Overwintering van Colletotrichum Lindemuthianum . 18
§ 1. Literatuur 18 § 2. Eigen onderzoek . . . , , , , 2 0
Hoofdstuk III. Perithecium-vorming . . . . . . . . . 2 4 6 1. Literatuur . , . . . . , . . 2 4
§ 2. Eigen onderzoek 28 Deel II. Onderzoekingen over een Gloeosporium spec, gei'soleerd van
Phaseolus multiflorus Wild . . . • , . . . . . 3 2
§ 1. Beschrijving van de zwam 32 § 2. Invloed van de temperatuur op den groei . . . . . 3 3
§ 3. Infectieproeven op kiemplanten van Phaseolus vulgaris L. . 34 § 4, Isolaties uit met cultuur K gei'nfecteerde planten van Phaseolus
vulgaris . * •. . . . . . . . . . 36
§ 5. Infectieproeven op appels en tomaten . . . . . 4 4 § 6. Verdere infectieproeven op Phaseolus vulgaris L . . . 5 7
§ 7. Nomenclatuur van stam K . v . 6 2
§ 8. Beschouwingen over de varibiliteit van stam K. . . . 6 6 Summary in English . . , * • . 7 3
Lijst van geciteerde literatuur . . . 90 Platen (plates).
De onderzoekingen van BARRUS (1911, 1915, 1918) over het voorkomen van biologische rassen van Colletotrichum Lindemu-thianum (Sacc. et Magn.) Bri. et Cav. in Noord-Amerika gaven aanlciding de vraag onder de oogen te zien of zoodanige rassen ook in Europa en speciaal in Nederland voorkwamen,
Dit is een vraag, welke voor het kweeken van tegen anthracnose resistente boonenvarieteiten van groot belang is. (MC. ROSTIE 1919, 1921 a en 6, REDDICK 1922, BURKHOLDER 1923). Wanneer men de biologische rasfeen van de zwam kent, kan men meer
doelbewust kruisingen gaan uitvoeren tusschen voor een of meer biologische rassen onvatbare boonenvarieteiten.
Bij ons onderzoek is geen poging gedaan om alle in Nederland voorkomende rassen van Colletotrichum Lindemuthianum (Sacc. et Magn,) Bri, et Cav. te verzamelen, noch om de vatbaarheid van de Mederlandsche boonenvarieteiten voor die rassen na te gaan. Door gebrek aan plaatsruimte in de kassen was het niet mogelijk een onderzoek in deze richting te doen, want dit werk
behoort in goed gei'soleerde infectiecellen te geschieden om ver-menging van de rassen te voorkomen.
Wij hebben ons daarom bepaald tot een nader onderzoek van ^nkele rassen en daarbij nagegaan of behalve de verschillen in virulentie voor bepaalde boonenvarieteiten andere physiologische
en ook morphologische verschillen tusschen de rassen te consta-teeren waren,
Verder werd nagegaan of de gei'soleerde rassen identiek waren met de door BARRUS (1911, 1918), BURKHOLDER (1923) en LEACH (1923) in Amerika gevonden rassen van de zwam,
Daar niet met voldoende zekerheid bekend was of Colleto-trichum Lindemuthianum bij afwezigheid van boonenplanten of -resten in de aarde kan overwinteren, werd nagegaan of de zwam in aarde vrij van deelen van boonenplanten kon leven en welke iemperaturen beneden het vriespunt doorstaan konden worden.
Slechts een enkele maal vindt men in de literatuur gevallen van aantasting van Phaseolus multiilorus Wild door anthracnose
vermeld.
Toen.ons dan ook een door deze ziekte aangetaste peul van de pronkboon in handen kwam, was dit een aanleiding om te onder-zoeken of de veroorzaker van deze aantasting een speciaal
f,multiflorus" ras van Colletotrichum Lindemuthianum (Sacc. et
Magn.) Bri. et Cav. was.
. De resultaten van kweekproeven met de uit de aangetaste peul gei'soleerde zwam leidden tot de veronderstelling, dat deze een vorm van Gloeosporium fructigenum Berk, zou zijn, De juist-heid van deze veronderstelling werd door infectieproeven op Phaseolus vulgaris, appels en tomaten bevestigd,
Bij deze proeven werd gevonden, dat de virulentie van deze zwam in hooge mate door het substraat bei'nvloed wordt en er ontstonden door het kweeken op bovengenoemde substraten een aantal zeer constante variaties van de zwam. (In dit verband willen wij er op wijzen, dat het ons ongewenscht voorkomt derge-lijke vormen als „mutaties" te betitelen, daar door de asexueele voortplanting van de zwam het bewijs niet te leveren is, dat er een verandering in genotype is opgetreden.) Het was mogelijk eenerzijds stammen te verkrijgen met grooter virulentie voor Phaseolus vulgaris L, en geringer virulentie voor vriichten dan
de oorspronkelijke stam en anderzijds stammen, waarvan de virulentie voor appels en tomaten sterk vergroot was in verge-lijking met de oorspronkelijke stam. Deze groote mate van varia-biliteit, welke ook bij verwante Gloeosporien voorkomt, achten
wij van belang om inzicht te krijgen in de specialisatie ten opzichte van de voedsterplanten. (Zie Deel II, § 8.)
Door de groote virulentie, welke de zwam bezit voor vruchten, vertoont deze veel overeenkomst met Gloeosporium fructigenum Berkeley. Zij is echter niet identiek met de door KRt)GER (1913) beschreyen Gloeosporium fructigenum Berk, forma americana en
Gloeosporium fructigenum Berk, forma germanica. Wij meenen haar daarom als een nieuwe vorm van Gloeosporium fructigenum
Berk, te moeten beschouwen en hebben deze vorm genoemd: forma hollandica nov. forma.
BIOLOGISCHE RASSEN VAN COLLETOTRICHUM
LINDE-MUTHIANUM (SACC. ET MAGN.) BRL ET CAV.
§ 1. LITERATUUR OVER HET VOORKOMEN VAN BIOLOGISCHE RASSEN.
BARRUS (1911) concludeert na infectieproeven met rein-cultures, d a t er minstens 2 rassen van de zwam moeten bestaan, die verschillen in specifiek infectievermogen ten opzichte van verschillende boonenvarieteiten.
EDGERTON en MORELAND (1916) vonden bij het onderzoek van isolaties van Colletotrichum Lindemuthianum van verschil-lende herkomst 3 rassen van de zwam.
In 1918 vermeldt BARRUS de resultaten van infectieproeven op een groot aantal boonenvarieteiten met talrijke isolaties van de zwam. Uit deze resultaten besluit BARRUS, die blijkbaar het onderzoek van EDGERTON en MORELAND niet kende, dat er 2 r a s s e n b e s t a a n , die hij r a s a en r a s ft n o e m t . Z e e r o v e r t u i g e n d is het betoog van BARRUS niet, wanneer hij aantoont, d a t er niet meer dan 2 rassen zijn. In zijn tabellen zijn meerdere gegevens te vinden, waaruit m e n evengoed tot het bestaan van meer dan twee rassen k a n concludeeren. O p p . 600 zegt BARRUS zelf:
I tFrom table 3 one would conclude that culture K, with possibly
t w o e x c e p t i o n s , is closely related*to s t r a i n /?, b u t in t h e s e l a t t e r v a r i e t i e s , as shown in t a b l e 4, it a p p e a r s , e x c e p t for t h r e e v a r i e t i e s to b e r e l a t e d to strain a", T o c h r e k e n t BARRUS d e z e s t a m K t o t r a s /?. Hij h a d deze s t a m e c h t e r m e t m e e r r e c h t als e e n n i e u w r a s k u n n e n b e s c h o u w e n .
Ook LEACH (1923) gaat niet met de indeeling van de stammen van BARRUS in 2 groepen accoord, Hij zegt (p. 103): ,,if w e con-sider difference in parasitism a sufficient basis for distinguishing biologic forms, a difference can not justly be disregarded even if manifested on one host only. Furthermore, these forms m a y act
differently on many other bean varieties which were not inoculated".
M a a r dadelijk hierna begaat LEACH dezelfde fout, die hij BARRUS verwijt, LEACH heeft 8 biologische rassen gevonden en geeft dan met behulp van de bekende vatbaarheid van 7
boonen-varieteiten voor deze 8 rassen een sleutel, waarmede, naar hij zegt: „an unknown biologic form may be readily identified by a few simple inoculations" (p. 10), LEACH rekent er nu niet meet
dat onder de talrijke andere boonenvarieteiten wel verschillen in vatbaarheid voor, volgens den sleutel van LEACH gelijke, rassen kunnen optreden, Dat d i t i n d e r d a a d kan voorkomen, zal in het onderstaande (§ 2, c p, 12) aangetoond worden.
In 1923 vermeldt BURKHOLDER het bestaan van een y ras van de zwam, zoo genoemd in onderscheiding van de door BARRUS gevonden a en . /? rassen. Dit y ras bleek boonen-varieteiten aan te tasten, die zoowel voor de rassen a als /? resistent waren,
' In de meeste van de bovengenoemde gevallen vertoonden de verschillende rassen behalve in hun verschillen in specifiek infectie vermogen ten opzichte van boonenvarieteiten geen mor-fologische verschillen,
Het zijn uitsluitend Amerikaansche auteurs, welke het bestaan van biologische rassen van de zwam constateerden.
In het werk van enkele Europeesche onderzoekers komen wel eenige aanwijzingen voor, w,aaruit blijkt, dat waarschijnlijk ook in Europa rassen van de zwam voorkomen.
Zoo zegt FISCHER (1919), dat naar zijn opvatting de tegen-strijdige meeningen in Duitschland over de vatbaarheid van be-paalde boonenvarieteiten voor anthracnose hun verklaring kunnen vinden in het voorkomen van verschillende rassen van de zwam in de verschillende plaatsen, zoodat een boon, die in de eene streek weinig vatbaar is, in een andere streek sterk aangetast w o r d t
SCHAFFNIT en BONING (1925) vermelden echter, dat zij bij een onderzoek met cultures van uit verschillende streken van Duitschland afkomstige aangetaste peulen geen biologische rassen hebben gevonden,
§ 2t ONDERZOEK OVER HET VOORKOMEN VAN RASSEN VAN COLLETOTRICHUM L1NDEMUTHIANUM IN NEDERLAND.
a. MATERIAAL,
Infectieproeven zijn gedaan op een aantal van dezelfde boonen-varieteiten, die BARRUS (1918) en LEACH (1923) voor hun infectieproeven gebruikten en welke zij welwillend ter onzer
rassen van de zwam identiek zouden zijn met de in Amerika door BARRUS, BURKHOLDER en LEACH gevonden rassen. Van de door Prof. BARRUS gezonden boonen was bekend of zij al dan niet voor een of meer van de rassen a, /? en y vatbaar waren. Dr. LEACH zond de 7 in zijn ^analytical key to biologic forms of Colletotrichum Lindemuthianum" genoemde soorten,
Al deze boonen behoorden tot de soort Phaseolus vulgaris L. Van de voor de infectieproeven gebruikte reincultures van de zwam waren er twee gei'soleerd van aangetaste peulen van bruine boon afkomstig uit 's Heer Arendskerke (Zeeland). Deze cultures zijn in bet onderstaande aangeduid als cultures Z I en Z II.
Cultuur Z / werd uit een boon gei'soleerd, waarvan in de avervuli in de aangetaste plekken abnormaal veel setae voor-kwamen, waardoor deze inplaats van de normale grijsroode kleur een zwarte kleur vertoonden. Deze afwijking is echter later slechts zelden weer gevonden bij avervuli op kunstmatig geinfec-teerde boonenplanten of -peulen.
Verder werden infectieproeven verricht met een cultuur, gei'so-leerd van een peul van de ,,Dubbele Hollandsche Princesseboon", afkomstig uit 's Gravenzande in het Westland. Deze cultuur is in het vervolg met de letter W aangeduid.
Een vierde cultuur werd gei'soleerd van een peul van de snijboonvarieteit ,,Noordster", afkomstig uit Enkhuizen. Deze cultuur is in het onderstaande met de letter E aangeduid.
6. WERKWIJZE.
De als uitgangsmateriaal voor de infectieproeven gebruikte cultures werden ieder eenige malen achtereen uit een spore ge-kweekt. Deze een-spore-cultures werden verkregen door een druppel eener verdunde sporensuspensie op een zeer dunne laag boonengelatine 1) in Petrischalen uit te zaaien.
Na 24 uur werd met behulp van het microscoop apart liggende kiemende sporen opgezocht en deze werden overgeent. Wanneer
2] De boonengelatine werd volgens het onderstaande voorschrift bereid;
100 Gr, boonen 1 uur in 1 L. warm w a t e r weeken, vervolgens de massa 1 uur koken. Filtreeren. Filtraat tot 1 L. aanvullen en 10 % gelatine toe-voegen, Vervolgens V2 uur bij 120° C. steriliseeren. Na 24 uur nogmaals
de op deze wijze verkregen cultuur sporen vormde, wcrden op dezelfde wijze, weer een-spore-cultures gemaakt en daarna werd het geheele proces nog eens herhaald,
Deze werkwijze is voldoende betrouwbaar, wanneer men de sporensuspensie zoodanig verdunt, dat men per druppel sporen-suspensie 10 a 15 conidien op de voedingsbodem brengt Zeer zelden blijven dan de sporen aan elkaar kleven en bovendien kan men met behulp van het microscoop controleeren of men werke-lijk een spore overent,
Bij de infectie werd als volgt te werk gegaan.
Van de een-spore-cultures werd overgeent op door koken ge-steriliseerde stengels van Vicia faba in cultuurbuizen. Op dit substraat worden in korten tijd overvloedig acervuli en pseudo-pycniden gevormd. Sporensuspensies werden bereid door de
geente stengels van Vicia faba in water te brengen, ze 10 minuten te laten staan om de sporen te doen losweeken en ze vervolgens met een glazen staaf te wrijven om de sporen te doen loslaten.
Ten slotte werd de vloeistof door een gazen lapje gefiltreerd om de vaste deelen van den voedingsbodem te verwijderen. De zoo verkregen sporensuspensie werd met behulp van een metalen vaporisator over de te infecteeren planten verstoven.
, De infectieproeven werden verricht in de infectiecellen van de kassen van het Laboratorium vbor Mycologie en Aardappel-onderzoek te Wageningen. De infectieproeven werden steeds gelijktijdig met de 4 genoemde stammen genomen in 4 aparte infectiecellen.
Van de te onderzoeken boonenvarieteiten werden in elk der 4 kasjes evenveel zaden afzonderlijk in potten gepoot in een gekookt mengsel van kleigrond en turfmolm, Wanneer het eerste paar bladen volledig ontwikkeld was, (ongeveer 14 dagen na het zaaien) werden de planten gei'nfecteerd. De eerste dagen na de infectie werd de temperatuur der kasjes op ongeveer 18°—20° C.
gehouden, daar dit volgens LAURITZEN (1919) de voor infectie meest geschikte temperatuur is, Eenige uren voor de infectie werd de grond in de bakken goed vochtig gemaakt en na de be-sproeimg met de sporensuspensie werden de bakken, waarin de
planten stonden afgedekt met glasplaten, waarop papier kwam te liggen.
Het afdekken der bakken met glas is noodig om de voor infec-tie noodige luchtvochtigheid te verkrijgen. Volgens LAURITZEN
na. infectie niet in het voile licht te plaatsen, daar gebleken was, dat het licht de eerste dagen na de kieming der sporen den groei van de schimmel vertraagt. Of het licht het binnendringen der zwam in de plant ook bei'nvloedt, kon niet worden nagegaan.
Twee dagen na de eerste infectie werd de besproeiing met een sporensuspensie herhaald en nog twee dagen later werd het glas Tan de bakken afgenomen,
Tegen het trekken van conclusies bij deze proefopzet zou men als bezwaar kunnen aanvoeren, dat de planten in zeer abnormale omstandigheden geplaatst zijn geweest, Proeven van BARRUS
(1921) en LEACH (1923), waarbij planten verwond werden of ^eer vochtig of zeer droog gekweekt werden, hebben echter be-wezen, dat dergelijke abnormale groeiomstandigheden niet in staat zijn de vatbaarheid van de planten te veranderen.x)
Ongeveer 7 dagen na de Iste infectie vertoonden zich de ziekteverschijnselen. Twaalf dagen na de lste infectie werd het resultaat genoteerd, Bij de beoordeeling werd de aantastings-r a a d met behulp van ondeaantastings-rstaande puntenschaal aangeteekend:
Aantastingsgraad. 10 8 6 4 2 0 Symptomen. Plant dood.
,, sterk aangetast, kans ) op de vlekken zeer op herstel gering. ) veel acervuli, ,, vrij sterk aangetast, vrij veel acervuli.
(1 J i c h t aangetast, weinig acervuli.
,, zeer licht aangetast, geen acervuli, Geen spoor van aantasting.
l) Dat zelfs vrij sterke verwondingen geen invloed hebben op
vatbaar-heidsgraad bleek toen bij een infectieproef,* dadelijk na de l s t e infectie e e n ruit brak, waardoor 15 planten van de varieteit Red Indian Minn. 1101 en 17 planten van de varieteit Navy Minn. 1083 sterk b e s c h a d i g d w e r d e n : er waren stengels en bladsteelen gebroken of geknakt en bladeren ge-kneusd. De meeste van deze planten bleven in leven. De beschadigde planten van de varieteit Red Indian Mirin, 1101 werden in geen enkel opzicht sterker aangetast dan de niet beschadigde. En de beschadigde exemplaren van de varieteit Navy Minn. 1083, die voor het rast waarmede
8
Het geven van- cijfers maakt het beter mogelijk de aantastingen door verschillende rassen van de zwam te vergelijken en een gemiddelde te bepalen dan bij het geven van qualificaties zooals sterk, vrij sterk, matig enz. het geval is, Ook is het nu mogelijk bij iedere infectieproef de middelbare font van het gemiddelde in den aantastingsgraad teberekenen en zoodoende de variabiliteit in de vatbaarheid der varieteiten te bepalen en na te gaan of er reeele verschillen in aantasting bestaan.
c. INFECTIEPROEVEN EN BESPREKING DER RESULTATEN. De resultaten van de infectieproeven zijn neergelegd in de tabellen 1 en 2< De eerste tabel geeft de graad van aantasting met de daarbij behoorende middelbare fout van het gemiddelde
(berekend volgens JOHANNSEN, 1913) op door Prof, BARRUS ge-zonden boonen.
Uit tabel 1 blijkt duidelijk, dat alle vier de cultures zich ten opzichte der gebruikte boonenvarieteiten verschillend gedragen.
De cultures Z I en Z II zijn verschillend van de cultures E en W door hun gedrag tegenover b.v, de varieteiten Red Kidney, Well's Red Kidney, Yellow Eye 17-541-12-1-6 e.a. De stammen
Z I en ZII verschillen onderling in hun gedrag tegenover de varieteiten Burpee White Wax, Extra Early Refugee, Kentucky
Wonder e. a.
De cultures E en W verschillen onderling door hun gedrag tegenover de varieteiten: Round Pod Kidney Wax, Extra Early Refugee, Black Kentucky Wonder, Refugee Wax.
De cultures Z I, Z II, E en W gedragen zich dus verschillend bij infectie van dezelfde boonenvarieteiten. Deze cultures kunnen hierom als aparte biologische rassen van Colletotrichum Linde-muthianum beschouwd worden.
Thans dient te worden nagegaan of deze rassen identiek zijn met de rassen a, p en y van BARRUS en BURKHOLDER.
In kolom 6 van tabel 1 is aangegeven de vatbaarheid der boonenvarieteiten voor de rassen a, /* en y. De kleine letters
a, b en c duiden aan, dat de betreffende boonenvarieteit vat-baar is voor de rassen a, /J en y en de letters A, B en C
be-teekenen, dat deze varieteit onvatbaar is voor deze rassen van de zwam,
c o o 0) c o a CO b S w ctf O "3 « > * a 3 C tf •^* J 3 -*-» 3 6 • 1-4 g ^4 3 ,J3 (J *-» O Q> "o a > rf\ u 3 3 o e etf • =6> > G O o £ h j „ N N D tf J 2 P Q * C CQ rt rt rt nJ vO 0 0 H ON © oi-H c o m c o ON o o d d d ^ m -5 *5 cC ^ ^ ^* "tf - ^ 0 0 TJ< CM o" d +1 +1 +1 +1 -H -H © 1 so CM *-< m NO CM o i n I H h « ^ 1 d oo" i n CM" • o *-< m CM T H \ © C O t -^ ro ro OJ d d d o" r*-o cr*-o o ^» CN r i Cv T H ^—1 • ^ i o +1 +| +1 +1+1 1 o +| t - o o o r- o o o CM CM o m N h 0 0 O^ t ^ ( ^ M M t - . t - \ o i > t o ^ CO N£> d d d d
+i +i +i +i
*-> ON r- co M H i n oo ^_ w co i n CM" oo* to" ^ 00 o r- r- co i n o n o d d+1+1+1 i
co co co co O co i n co i n r J i n vo * • * x fc « -SJ ^ S » O ST ^ « £ c *5 . T 3 G) Q> S * . • H .+-» i \ t r-M "S ^ •= a ^ • : ^ . O 3 X *2 . 0 5 CQ W PQ I > \o ^ H r- o T - H CM CM CO \Q *3* CO CO t * CO o d d J 2 -< o o O N ON m d CQ m CQc--< c--< c--< 5
•< • ^ ON r f c * O CM o" d * +1 o +| o CO CO CO t % <-H CM d • d VO -r-4 0 0 t ^ o o o" d +1 © +1 o co m 0 0 O N o o o o" ^ H T f O "2 "^ © o co m d d d o 1 +1 +1 +1 +1 +1 +1' +1 -H vo N m m ^o c^ CM ^ 0 0 co i n co ^c co m ^ * - i C3 *-H 0 0 ^ O CM CO C ^ d d o" d * - H ^ - 1 T-* 0 0 CO c-co d m n ^ M ^ H T+ *-* r ^ CO* CM NO O I H m so co r - -^H O N m CO CO CM o <D c5 cS <o +1 +1 +1 +1 +1 +| +1 +1 +1 M^ t ^ 0 0 • ^ CO t o t-* t^ m m ^ a " oC so V . o a t-t — » ' c .. k1 ^ J g
o ^ 5 S A) O 3 * : ss s i « ^ 9= ^ o o r* o^ >> a T 3 T 3 0> i n t - r ^ CM xO O sO w O O v j . CM ^ H T p ON . . . vO 1 1-H CM a m •n 1 «-1 § -s *•
J | «
w . ^ >u *—* ^ X 4 3 »-• G> -r?^ dS ^ £ 1
cu -a o o > u o T3 ,0 f l a a CJ N O o t 3 - C -a Ui 0) 0) V.s
0) "Off a « o N c i-. 3 3 •4-* • — I 3 - O w c i> t-> « - 4 I T J M O g C r-o o N 0) CJ N o S .-S O • r4 ft) 3 « C " O 0 - O u > *oc -T 3 rt c <y10
Burpee's White Wax, die volgens de opgave van BARRUS voor de rassen a en /? zeer vatbaar zijn, slechts licht aan, Stam Z / is dus niet gelijk aan a en /? van BARRUS,
De varieteit Yellow Eye 17-541-12-1-6 is volgens BURKHOLDER (1923) immuun voor ras y. Deze varieteit wordt door stam Zl sterk aangetast, terwijl de voor ras y vatbare varieteiten White
Imperial en Perry Marrow zeer licht worden aangetast. Hieruit blijkt, dat stam Zl niet gelijk is aan ras y van BURKHOLDER,
Stam Zll tast de voor ras a zeer vatbare varieteit Black Kentucky Wonder bijna niet aan. De voor ras ft vatbare varie-teiten Round Pod Kidney Wax en Extra Early Refugee zijn eveneens resistent voor stam Zll. Stam ZII is dus niet gelijk aan de rassen a en ft.
De voor ras y onvatbare varieteit Yellow Eye 17-541-12-1-6 wordt sterk aangetast door stam 2 / / ; de voor ras y vatbare varieteiten White Marrow, White Imperial en Perry Marrow zijn voor stam Zll resistent.
Stam Z / / is dus ook niet gelijk aan ras y,
Stam £ k o m t in veel opzichten overeen met ras a; stam E tast de voor ras a vatbare varieteiten Burpee's White Wax, Extra Early Refugee, Black Kentucky Wonder en Refugee Wax sterk aan. Alleen de voor ras a vatbare Round Pod Kidney Wax is voor stam E resistent. Verder wordt de voor ras a resistente varieteit White Marrow door stam E zeer sterk aangetast. We kunnen dus concludeeren, dat stam E toch niet gelijk is aan ras a van BARRUS. Thans moeten we nog nagaan of stam E gelijk is aan een der rassen /? en y,
De voor /? of y vatbare varieteiten White Kidney, Red Kidney, White Imperial, Perry Marrow en Well's Red Kidney
zijn zeer resistent voor stam E. Stam E komt dus ook niet overeen met de rassen ft en y.
Stam W tast de voor de rassen a en /J vatbare varieteit Round Pod Kidney Wax zoo goed als niet aan en ook voor a
vatbare varieteiten Black Kentucky Wonder, Refugee Wax en Kentucky Wonder worden slechts licht aangetast. Hieruit blijkt, dat stam W niet gelijk is aan ras a. De voor de rassen ft eny vatbare varieteiten White Kidney en Red Kidney en de voor ras y vatbare varieteiten White Imperial, Perry Marrow en Well's Red Kidney worden niet of zeer licht door stam W aangetast. Stam W is dus niet gelijk aan een der rassen £ en y.
Uit het bovenstaande blijkt, dat geen der stammen ZI, ZII, E en W overeenkomt met een der rassen a, /? en y van
BARRUS en BURKHOLDER. .
Ook werden infectieproeven genomen om na te gaan in hoe-verre de gevonden biologische rassen overeenkwamen met de door Dr. LEACH (1923) gevonden rassen. Om dit vast te stellen werd gewerkt met door Dr. LEACH gezonden boonenvarieteiten, welke volgens zijn opgave zouden kunnen dienen voor het
identifi-ceeren van onbekende biologische rassen van de zwam. Van iedere boonensoort en met iedere stam werden 50 planten gei'nfecteerd.
Tabel 2 geeft de resultaten van deze infectieproeven en tabel 3 geeft weer de „analytical key to biologic forms of Colletoirichum Lindemuthianum* van LEACH.
TABEL 2. Boonnevarieteiten
van LEACH. Brown Swedish, Minn, 152, Red Kidney, Minn. 156 . . Red Indian, Minn. 1101 . . Navy, Minn, 1083 . . . . Ruby Horticultural Bush,
Minn. 98 . Improved Yellow Eye, Minn.
Resultaat van de ZI 9,445 ± 0,151 1,348 ± 0,133 9,614 ± 0,160 2,594 ± 0,256 0,104 ± 0,049 9,766 ± 0,132 9,936 ± 0,141
infectieproeven met de stammen:
ZII 9,00 ± 0,152 1,00 ± 0,064 9,675 ± 0,184 2,489 ± 0.158 0 9,070 ± 0.129 8,364 -t 0,182 E 5.644 ± 0,264 9,857 ± 0,144 0 9,848 ± 0,187 8,907 ± 0,261 0 0 w 2,508 ±0,188 9,06 ± 0,048 0 9,344 ± 0,124 7,147 ± 0,390 0 0 TABEL 3.
Analytical Key to Biologic Forms of Colletotrichum Lindemuthianum.
Brown Swedish, Minn. 132. resistant Vx)
,. „ „ .. susceptible.
Navy, Minn. 69, resistant • VIII „ „ (, susceptible.
Red Kidney, Minn. 156. resistant IV „ ,, ,, susceptible.
Red Indian, Minn. 1101 resistant.
Navy, Minn. 1083 r e s i s t a n t . , II ,, „ „ susceptible.
Ruby Horticultural Bush, Minn. 98 resistant. Improved Yellow Eye, Minn. 1906
resistant VII Improved Yellow Eye, Minn. 1096
susceptible . . . . V I Ruby Horticultural Bush, Minn. 98
sus-ceptible . , Ill Red Indian, Minn. 1101. susceptible . . . . I
J) De cijfers in deze kolom geven de door Dr. LEACH gevonden rassen
12
Uit kolom 2 en 3 van tabel 2 blijkt, dat de stammen Zl en ZI1 op de gebruikte boonenvarieteiten geheel gelijk werken e n volgens tabel 3 zouden ze beiden identiek met ras VIII zijn.
Uit de resultaten van de vroegere infectieproeven is echter wel voldoende gebleken, dat de stammen Z I en Z II niet aan elkaar gelijk zijn. Hieruit blijkt, dat het schema van LEACH, waarin het al of niet vatbaar zijn van 7 boonensoorten dient om vast te stellen of men met bekende-of met nieuwe biologische rassen t e doen heeft, hiervoor niet toereikend is. (Vgl, p. 4,)
De stammen E en W geven alleen een verschil in aantasting van de varieteit Brown Swedish, Minn 132, op de andere soorten geven ze een ongeveer gelijke mate van aantasting,
Volgens tabel 2 en 3 is stam E identiek met ras IV en stam W met ras V, doch het is niet zeker, dat dit werkelijk het geval is, want ook hiervan kan gezegd worden, hetgeen LEACH als bezwaar tegen conclusies van BARRUS (1918) aanvoert; „these forms may act differently on many other bean varieties which were not inoculated/' (LEACH 1923, ,p. 9.)
LEACH vermeldt, dat hij geen immune soorten gevonden heeft en dat de meest resistente planten nog kleine vlekjes vertoonden, Bij onze proeven werden op de varieteiten Red Kidney en Improved Yellow Eye na infectie met de stammen E en W in het geheel geen sporen van aantasting gevonden. Ook dit wijst er op, dat de stammen E en W niet identiek zijn met de rassen IV en V.
d. VERSCHILLEN IN WIJZE VAN AANTASTING DOOR DE
VERSCHILLENDE STAMMEN.
In enkele gevallen werd waargenomen, dat behalve verschillen in de mate van vatbaarheid der boonenvarieteiten voor de rassen der zwam ook verschillen bestaan in de wijze, waarop de aantas-ting plaats heeft.
De stammen Zl en Z II doen alle planten van de varieteit Yellow Eye 17-541-12-1-6 afsterven.
Hoewel de planten op het tijdstip van infectie even oud, geheel gelijk ontwikkeld en gelijk behandeld waren, werd bij de planten gei'nfecteerd met stam Z II zoowel het hypocotyle als het epico-lyte deel der stengel aangetast, terwijl bij de infectie met stam
Z I alleen aantasting van het epicotyle stengeldeel en van den wortelhals optrad (zie plaat 3).
. Een zeer eigenaardig verschil in aantastingswijze door de 4 xassen trad op bij de varieteit Michigan Robust Pea Bean,
De planten waren op denzelfden dag gezaaid, gelijk behandeld en gelijktijdig gei'nfecteerd.
De stam Z / / gaf zeer geringe aantasting en dan nog alleen op de jongste stengeldeelen, stam W deed de planten boven de kiembladen afsterven, stam Z / tastte de bladstelen en den stengel
boven het eerste paar bladen zoodanig aan, dat de bladen niet .afstierven, doch de groei vrijwel geheel tot stilstand kwam. In 3 weken na de infectie waren de planten ongeveer 2 c.M. ge-groeid; de bladen waren wat krom getrokken en het aangetaste siengeldeel, de bladstelen en de bladnerven waren bruin gekleurd, De aangetaste deelen waren niet ingezonken, doch bleven turgescent en er waren geen scherp begrensde infectieplaatsen waar te nemen. Ook werden geen acervuli gevormd. Stam E deed
de planten geheel afsterven. (Plaat 2 en 3.)
§ 3. MORPHOLOGIE-PHYSIOLOGIE DER BIOLOGISCHE RASSEN.
a- LITERATUUR.
EDGERTON (1915) vermeldt, dat het optimum voor groei van Colletotrichum Lindemuthianum ligt bij 22° tot 23° C. en het maximum voor groei tusschen 30° en 31° C.
EDGERTON onderzocht de 8 cultures van de zwam. Uit de in zijn publicatie gegeven grafieken blijkt, dat niet alle isolaties <lezelfde groeicurve vertoonen, doch hij geeft niet aan of er
ver-band bestaat tusschen de pathogeniteit der cultures voor ver~ schillende boonensoorten en de verschillen in groeicurve.
BARRUS (1921) vermeldt, dat de minimum temperatuur voor £roei tusschen 0° en 4° C, ligt, de optimum temperatuur 22° en de maximum temperatuur 34° C, bedraagt. Hoe de door BARRUS gevonden biologische rassen door de verschillende temperaturen bei'nvloed worden, valt uit de door hem gegeven grafiek niet af te leiden.
LEACH (1923) nam proeven over den invloed van de tempera-iuur op den groei van 3 biologische rassen, De verschillen in
groeisnelheid en kolonievorm bij verschillende temperaturen van deze rassen waren gering en vervolgens LEACH zijn ze van geen waarde, Er dient echter hier vermeld te worden, dat uit zijn grafiek figuur 2 blijkt, dat voor de rassen V en VI de optimum temperatuur ongeveer 18,5° C. bedraagt en voor ras VII 23° C.
14
Uit een andere proef van LEACH blijkt, dat voor Colletotrichum de maximum temperatuur 32,5° C. bedraagt en de optimum tern-peratuur 22,5°, Het gelukte LEACH verschilte vinden in de wijze waarop 2 rassen op toevoeging van bepaalde suikers aan de voedingsoplossing, waarin de rassen gekweekt werden, reageer-den.
SCHAFFNIT en BONING (1925) vermelden, dat de optimum temperatuur tusschen 18° en 22° C. ligt en de maximum tempe-ratuur tusschen 33 en 35° C.
b. ElGEN ONDERZOEK. "\ 1. Materiaal en werkwijze.
De proeven werden genomen met cultures van de stammen ZI,ZII,E enW.
De te onderzoeken stammen werden gekweekt in Petrischalen cp kersenagar. Er werd zorg voor gedragen, dat de laag agar in alle schalen even dik was. De schalen werden geent met stukjes mycelium en een weinig van den voedingsbodem (kersenagar),
groot 4 X 4 mm., afkomstig uit jonge cultures der verschillende stammen.
Na het enten werden de schalen eerst 2 dagen in een thermo-siaat bij een temperatuur van 20° C. en vervolgens 1 dag bij 5° C. geplaatst. Dit plaatsen der cultures bij + 5° C. werd gedaan om den ingetreden groei tot stilstand te brengen. Daarna werden van iedere stam telkens 3 schalen geplaatst in thermostaten van 5°, 10°, 15°, 20°, 25°, 28°, 30° en 35°' C. Weer 1 dag later werd de diameter der cultures gemeten. Vervolgens werden de cultures n a 2 en 4 dagen gemeten. Uit de op deze wijze verkregen gegevens werd de dagelijksche toename van de diameter der cultures berekend.
2. Resultaten en bespreking hiervan.
De resultaten der in het bovenstaande beschreven proef zijn samengevat in tabel 4,
De minimum-, optimum- en maximum-temperatuur voor groei blijkt dus geheel over een te komen met die, welke EDGERTONr
BARRUS, LEACH en SCHAFFNIT en.BONING vonden. Bij alle stam-men ligt de maximum temperatuur voor groei in de buurt van 30° C. Bij verhooging van de temperatuur van 28° CM waarbij
alle nog meer of minder goed groeien, op 30° C. komt de groei geheel tot stilstand. Bij stam Z I ligt de lethale temperatuur zeer
TABEL 4. Gemiddelde dagelijksche groei in m,M. ZI Ill E W T e m p e r a t u u r : . . . 5° •1,0 0,6 0,2 0,2 10° 0,9 2,0 U 1,2 15° 4,1 4,2 3,1 3,3 20° 4,7 5,3 4,2 4,0 25° 4,0 - 4,9 5,0 5,4 28° 2,9 4,4 4,4 4,3 . 3 0 ° 0 0,1 0,5 0,6 35° C. 0 0. 0 0
dicht bij de maximum temperatuur voor groei, Worden de cul-tures, welke bij 30° C. geplaatst geweest zijn, weer op lagere temperatuur gebracht, dan heeft geen groei meer plaats.
Voor de andere stammen ligt de lethale temperatuur tusschen 30° en 35° C.
Uit tabel 4 blijkt, dat bij de temperaturen 5° tot en met 20° de stammen E en W langzamer groeien dan de stammen ZI en ZII. Het groei-optimum voor de stammen ZI en ZII ligt in de buurt van 20° en dat van de stammen E en W in de buurt van 25°., Ook wordt door verhooging van de temperatuur van 28° op 30° bij de rassen ZI en ZII de groei meer bei'nvloed dan van de rassen E en W, W e hebben hier dus overeenkomst met hetgeen uit de proeven van LEACH bleek; de rassen verschillen behalve in hun gedrag ten opzichte van verschillende boonensoorten ook in de wijze, waarop hun groei door de temperatuur be'mvloed wordt.
Bij de resultaten van infectie proeven op verschillende boonen-soorten bleek, dat de verschillen in infectievermogen tusschen de stammen ZI en ZII onderling over het algemeen veel kleiner zijn dan htm verschillen met de stammen E en W, (Zie tabel 1 p, 9 en 2 p. 11.) Ook d e verschillen in infectievermogen tusschen de stammen E en W onderling zijn veel geringer dan him ver-schillen met ZI oi Z II. (Zie tabel 1 p. 9 en 2 p. 11.) Een derge-lijke overeenkomst tusschen de stammen ZI en ZII onderling en tusschen de stammen E en W onderling vinden wij terug in de wijze, waarop de groei der stammen door de temperatuur bei'nvloed wordt: ZI en ZII hebben hun optimale groei bij dezelfde temperatuur en de stammen E en W ook.
We kunnen dus concludeeren, dat de stammen ZI en ZII betrekkelijk na aan elkaar verwant zijn en de stammen E en W
onderling ook. Er zijn nog meer feiten, die de juistheid dezer ver-onderstelling staven. De stammen E en W vormen op kersenagar niet veel en los lucht mycelium. Jonge cultures van de stammen
16
E en W zijn niet wczenlijk van elkaar verschillend, De stammen II en III daarentegen vormen veel meer lucht mycelium, dat
een compacte, wollige laag vormt Jonge cultures van de stammen 11 en ZIl zijn ook niet van elkaar te onderscheiden. (Zie plaat 7 en 8.) Een cultuur van de stammen E of W is daarentegen steeds van een cultuur van de stammen ZI oi Z Hie onderkennen
(zie plaat 4 en 5). Uit de groeiwijze op kersenagar blijkt dus, dat de stammen ZI en ZII nauw verwant zijn en de stammen E en W ook,
Een overeenkomstig verschil in groeiwijze wordt gevonden bij het kweeken der stammen op boonenagar (zie plaat 8). Stam E en W zijn ook dan niet van elkaar te onderscheiden en de stammen ZI en ZII onderling ook niet, doch het verschil tus-schen de cultures van de eene groep en die van de andere groep is zeer groot. Er is verschil in hoeveelheid luchtmycelium en in kleur der kolonies. De cultures van de stammen E en W worden spoedig zwart door verkleuring der myceliumdraden en die van de stammen ZI en ZII blijven wit,
LEACH (1923) vermeldt, dat bij zijn proeven de verschillen in groeiwijze van hetzelfde ras bij verschillende temperaturen zoo ^root waren, da:t het niet mogelijk was de groeiwijze der rassen te gebruiken om ze van elkaar te onderscheiden, De platen 4 en 5 doen zien, dat bij onze proeven het verschil in groeiwijze tusschen de rassen E en ZII bij ieder der verschillende temperaturen blijft bestaan.
Uit deze proeven mag geconcludeerd worden, dat de stammen ZI en ZII nauwer verwant zijn met elkaar dan met de stammen E of W en omgekeerd, dat de stammen E en W met elkaar nauwer verwant zijn dan met de stammen Z / of ZII.
Was het mogelijk de cultures van de stammen ZI en Z II te onderscheiden van die van de stammen E en W, het gelukte niet een kenmerk te vinden waardoor cultures van d e ' s t a m m e n E en W van elkaar t e onderscheiden zijn.
Vermoedelijk bestaat er wel een zoodanig verschil tusschen de stammen Z / en Z / / . Verscheidene malen werd n.L geconsta-teerd, dat in de oudere cultures van stam Z / / , gekweekt bij 20°, 25° en 30° C. op kersenagar, het mycelium in het centrum der
cultuur eerder zwart werd dan gelijktijdig, even oude, op gelijke wijze en op dezelfde agar gekweekte cultures van stam Z / (zie plaat 6).
APPENDIX.
Na het afsluiten van het manuscript ontvingen wij nog een publicatie van Dr. BONING (1926), betreffende een onderzoek naar
de identiteit van de door SCHAFFNIT en BONING (1925) bij hun onderzoekingen over de vatbaarheid van boonenvarieteiten ge-bruikte z.g, ,,Bonner Stamm" van Colletotrichum Lindemuthia-num (Sacc. et Magn,) Bri. et Cav. met de rassen a, ft en y van BARRUS (1911 en 1918) en BURKHOLDER (1923) en met de rassen X2, X4 en X8 van LEACH (1923),
BONING verrichtte infectieproeven op boonenpeulen, welke los van de plant geplaatst waren in vochtige kamers en infecteerde
de peulen door het opbrengen van druppels eener sporensuspensie. Veertien dagen na de infectie werden de resultaten genoteerd.
SCHAFFNIT en BONING (1925) vermelden, dat de op deze wijze verrichte infecties een even juiste maatstaf leveren voor de vat-baarheid der boonenvarieteiten als de infecties van planten of van peulen, welke nog aan de plant vastzitten.
Hoewel genoemde infectie-methode geheel van de door ons gevolgde verschilt, meenen wij toch de uitkomsten van de proeven van BONING te kunnen vergelijken met die, welke wij verkregen bij infectie met de stammen Z I, Z II, E en W van een drietal Amerikaansche boonenvarieteiten, die zoowel BARRUS (1918) als BONING (1926) bij hun onderzoekingen gebruikten.
In onderstaande tabel zijn naast elkaar aangegeven: de vat-baarheidsgraad voor de rassen Zlt Z11, E en W; de door
BARRUS (1918) en BURKHOLDER (1923) vermelde vatbaarheid van deze varieteiten voor de rassen a, fi en y en de door BONING
(1926) geconstateerde vatbaarheid voor de ,,Bonner Stamm".
Vatbaarheidsgraad Voor de stammen:.
Boonenvaricteit.
E x t r a Early Refugee , . , Round Pod Kidney W a x . Kentucky W o n d e r . , . . Z /1) 6,5 2,5 9,7 III1) 3,9 2,4 3,3 El) 8,0 2,3 Wl) 5,8 0,2 2,4 ') a. b, a . b . a B C . ,.Bonner S t a m " ») w. h. i.
Uit deze tabel blijkt duidelijk, dat de „Bonner Stamm" niet identiek is met een der rassen Z It Z II, E of W.
l) Vatbaarheidsgraad aangegeven als in tabel 1 p. 9.
2J Door BONING gebruikte aantastingsgraden: i = sehr widerstandsfahig,
AV = widerstandsfahig, h = hoch anfallig."
HOOFDSTUK IL
OVERWINTERING VAN COLLETOTRICHUM LINDEMUTHIANUM IN AARDE.
§ 1. LITERATUUR.
CUNNINGHAM-vermeldt, dat Colletotrichum Lindemuthianum kan overwinteren in aangetaste deelen van de boonenplanten. Verder acht hij het waarschijnlijk, dat de zwam in staat is op organisch materiaal in aarde gedurende eenige jaren te leven en dat van daar uit infectie van boonenplanten kan plaats hebben.
HALSTED (1896) vond, dat wanneer boonen verbouwd werden op grond, waarin het vorige jaar zieke planten stonden, deze 4 tot 6 maal zooveel aangetaste peulen gaven, dan wanneer zij verbouwd werden op grond, waarop nog geen boonen geteeld waren.
In 1897 vermeldt HALSTED dat boonen op grond, waarin een vorig jaar aangetaste planten en peulen ondergebracht waren, meer zieke peulen gaven dan boonen geteeld op grond, waarin heide ondergebracht was,
PFE1FFER (1910) deelt mede, dat de ziekte wel optreedt in jaren, dat elders geen aantasting plaats heeft op die plaatsen, waar men elk jaar boonen verbouwt of waar men het boonenstroo
gelijk met de mest onderploegt.
BARTRAM (1916) vermeldt, dat cultures van Colletotrichum Lindemuthianum op waterhoudende agar door lage temperaturen eerder tot afsterven -gebracht worden dan cultures op uitge-droogde agar. Hij plaatste cultures op verschillende voedings-bodems in een open schuur en vond, dat op gedroogde Lima-boonenagar de zwam van 13 December tot 13 April in leven bleef, Op niet-gedroogde agar waren de cultures op 17 Januari nog in leven, doch op 21 Februari niet meer, De temperaturen, waaraan de cultures blootgesteld waren, waren herhaaldelijk lager dan —10° C. De laagste geregistreerde minimum tempe-raturen bedroegen —13°, —9°, —23°, 19°, 29° 22 8°, - 2 0 , 5 ° , - 1 4 ° , - 2 6 , 6 ° , - 2 6 ° , —23,3° C. De culture's op niet
gedroogde agar waren na het optreden van de temperatuur van —29° C. nog in leven. de cultures op gedroogde agar hebben alle temperaturen kunnen doorstaan.
MUNCIE (1917) vond, dat de zwam kan overwinteren in aan-getast boonenloof en als spore in den grond.
SCHAFFNIT (1920) vermeldt, dat de sporen van aangetaste peulen, die gedurende den winter 1919-1920 buiten bewaard waren, op 12 Februari 1920 nog kiemkrachtig waren.
BARRUS (1921) komt tot de conclusie, dat de zwam in den grond kan overwinteren in aangetast loof en dat sporen, in aarde gebracht, niet langer dan 7 weken in leven blijven. Hij vermeldt niet of de in aarde'gebrachte sporen daar kiemden.
SCHAFFNIT en BONING (1925) meenen, dat de op de peulen gevormde conidien niet voor de overwintering van de zwam geschikt zijn, doch dat eir wel overwintering door middel van in den grond gebracht aangetast boonenloof kan plaats hebben. Zij achten het waarschijnlijk, dat de door de zwam gevormde pycno-sporen bij de overwintering een groote rol spelen. „Die wahr-scheinlich die Stelle von Perithezien vertretenden Pykniden kon-nen andererseits in Ackerboden auf den Ernteriickstanden der Bohnen iiberwinteren und ihrerseits durch Infektion vom Boden her die Infektionsquelle fur das Auftreten der Krankheit bilden", SCHAFFNIT en BONING komen tot deze conclusie naar aan-leiding van proeven met pycniden, die omstreeks half Januari uit een voedingsoplossing genomen werden en na langzaam drogen bewaard werden: a, in een kelder bij 10° C, in met waterdamp verzadigde lucht, b, in het laboratorium in tamelijk droge lucht.
De kiemkracht der pycnosporen van groep b verdween spoedig, reeds eind Februari kiemden ze niet meer. Bij groep a bleven ze langer in leven, Bij de sporen uit deze groep waren er, die begin Juni nog kiemkrachtig waren. Mijns inziens gaan SCHAFFNIT en BONING bij hun conclusies uit deze proeven te ver: er is niet aan-getoond, dat deze sporen buiten en onder de natuurlijke omstan-digheden kunnen overwinteren en zelfs is het geheel niet nage-gaan in hoeverre zij lage temperaturen kunnen verdragen. Wel hebben SCHAFFNIT en B5NING nagegaan bij welke temperatuur onder 0° C. de zwam in cultures afsterft, Zij vermelden, dat het mycelium niet afsterft, wanneer het dagenlang bij een tuur in de buurt van het nulpunt gehouden wordt. Eerst tempera-turen van —3° tot —5° C. dooden het bij langdurige inwerking. Cultures op stijfsel, die 2—3 dagen bevroren gehouden werden, toonden na ontdooien geen -verderen groei. Kortstondig bevriezen
20
(2—3 uur) doodde echter het mycelium niet. Het betrekkelijk spoedig stcrven der cultures bij een temperatuur van —3° tot —5° C. kan m. i. wel veroorzaakt geweest zijn door het gebruik van stijfsel als voedingsbodem. De structuurverandering van dit substraat bij bevriezen is zeer waarschijnlijk de oorzaak van het spoedig afsterven der cultures geweest.
§ 2. EIGEN WERK.
Uit de literatuuropgaven blijkt, dat niet zeker is, of de zwam zonder deelen van boonenplanten in de aarde kan leven, en of zij lage temperaturen verdragen kan,
Om in deze vragen meer inzicht te krijgen, werden volgende proeven genomen: buizen met een steriel mengsel van beuken-bladaarde en zand werden overgoten met eenige c.c. eener sporensuspensie, welke verkregen was door acervuli van stam E, gekweekt op steriele stengels van Vicia faba, te brengen in steriel water,
Aan de bladaarde werd op deze wijze geen deelen van boonen toegevoegd,
De op deze wijze behandelde buizen werden 4 dagen bij 17° C. geplaatst. Na deze 4 dagen was macroscopisch mycelium-ontwik-keling waar te nemen, De aarde was toen geheel met mycelium doorgroeid. Vervolgens werd een deel der cultures bij verschillen-de temperaturen in thermostaten in een koelkelverschillen-der, een anverschillen-der deel buiten geplaatst,
Geregeld werd nagegaan of de zwam nog in leven was, door aarde uit de buizen op boonenagar in Petrischalen te brengen.
De buizen werden met de sporen suspensie overgoten 12 Novem-ber 1923 en op 16 NovemNovem-ber werden ze gebracht:
groep I in een thermostaat bij 20° C;
TT o o p ,
i» ± x »i n «i »» « ^ " j
it HI „ ,, koelkelder, waarin de temperatuur overdag daalde van —2° C. tot —7° C, en 'snachts opliep van — 7 ° C , tot —2° C ;
VI werd buiten geplaatst onder een afdak, open naar de Z.W,- en de N.O.-zijde. De cultures stonden be-schut tegen regen en sneeuw.
Gedurende de proefperiode daalde de temperatuur buiten meerdere malen beneden 0° C. Op een, op korten afstand van de plaats, waar de cultures bewaard werden, gelegen terrein werd
geregistreerd, dat de temperatuur op 88 etmalen korteren of langeren tijd beneden het nulpunt was; op 33 dagen was de temperatuur lager dan —5° C , op 12 dagen lager dan —7° C, en op 5 dagen lager dan —10° C, De laagste temperatuur werd geregistreerd op 31 December 1923, deze bedroeg —16° C.
Op de volgende data was de temperatuur geregeld onder 0° C : 25—28 Nov. (min. temp. —5°); 30 Nov.—2 Dec. (min, temp. —6,6°); 19—22 Dec. (min. temp. —6°); 25 Dec—9 Jan. (min. temp. —16°); 14—18 Jan. (min. temp. —9°); 23—27 Jan. (min. temp. —6,1°); 11—18 Febr. (min. temp. —9,1°); 27—29 Febr. (min. temp. —8°), terwijl zij van 4—21 Maart iederen nacht onder 0° C. daalde. Deze gegevens werden ons welwillend door Professor Dr. D. VAN GULIK verstrekt.
De resultaten van deze proef zijn weergegeven in tabel 5. Telkens werd van twee buizen nagegaan of de zwam nog in leven was.
TABEL 5. Overwintering van C
Bewaarwijze Gecontroleerd n a : i Groep I . . . « n „ HI . . . . „ IV . . . . 3
•f
+
+
-H 6+
+
+
+
olletotrichum Lindemuthianum op 10+
+
+
+
17+
+
+
+
27+
+
+
+
62+
+
+
+
68+
+
+
+
80+
+
+
+
132+
+
+
+
blaiaarde. 155 dagen."f
+
*) *)Uit tabel 5 blijkt, dat de zwam onder de meest verschillende omstandigheden op bladaarde kan blijven leven. Dat de cultures uit groep IV, die buiten overwinterd hebben, na de extreem koude winter van 1923—'24 nog in leven waren, maakt het zeer waar-schijnilijk, dat de zwam in het Hollandsche klimaat in aarde, saprophytisch levende, kan overwinteren. Over het algemeen kunnen organismen zeer slecht een herhaald bevriezen en weder ontdooien verdragen, doch hier hebben de cultures van groep IV een dergelijke geregelde schomme'ling in temperatuur, zooals die aan het einde van de bewaarperiode optrad (de nachtvorsten van 4—21 Maart met hooge temperatuur overdag) zonder schade
ver-dragen.
Verder werd nagegaan, hoe lang-een temperatuur van —15° C,
22
tot —20° C.f een temperatuur, die in Nederland in den grond
zeer zeldcn optreedt, verdragen kan worden,
Voor deze proef werden gebruikt cultures uit de groepen I. II, III en IV van de vorige proef.
De buizen werden in metalen kokers opgehangen op eenige diepte onder de vloeistofspiegel van de pekel eener koelinrich-ting, De temperatuur bedroeg overdag —19° a —20° C, en steeg in den nacht tot —15°C, Na 2, 4, 6, 8 en 10 dagen werd nagegaan of de zwam nog leefde,
Tabel 6 geeft de resultaten van deze proef.
TABEL 6, Aan-tal cul-tures. 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 Voorbehandeling. Aantal dagen bij -15°-20° C. 80 dagen groep I (20°) 80 80 80 80 80 80 80 80 80 80 80 80 80 80 80 80 80 80 80 II (2°). III(-2°tot-7°) IV (buiten) I II III IV I II III IV I II III IV I . II III IV 2 2 2 2 4 4 4 4 6 6 6 6 8 8 8 8 10 10 10 10 Resul-taat over-enting.
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Aantal dagen, waarin na de over-enting acervuli gevormd worden. 6 6 6 6 ') ') 6 7 6.5 6,5 7 7 6,5 7 7 7 8 7 Gemid-deld aantal dagen. 6,5 6,9 7,25Uit tabel 6 blijkt, dat de temperatuur van —15° C, tot —20° C. £oed werd verdragen. De duur van bewaring bij dezc temperatuur bleek invloed uit te oefenen op de tijdsduur, die de zwam noodig heeft om, na het overenten van bladaarde op boonenagar, acervuli te vormen en wel zoo, dat bij langere bewaring bij —15° C.— —20° C. langeren tijd voor acervulus-vorming noodig is.
We kunnen^ de resultaten dezer proeven als volgt samen-vatten:
Colletotrichum Lindemuthianum kan 5 maanden lang, onder de meest verschillende omstandigheden op bladaarde leven.
Cultures van Colletotrichum Lindemuthianum op bladaarde kunnen 132 dagen bij een temperatuur van —2° C, tot —7° C. bewaard worden, zonder af te sterven.
Een bewaring van 80 dagen bij een temperatuur van —2° C. tot —7° C, gevolgd door 10 dagen plaatsen bij —15° C, tot —20° C, is niet in staat de zwam, gekweekt op bladaarde, te dooden,
Langere bewaring bij een temperatuur van —15° C. tot —20° C. heeft de strekking den duur, welke de zwam voor sporevorming op daarvoor geschikt substraat noodig heeft, te vergrooten.
HOOFDSTUK III,
PERITHECIUM VORMING.
2)
§ 1. LITERATUUR.
FRANK (1883) heeft zonder succes getracht bij Colletotrichum Lindemuthianum perithecien te verkrijgen door aangetaste peulen buiten te laten hangen gedurende den winter of door deze in den grond te begraven.
Ook Miss STONEMANN (1898) was niet in staat bij Colleto-trichum Lindemuthianum perithecien te yinden.
SHEAR en WOOD (1907) zijn de eersten, die vermelden bij Colletotrichum Lindemuthianum perithecien gevonden te hebben. Zij leggen er vooral den nadruk op, dat het bepaalde stammen zijn, die de eigenschap tot peritheciumvorming bezitten en dat, wanneer men een zoodanige stam in cultuur heeft, voedingsbodem en uitwendige omstandigheden weinig invloed op het ontstaan van perithecien uitoefenen.
Als meest voor peritheciumvorming geschikte voedingsbodem wordt maismeelagar genoemd. SHEAR en WOOD zeggen (p. 262):
,.We have found by repeated experiments that if a culture from any particular acervulus or group of averculi does not produce an asCogenous stage on corn meal at 75° tot 85° F, it is useless to experiment further with the material from the same source. Fresh material from other specimens must be tried until a race, strain or generation is found which will product its ascogenous form",
Een beschrijving van den vorm en de afmetingen der perithe-cien en der ascosporen ontbreekt, evenals een bewijs, dat asco-gene stammen, welke van boonenpeulen gei'soleerd waren, werke-lijk stammen van Colletotrichum Lindemuthianum zijn.
Naar aanleiding van de resultaten van SHEAR en WOOD (1907) zegt EDGERTON (1908), dat het misschien mogelijk is, dat een enkele maal een a.ppel-Colletotrichum, welke tot perithecium-vorming in staat is, op boon voorkomt, doch dat niet uit te maken is, of dit het geval geweest is door het ontbreken van een be-schrijving van de cultures in het werk van SHEAR en WOOD.
p Het in dit hoofdstuk behandelde onderzoek kon niet geheel
afge-werkt worden. De verkregen resultaten worden echter gepubliceerd, daar zi, eemge aanwtjzmgen voor verder onderzoek kunnen leveren
In-een meer uitvoerige publicatie in 1913 deelen SHEAR en WOOD mede, hoe het hen gelukt is van Colletotrichum Linde-muthianum perithecien te verkrijgen.
Met het oog op het groote belang van deze mededeeling laten wij haar hier in haar geheel vol gen:
„Numerous cultures of the bean anthracnose have been made at different times and in different seasons. The cultures from conidia in most cases have been rather uniform in appearance and behavior, agreeing with the descriptions given by Atkinson, Whetzel, Edgerton, and others. In 16 slant agar tubes made November 3 from different acervuli on 5 bean pods the growth soon became very dark colored. This appears to be quite a con-stant characteristic of this species, and all the cultures made were practically identical in appearance during their growth. No peri-thecia were produced in the cultures.x)
The acervuli varied greatly in number and size in different cultures and setaef though usually present, were not numerous.
Many chlamydospores were also found in some cultures. Cultures from single conidia, showing the usual appearance of the fungus, are shown in Plate VIL
In December cultures were made in flasks of corn meal by transfer of conidia and a bit of tissue^ from a bean pod bearing acervuli of the bean-anthracnose fungus, later, all of the flasks showed good perithecia and asci, but conidia were scarce or wanting. An ascus and ascospores are shown in Plate I, figures 13 and 13a. These cultures became finally contaminated and were discarded. Plates were previously made from them, using the crushed perithecia and asci. The ascospores germinated readily and produced a dense growth of mycelium of the usual appearance. No conidia were found in these plates.a)
Other plates poured from the same ascospore material produced the same typical mycelial growth; and at the end of 12 days perithecia were present in great numbers, but no conidia were found.1) Other plates were poured on March 16. A single
ascospore transferred to a tube and afterwards to a flask of corn meal produced the usual growth of mycelium; and on April 3 an abundance of perithecia with mature asci were present, but no conidia were seen. *)
26
This is the only case in the writers' experience with these organisms in which cultures made from ascospores have produced no conidia or if they were formed they were so few in number
that they escaped observation. It does not appear, however, that there can be any doubt about these perithecia belonging to the bean anthracnose/ The cultures were originally started from the conidial form on a bean pod and conidia were found in the first cultures with the perithecia- The perithecia, asci, and all the morfological characters of the fungus agree with Glomerella, as will be observed by comparing Plate I, figures 13 and 13a, and also the measurements of conidia and ascospores. The fact that
conidia were few in the original culture and wanting in others apparently shows only an extreme variation in this particular, as cultures from different hosts have shown a great degree of varia-bility in respect to the relative abundance of the different spore
forms in any race or strain, and there seems to be a general tendency on the part of cultures from ascospores to produce fewer conidia than do those which originate from conidia
In one other series of cultures from conidia, from a bean a few small peritheciumlike bodies were found at the edge of the culture, but no asci or ascospores were obtained.
The appearance and behavior of this organism in cultures, as well as the failure of cross-ionculation experiments, apparently
shows it tot possess sufficiently well-marked characteristics to justify its separation as a distinct species, though the perithecial form taken alone could be distinguished with great difficulty, if at all, from that obtained from other hosts. It is tentatively named Glomerella Lindemuthiana." (SHEAR and WOOD 1913: 46—47).
Verder spreken deze auteurs het vermoeden uit, dat voor de peritheciumvorming in het geslacht Glomerella het blijkbaar niet noodig is, dat bevruehting of kernversmelting van twee
verschil-lende individuen plaats heeft, De eventueel optredende kern-fusies moeten plaats hebben tusschen kernen van hetzelfde indi-vidu, daar ook een-spore cultures rijkelijk perithecien vormden.
De resultaten van SHEAR en WOOD mogen niet zonder critiek aanvaard worden.
Het is niet zeker, dat de cultures, waarin zij perithecien vonden, cultures van Colletotrichum Lindemuthianum waren. Zij hebben
deze cultures verkregen door enten van conidien en aangetast weefsel van een zieke peul op een voedingsbodem. Men is er blijkbaar van uitgegaan, dat de op zoodanige wijze verkregen „ruw-cultuur" een cultuur van Colletotriqhum Lindemuthianum was. Dat dit niet het geval behoeft te zijn, blijkt uit een onderzoek van EDGERTON (1915, p. 254—256). Deze heeft van aangetaste boonenpeulen ascogene Colletotrichum stammen geisoleerd, welke tot de soort Glomerella cingulata behoorden.
EDGERTON zegt dan ook met betrekking tot de resultaten van SHEAR en WOOD: „As SHEAR and WOOD performed no inocula-tion experiments with their ascogeneus culture to prove patho-genicity, it seems more reasonable to suppose that they had a culture of Glomerella that was accidental on the bean and was not the true bean anthracnose fungus itself/' (EDGERTON 1915, p. 256). Ook is het mislukken van kruisinfecties op vruchten eii andere gewassen bij de proeven van SHEAR en WOOD geen bewijs, dat hun perithecien-vormende stam Colletotrichum Lindemuthi-anum was. Die kruisinfecties zijn gedaan o. a. met conidien van reincultures. Reincultures van de perithecien produceerende stam leverden geen conidien, zooals de auteurs met nadruk betoogen, dus de conidien van reincultures gebruikt voor kruisinfecties waren van niet-ascogene stammen afkomstig. Ook zijn geen kruis-infectieproeven gedaan > met conidien van de peul, waaruit de ascogene vorm geisoleerd is.
Het ontbreken van infectieproeven met de ascogene vorm op boonen en het eveneens ontbreken van kruisinfecties met deze stam op appels en andere vruchten maakt, dat in het geheel niet aangetoond is, dat de door SHEAR en WOOD gei'soleerde Glome-rella identiek is met Colletotrichum Lindemuthianum.
KRUGER (1913) beschrijft, hoe hij op allerlei manieren getracht heeft Colletotrichum Lindemuthianum tot peritheciumvorming te brengen: door het plaatsen van cultures in het licht en in het donker, door gebruik te maken van warmte en koude, door ze op rijke en arme voedingsbodems te kweeken, door droog of nat substraat te gebruiken, door toevoeging van bepaalde bacterien aan de cultures. Het gelukte echter niet perithecien te
verkrijgen-Hij schrijft het niet optreden van perithecien in zijn cultures toe aan de mogelijkheid, dat hij met stammen gewerkt heeft, die niet het vermogen hebben een hoogere vruchtvorm te produceeren, Toch schakelt hij de mogelijkheid niet uit, dat SHEAR en WOOD
28
inderdaad perithecien bij Colletotrichum Lindemuthianum ge-vonden hebben en bij de vaststelling van de nomenclatuur van de zwam handhaafd KRUGER de naam Glomerella Lindemuthiana Shear n. comb. *
EDGERTON (1915) toont aan, hoe hij enkele malen uit d e vlekken van aangetaste boonen Glomerella species gei'soleerd heeft, die ascogeen waren. Deze bleken bij het kweeken bij
ver-schillende temperaturen een gelijke groeicurve te leveren als Glomerella cingulata. Deze Glomerella species leefden blijkbaar saprofytisch in de door Colletotrichum Lindemuthianum aange-taste plekken der boonen,
Uit het in het bovenstaande aangehaalde citaat (zie p. 27) is wel gebleken, dat EDGERTON ten zeerste betwijfeld of SHEAR en WOOD perithecien van Colletotrichum Lindemuthianum rfezien hebben. EDGERTON zelf heeft ze in de honderden cultures, die hi] onderzocht nooit waargenomen en hij concludeert:
„It is doubtful if the perithecial stage of Colletotrichum Lin-demuthianum, the fungus causing bean anthracnose, has ever been seen".
HEMMI (1920) vermeldt nooit perithecien van Colletotrichum Lindemuthianum te hebben gevonden.
SCHAFFNIT (1920, 1922) zegt, dat hij ondanks jaren lang onder-zoek noch in cultures noch op buiten overwinterde aangetaste peulen perithecien gevonden heeft.
Ook SCHAFFNIT en BONING (1925) kornen tot dit zelfde resul-taat en zij vinden, dat na de vele negatieve uitkomsten van de onderzoekingen over de perithecium vorming bij Colletotrichum Lindemuthianum het niet gerechtvaardigd is deze zwam tot het
geslacht Glomerella te rekenen.
§ 2. EIGEN ONDERZOEK.
In culturen van stam Z 7 op boonengelatine werden in October 1923 ongeveer bolvormige lichamen waargenomen, die bestonden int een wandlaag van bruingekleurde cellen schijnbaar zonder mhoud, ongeveer 10 „ breed, die een holte, gevuld met
proto-d i Z ! T T l 0 ° S m y C e l i u m« ° ^a v e n- Deze mycelium
draden waren 4 — 5,5 /* breed
6 e L s t ^ Z d T 7 T l i t U c h a a mP ie s 'Sevonden in cultures van
Ook ontstonden ze aan de rand en diep in de agar van cul-tures op boonenagar.
Steeds traden deze lichamen op in oudere cultures,
Deze lichamen waren geen pycniden, daar geen pycnosporen gevonden werden.
Met behulp van met de microtoom gesneden coupes werd ge-tracht een inzicht te krijgen in de bouw en de aard van de gevonden lichamen, Het materiaal werd gefixeerd in Gilson's fixing liquid 1) en de coupes (4—6 /J) dik werden gekleurd in
Haidenhain's haematoxyline. De vorm der lichamen was bolrond tot min of meer peervormig. Binnen de wandlaag van wijde, bruingeel gekleurde cellen lag een nauw aaneensluitend weefsel van ongeveer evenwijdig loopende myceliumdraden, welke een holte omsloten. In deze holte lagen hyphen, welke groote
over-eenkomst vertoonden met jonge asci, (Zie plaat 16.) Deze hyphen waren ongeveer cylindrisch en in vele gevallen kon worden waar-jgenomen, dat zij meerdere kernen bevatten. Nooit waren meer
dan 8 kernen per hyphe aanwezig. Het ligt voor de hand om aan te nernen, dat de gevonden lichamen jonge perithecien zijn- De vorm en de inwendige bouw, het ontbreken van pycnosporen en het meerkernig zijn der op asci gelijkende hyphen doen
vermoe-den, dat we hier te doen hebben met een ascogene vorm van de zwam, waarbij de asci en de ascosporen niet tot volledige ontwik-keling zijn gekomen.
Hoewel hier niet bewezen is, dat we werkelijk met de ascogene vorm van de zwam te doen gehad hebben, willen wij deze naam toch in het onderstaande gebruiken om verwarring met pycniden t e voorkomen.
Hoeveel moeite hiervoor ook gedaan is, het is nooit mogen gelukken de ,,ascogene vorm" tot een verder
ontwikkelings-stadium dan het hierboven beschrevene te brengen. Ook dit is er een aanduiding voor, dat de waargenomen lichamen geen pycni-den waren. In pycnipycni-den zijn reeds bij zeer jonge stadia de pycno-sporen waar te nemen en ook kon bij jonge pycniden, die uit de cultuur, waarin zij ontstaan waren overgeent werden, waarge-nomen worden, dat zij tot volledige ontwikkeling kwamen, '.
Dit uitblijven van de verdere ontwikkeling bewijst reeds, dat
l) GlLSON's fixing liquid: 42 cc alcohol 9 6 % , 60 cc water, 18 cc ijsazijn,
2 cc gcconcentrcerd salpeterzuur, 11 cc eener verzadigde sublimaat oplossing. " 6—24 uur fixeeren en daarna tritwasschen in 7 0 % i g e alcohol.
30
de ,,perithecien" geen pycniden waren. Bij de om tot dit doel te geraken verrichte onderzoekingen bleek, dat de ouderdom van de cultures invloed uitoefende op het optreden van de perithecium-achtige lichamen. De „ascogene vorm" trad op wanneer de cultu-res op boonenagar in cultuurbuizen ongeveer 2 % maand oud waren.
Verder bleek, dat behalve de ouderdom der cultures, het licht op het optreden van perithecium-achtige lichamen veel invloed uitoefent en wel zoo, dat plaatsing der cultures in het licht het optreden van de ascogene vorm bevordert,
Dit blijkt uit het resultaat van de volgende proef.
Op 3 December 1923 werden 10 een-spore cultures van stam E op boonenagar in cultuurbuizen in het voile licht en 10 cultures in hetzelfde vertrek, onder overigens geheel dezelfde omstandig-heden, in het donker geplaatst, bij een temperatuur van 16° C.
Op 15 Februari 1924 hadden alle 10 in het licht geplaatste cultures perithecium-achtige lichamen gevormd, terwijl in de, in het donker geplaatste, cultures dit niet het geval was. Van deze laatste waren op 15 Maart 1924 slechts in 2 cul-tures enkele op perithecien gelijkende lichamen te vinden. In April 1924 werd deze proef herhaald met een grooter aantal cul-tures en werd hetzelfde resultaat verkregen. Drie maanden na het inzetten van de proef hadden 28 van de 30 in het licht geplaatste cultures en 3 van de 30 in het donker geplaatste cultures perithe-cium-achtige lichamen gevormd.
In October 1925 werd dezelfde proef nog eens genomen, met dezelfde stam E der beide vorige proeven, doch nu traden noch in de in het licht geplaatste cultures, noch in de in het donker geplaatste cultures perithecium-achtige lichamen op. Daar de innchtmg yan deze proef geheel gelijk was aan die der vorige, kan men uit het niet optreden van perithecium-achtige lichamen i n d e cultures van October 1925 concludeeren, dat, behalve de nv oed van he hcht en van de ouderdom der cultures nog meer factoren het optreden van de „ascogene" vorm beinvloeden
In een geval werd gevonden, dat in een cultuur, waarin toe-valhg een houtsplinter in de voedingsbodem aanwezig was, d e peritheaum-achtige lichamen zich tegen deze splinter vormden bij de perithecmmvormmg van Glomerella cingulata afkomstie"
van getracht Colletotrichum Lindemuthianum tot peritheciumvor-ming te brengen door in de voedingsbodem harde deelen zooals filtreerpapier, wattenvezels en houtsplinters te brengen. In geen enkel geval kon echter toename in aantal der perithecium-achtige lichamen geconstateerd worden.
