De bepaling van phosphatiden in karnemelk

R I J K S L A N D B O U W P R O E F S T A T I O N H O O R N

DE BEPALING VAN PHOSPHATIDEN IN KARNEMELK

DOOE

H . M U L D E R (Ingezonden 31 Augustus 1942)

LITERATUUROVERZICHT

Over h e t bepalen v a n h e t phosphatidegehalte van zuivelproducten is reeds veel geschreven en er zijn verscheiden m e t h o d e n voor aanbevolen. Men is h e t echter niet eens geworden over de bruikbaarheid v a n de metho-den, terwijl er verschil v a n meening b e s t a a t over de hoeveelheid Phospha-tiden die in zuivelproducten voorkomt.

D e m e t h o d e n k u n n e n niet worden getoetst door ze toe te passen op zelfgemaakte suspensies v a n Phosphatiden, b . v . v a n lecithine, in water, o m d a t niet bekend is welke Phosphatiden in melk voorkomen en in welken vorm ze aanwezig zijn. H e t is ook niet practisch uitvoerbaar om de Phosphatiden in een zuiveren toestand of aan een specifiek reagens gebon-den af te scheigebon-den en te wegen. De Phosphatigebon-den onderscheigebon-den zich vooral van andere vetachtige stoffen en van vetten, doordat ze phosphor b e v a t t e n . H i e r v a n m a a k t m e n bij de analyse meestal gebruik. De Phosphatiden worden m e t behulp van geschikte oplosmiddelen uit de melkproducten geëxtraheerd, waarna in h e t extract een phosphorbepaling wordt uitgevoerd. U i t h e t phosphorgehalte wordt h e t gehalte aan Phosphatiden berekend.

a. De berekening van het phosphatidegehalte naar aanleiding van

phosphor-bepalingen

De bepaling v a n h e t phosphorgehalte v a n de „ P h o s p h a t i d e n " levert geen principieele moeilijkheden op. H e t is echter niet mogelijk om uit het cijfer voor h e t phosphorgehalte de hoeveelheid Phosphatiden op een volkomen juiste wijze te berekenen. Melkproducten b e v a t t e n n.1. niet één phosphatide, doch een mengsel v a n dergelijke stoffen. Zoo heeft m e n gemeend twee monoaminophosphatiden (lecithine en cephaline) en een diaminophosphatide (sphingomyeline) aan te k u n n e n toonen. M e t zeker-heid is h e t voorkomen van deze stoffen in melk echter niet bewezen

(1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ) . Voor de verhouding, waarin deze stoffen n a a s t elkaar voorkomen vindt m e n in de literatuur sterk uiteenloopende cijfers. B I S C H O F F (4) b . v . zegt, dat lecithine en cephaline in de verhouding 2 : 1 aanwezig zijn; SASAKI (37) en HIEATSÜKA noemen de verhouding 1 : 2 , 3 3 ;

volgens K O C H en W O O D S (22) m o e t dit zijn 1 : 1 en volgens R E W A L D (35)

1,4 : 1. KURTZ (23) vond voor de verhouding: lecithine : cephaline : sphin-gomyeline, 8,4 : 4,5 : 1. Behalve over de verhouding, waarin de verschil-lende Phosphatiden n a a s t elkaar voorkomen, verschilt m e n v a n meening

(1) C 71

over de samenstelling van deze stoffen zelf. Volgens de meeste onderzoekers b.v. is lecithine een onverzadigde verbinding, hoewel m e n h e t er niet over eens is welke vetzuurresten in het lecithinemolecuul voorkomen; sommigen echter zeggen, dat lecithine geen dubbele binding bevat. H e t lijkt niet onmogelijk, d a t de Phosphatiden, die in melk worden gevonden, evenals natuurlijke v e t t e n een wisselende samenstelling hebben en dat ze bovendien niet altijd in dezelfde verhouding naast elkaar aanwezig zijn. Dit m a a k t h e t echter onmogelijk om uit een phosphorbepaling het gehalte aan Phos-phatiden nauwkeurig te berekenen. Dikwijls heeft m e n zich uit de moeilijk-heid gered door aan te n e m e n , dat er slechts één phosphatide in melk voorkomt en d a t dit distearyllecithine is, d a t ca 3,84 % P b e v a t (b.v. CHAPMAN (10) ; B I E D , BREAZEALE en SANDS (2, 3 ) . H O R R A L L (20) ging van de veronderstelling uit, d a t alles stearoöleolecithine is; deze verbinding bevat 3,86 % P . Anderen veronderstelden bij h u n berekening, dat er behalve lecithine ook cephaline in m e l k aanwezig is en d a t de beide stoffen in een onderlinge verhouding 1 : 1 voorkomen (b.v. W R I G H T , H o l m en DEYSHER

( 1 8 ) ) ; ze berekenden een gemiddeld phosphorgehalte van bijna 4 % . Ook schijnen sommige onderzoekers eenvoudigheidshalve een phosphorgehalte van 4 % te hebben aangenomen. D a a r we vrij zeker te doen hebben m e t een mengsel van lecithine en cephaline, en sphingomyeline, dat volgens eenige literatuuropgaven ook aanwezig is, eveneens ca. 4 % phosphor bevat,

lijkt de veronderstelling, dat de Phosphatiden van de melk gemiddeld 4 % phosphor bevatten, wel te verdedigen. Volgens een recente mededeeling van

H I L D I T C H en MADDISON ( 2 1 ) , die tegenwoordig voor ons niet toegankelijk is, bevatten de melkphosphatiden vrij veel hoogere vetzuren, zoodat h e t niet onmogelijk is, dat het phosphorgehalte iets lager dan 4 % zal zijn.

E e n andere groep onderzoekers, o.a. M O H R en Moos (27), berekent geen phosphatidegehalte, doch vermeldt alleen h e t r e s u l t a a t van de phosphor-, bepaling. Ofschoon dit wetenschappelijk juist is, is h e t toch min of meer een ontvluchten van de moeilijkheid, terwijl men bij sommige onderzoekin-gen weinig aan het phosphorgehalte heeft en beslist het phosphatidegehalte m o e t kennen.

b. Het extraheeren van de Phosphatiden

D e bepaling van h e t phosphatidegehalte wordt geheel onzeker, o m d a t niet bekend is op welke wijze deze stoffen kwantitatief u i t melk k u n n e n worden afgescheiden, zonder dat andere phosphorverbindingen mede worden afgezonderd. D e Phosphatiden, die zoowel hydrophobe als hydro-phiele eigenschappen hebben, komen n.1. in melk in een gehydrateerden vorm voor. Men kan deze verbindingen daardoor niet m e t een uitgesproken hydrophoob oplosmiddel extraheeren en loopt gevaar om bij de extractie andere hydrophiele phosphorverbindingen mee te extraheeren. Men m o e t dus een oplosmiddel kiezen, d a t voldoende hydrophiel is om de Phospha-tiden op t e lossen, m a a r d a t ook weer voldoende hydrophoob is om h e t oplossen van andere phosphorverbindingen, zooals phosphaten, t e voor-komen. Men heeft op verscheiden manieren getracht deze moeilijkheden op t e lossen.

1. Extractie van gedroogde -producten

Teneinde t e voorkomen, d a t t e zamen m e t de Phosphatiden o.a. anor-ganische phosphor wordt afgescheiden, gingen sommige onderzoekers van melkpoeder uit, om geen water bij de extractie aanwezig t e hebben ( S C H M I D - M Ü H L H E I M ( 4 0 ) ; SASAKI ( 3 7 ) ; B I S C H O F F ( 4 ) ; DIEMAIR, BLBYER en OTT ( 1 2 ) ; E E W A L D ( 3 5 ) ) . Anderen gingen de melk vóór de extractie drogen. Als droogmiddel werden o.a. gebruikt: gips ( S U P P L É E (41) en CÜSICK ( 9 ) )

en n a t r i u m s u l f a a t ( H O L W E R D A ( 1 9 ) ) . BÜRUIANA en FURTUNESCO (7) droogden

de melk op zand bij 105° C. W e e r anderen (OSBORNE en WAKEMAN (30, 3 1 ) ) precipiteerden de eiwitten van. d e melk; volgens h e n worden de Phospha-tiden door de geprecipiteerde eiwitten vastgehouden. H e t neerslag werd door h e n gedroogd en vervolgens m e t een organisch oplosmiddel, b . v . chloroform, aether, alcohol of een mengsel hiervan geëxtraheerd. Ook wel liet m e n melk druppelen bij een mengsel v a n alcohol en aether, waaraan wat azijnzuur was toegevoegd. D e Phosphatiden losten d a n op in h e t alcohol-aether-mengsel; d i t werd door filtreeren v a n eiwitten bevrijd, bij een lage t e m p e r a t u u r t o t een dikke stroop ingedampt, daarna aangewreven m e t watervrij natriumsulfaat en t e n s l o t t e geëxtraheerd m e t een aether-alcohol-mengsel of m e t chloroform (BRODRICK-PITTARD (8) ; M O H R , BROCK-MANN en M Ü L L E R ( 2 8 ) ) . BORDAS en KACSKOWSKY (5) en DORNIC en D A I R E (13) volgden een soortgelijke extractiemethode; ze extraheerden de melk m e t alcohol en de droogrest v a n de verkregen alcoholische oplossing m e t een mengsel v a n alcohol en aether. BUROW (6) droogde de stroopachtige massa niet m e t natriumsulfaat, doch extraheerde h a a r zonder meer. MOHR en Moos (27) zetten h e t alcoholische extract v a n de melk op watervrij natriumsulfaat t e drogen en gebruikten d e oplossing d a n zonder meer voor de phosphorbepaling.

Herhaaldelijk ziet m e n in de literatuur h e t vermoeden uitgesproken, d a t een t e intensieve droging de oorzaak k a n zijn van een onvolledige e x t r a c t i e v a n de P h o s p h a t i d e n ( H E S S en H E L M A N ( 1 7 ) , B I R D en SANDS ( 2 ) , GROSZFELD en WALTER ( 1 6 ) ) . Bewijzen hiervoor zijn echter niet geleverd. Wel is gebleken, d a t een deel van de Phosphatiden door stukjes droog eiwit k a n worden ingesloten, zoodat h e t niet toegankelijk is voor d e extractiemiddelen. HOLWERDA (19) wees e r op, d a t de Phosphatiden n a een al t e rigoureuse droging slecht in een mengsel van alcohol en aether, doch uitstekend in petroleumaether of chloroform oplossen. BÜRUIANA en FURTUNESCO moesten bij de afzondering v a n de Phosphatiden u i t melk, die bij 105° C op zand was gedroogd, iets langer extraheeren d a n normaal, m a a r ondervonden verder geen moeilijkheden. Z e gebruikten n a elkaar alcohol en aether als oplosmiddelen.

2. Extractie langs natten weg

Mede u i t vrees voor een nadeeligen invloed van h e t drogen geven velen d e voorkeur aan een extractie langs n a t t e n weg. Als extractiemiddel is heel veel gebruik g e m a a k t v a n een mengsel van alcohol en aether. D e verhouding, waarin deze stoffen worden gemengd, en de verhouding van de totale hoeveelheid extractiemiddel t o t d e hoeveelheid t e extraheeren

melk zijn van veel belang. Tot op zekere hoogte k a n m e n de hoeveelheid „extraheerbare p h o s p h o r " n a a r wensch wijzigen door die verhoudingen anders t e nemen. Bij gebruik van veel alcohol vindt m e n veel „extraheer-bare p h o s p h o r u s " , bij gebruik van veel aether daarentegen weinig. H e t is dan ook niet te verwonderen, d a t m e n m e t de n a t t e wijze van extraheeren zulke uiteenloopende resultaten heeft gekregen. I n de eerste plaats lossen, zooals HOLWERDA aantoonde, in alcohol-aether-mengsels gemakkelijk phosphorverbindingen, die geen Phosphatiden zijn, op. Verder k u n n e n bij aanwezigheid van veel alcohol en water anorganische phosphorverbindingen oplossen. HOLWERDA kon b.v. in h e t volgens MOHR en Moos op natrium-sulfaat gedroogde extract (100 dln melk, 100 din alcohol-aether 3 : 1 ) een hoeveelheid anorganische phosphor, overeenkomende m e t 0,1—0,15 % phosphatide, aantoonen. D e genoemde Duitsche onderzoekers vonden dan ook een onwaarschijnlijk hoog gehalte aan Phosphatiden; in melk 0,49 % en in ondermelk 0,48 % . GRAHAM en KAY (15) gebruikten hetzelfde extractiemiddel als MOHR en Moos, doch n a m e n meer van h e t mengsel t e n opzichte van de t e extraheeren hoeveelheid m e l k ; ze extraheerden 1 cm3 melk m e t 49 cm3 vloeistof. Zooals is t e verwachten, vonden ze minder „ p h o s p h a t i d e " d a n MOHR en M o o s ; volgens hen bevat melk 0,1—0,32 % phosphatide. E e n soortgelijke m e t h o d e werd door o.m. KOCH en W O O D S (22), BLOOR ( 1 ) , H E S S en H E L M A N ( 1 7 ) , H O L M , W R I G H T , D E Y S H E R

(18) en BURUIANA en FURTUNESCO (7) gevolgd. Bij al deze m e t h o d e n lost er een grootere of kleinere hoeveelheid phosphorverbindingen, die geen Phosphatiden zijn, op. Ook is door sommige onderzoekers getracht bij de extractie geen alcohol te gebruiken en dus alleen m e t aether te extraheeren. H e t bleek echter, dat niet alle aanwezige phosphatide in de aether over-ging; volgens TAYEAU n e e m t aether ongeveer 70 % v a n de aanwezige Phosphatiden op. Men heeft dit op verschillende manieren willen ver-klaren. Dikwijls werd aangenomen, d a t de Phosphatiden in melk aan eiwit zijn gebonden en d a t de extractie uit deze verbindingen door de aan-wezigheid van alcohol mogelijk wordt g e m a a k t (OSBORNE en WAKEMAN (30) ;

PALMER en W I E S E ( 3 3 ) ; L O B S T E I N en FLATTER ( 2 4 ) . MACHEBOEUF en SANDOR (26) n e m e n aan, dat alcohol dehydrateerend op h e t phosphatide of even-tueel op de phosphatide-eiwitverbinding werkt, tengevolge waarvan het van zijn w a t e r m a n t e l beroofde phosphatide toegankelijk wordt voor de aether en opgelost kan worden. De verklaring van HOLWERDA is minder duidelijk; ze n e e m t aan, d a t een sterk dehydrateerende stof als droge aether, de gehydrateerde Phosphatiden niet gemakkelijk zal kunnen oplossen. I n plaats van alcohol gebruikte TAYEAU (42) een zeepoplossing om h e t phosphatide in een extraheerbaren vorm t e brengen. E v e n m i n als m e t b e h u l p van aether alle Phosphatiden u i t melk k u n n e n worden geëxtraheerd, lossen deze verbindingen alle op in alleen alcohol (o.a. R E W A L D ( 3 5 ) , FURTUNESCO en BURUIANA ( 7 ) .

Verscheidene onderzoekers hebben voor h e t afscheiden van de Phos-phatiden uit melk gebruik gemaakt van de vetextractiemethode van E Ö S E G O T T L I E B . Volgens P E T E R S E N en H E R R E I D ( 3 4 ) , THURSTON en P E T E R -SEN (43) en HORRALL (20) k a n volgens deze extractiemethode vrijwel alle aan melk toegevoegde eilecithine worden teruggewonnen. D i t gelukte

e c h t e r niet a a n CHAPMAN (10) en LYONS en FINLAY ( 2 5 ) . W I E S E , NAIR en FLEMING (44) vonden in h e t Böse-Gottlieb-extract 90 % v a n aan melk toegevoegd sojalecithine terug. Ze merken echter terecht op, d a t m e n hieruit niet m e t zekerheid m a g afleiden, d a t de in melk aanwezige Phosphatiden ook volledig worden geëxtraheerd; de toestand, waarin deze voorkomen, k a n b . v . een geheel andere zijn; de extractie zou daardoor k u n n e n worden belemmerd of gemakkelijker worden gemaakt. I n h e t algemeen vonden de onderzoekers, die volgens Eöse-Gottlieb extraheerden, vrij lage phosphatidegehalten, m a a r hieruit m a g natuurlijk volstrekt niet worden afgeleid, d a t de cijfers t e laag zijn. H e t is heel aannemelijk, d a t de bij toepassing v a n deze methode gevonden waarden laag zijn, o m d a t er weinig verontreinigende phosphorverbindingen mee worden geëxtraheerd. I n de eerste plaats n.1. wordt er een vrij groote hoeveelheid extractiemiddel gebruikt; verder wordt aanmerkelijk meer aether dan alcohol toegevoegd (de verhouding tusschen de v a n deze vloeistoffen gebruikte hoeveelheden is 2 | : 1 ) . Bovendien wordt tenslotte nog vrij veel petroleumaether toege-voegd. I n petroleumaether lossen gehydrateerde stoffen slecht op en m e n ziet n a de toevoeging van deze vloeistof d a n ook een troebeling o n t s t a a n in de oorspronkelijk vrij heldere aetherische oplossing. Alles samengenomen bestaat er weinig gevaar voor, d a t er sterk hydrophiele

phosphorverbin-dingen in h e t e x t r a c t zullen achterblijven. W I E S E , NAIR en FLEMING

konden inderdaad in h e t extract geen anorganische phosphor aantoonen. E e n verdere bijzonderheid v a n de extractiemethode volgens Eöse-Gottlieb is, d a t de t e extraheeren melkproducten alkalisch worden gemaakt m e t behulp v a n sterke ammonia. Bij de vetbepaling geschiedt dit om d e extractie volledig t e doen zijn. Ook bij de phosphatidebepaling schijnt de toevoeging van ammonia van belang t e zijn, want HOLWEBDA vond iets m e e r phosphatide in melk en in room als ze vóór de extractie w a t ammonia toevoegde, d a n zonder deze toevoeging.

o. Indirecte bepalingsmethoden

Over eenige indirecte methoden, die werden voorgesteld t e r bepaling van de Phosphatiden in melk, k u n n e n we kort zijn. Volgens THURSTON en PETERSEN (43) hebben de Phosphatiden of de ontledingsprodueten ervan geen invloed op de vetbepalingsmethode volgens Babcock. Z e willen h e t phosphatidegehalte v a n karnemelk bepalen door de resultaten v a n de vetbepaling volgens Eöse-Gottlieb en die volgens Babcock v a n elkaar af t e trekken. D a a r de methode v a n Babcock geheel onjuiste waarden geeft voor h e t karnemelkvetgehalte e n d e ontledingsproducten v a n de Phospha-tiden zeker invloed zullen hebben op de resultaten, die volgens deze m e t h o d e worden verkregen, is h e t voorstel v a n THURSTON en PETERSEN geheel onaanvaardbaar ( 2 9 ) .

PETERSEN en H E R R E I D (34) denken h e t phosphatidegehalte v a n karne-melk t e k u n n e n berekenen door d e cijfers, verkregen bij de bepaling v a n het vetgehalte volgens een variant op de Eöse-Gottlieb-methode ( d e methode van MOJONNIER) en die, welke worden verkregen bij de vetbepa-ling volgens een door h e n ontworpen methode ( d e Minnesota test) van

elkaar af te trekken. De Phosphatiden zullen bij de Minnesota t e s t geen invloed hebben op de vetbepaling, want toegevoegde lecithine verhoogt het gevonden cijfer voor het vetgehalte niet. H e t genoemde verschil is echter aanmerkelijk grooter dan het phosphatidegehalte, d a t m e n volgens directe bepalingsmethoden vindt. Voor room m e t 20 % vet varieerde het bij het onderzoek van PETERSEN en HERREID van 0,1684 t o t 0,3199 %. Vooral het hoogste cijfer is onwaarschijnlijk hoog. Zelf vonden we tusschen de vetbepaling volgens Eöse-Gottlieb en die volgens de Minnesota test een gemiddeld verschil van 0,175 %, terwijl de uiterste verschillen waren 0,09 en 0,38 % . H e t gemiddelde verschil is dus aanmerkelijk hooger dan h e t gemiddelde phosphatidegehalte, dat 0,075 % bedroeg. Toch zou m e n op grond van dit groote verschil h e t principe van de phosphatidebepalings-methode van PETERSEN en HERREID niet mogen verwerpen. De Minnesota t e s t is n.1. een ervaringsmethode en h e t zou kunnen zijn, d a t er een correctie zou moeten worden aangebracht op de volgens h e t origineele voorschrift van PETERSEN en H E R R E I D gevonden cijfers of d a t h e t voor-schrift iets diende te worden gewijzigd. E c h t e r ook na het aanbrengen van een correctie zou h e t voorstel van de beide Amerikaansche onderzoekers moeilijk aanvaardbaar zijn, w a n t de volgens h u n methode berekende phosphatidegehalten vertoonen variaties, die veel grooter zijn dan de volgens de directe bepalingsmethoden gevonden cijfers voor h e t gehalte aan Phosphatiden.

E I G E N ONDERZOEK

H e t is niet gemakkelijk een keuze te doen uit de vele in de literatuur genoemde phosphatidebepalingsmethoden, t e m e e r o m d a t geen van deze methoden geheel bevredigend kan worden genoemd. Vooral de keuze van een extractiemethode geeft moeilijkheden.

a. De methode van Holwerda

Teneinde geen anorganische phosphor in de extracten te krijgen, lijkt h e t gewenscht h e t water van de karnemelk vóór de extractie te verwijderen. Daar er gevaar b e s t a a t voor het insluiten van Phosphatiden door vaste eiwitdeeltjes, is h e t niet goed om uit te gaan van gedroogde karnemelk, zooals b.v. karnemelkpoeder. Hetzelfde a r g u m e n t kan echter moeilijk worden ingebracht tegen h e t drogen van de karnemelk op zand of op een droogmiddel als natriumsulfaat of gips; er zal d a n n.1. weinig gevaar voor insluiten bestaan.

HOLWERDA (19), die deze methode toepaste (ze droogde op n a t r i u m -sulfaat en extraheerde m e t een alcohol-aether-mengsel 3 : 1 ) , vond geen anorganische phosphor in haar extracten. Helaas bleek bij haar onderzoek, dat er behalve de Phosphatiden nog vrij groote hoeveelheden van een niet-ionogene phosphorverbinding in de extracten overgingen. Volgens HOLWERDA was deze verbinding een phosphorzure ester; m e t zekerheid is dat echter niet bewezen. Teneinde den invloed van deze vreemde phosphor-verbinding op d e phosphatidebepaling uit t e sluiten, stelde de genoemde onderzoekster voor een correctie aan t e brengen. Volgens h a a r bevat

vetvrije ondermelk geen Phosphatiden, zoodat ze de correctie voor melk meende t e kunnen leeren kennen door deze vloeistof intensief te centri-fugeeren en in de verkregen vetvrije ondermelk de hoeveelheid „extraheer-bare p h o s p h o r " , volgens haar „ester-phosphor", te bepalen. Ze vond in volle melk een hoeveelheid extraheerbare phosphor, overeenkomende m e t 0,079 % phosphatide; in de ., vetvrije" ondermelk een hoeveelheid, over-eenkomende m e t 0,059 %. I n werkelijkheid is volgens haar dus ongeveer 0,02 % phosphatide aanwezig. Daar de correctie veel grooter is dan het phosphatidegehalte, verliest de methode veel aan betrouwbaarheid. Zeer kleine hoeveelheden Phosphatiden zullen dan ook moeilijk m e t behulp van deze methode k u n n e n worden bepaald.

1. De toepassing van deze methode op sure en zoete karnemelk

HOLWEBDA heeft niet aangegeven hoe de correctie voor karnemelk moet worden bepaald. I n karnemelk is een deel van de Phosphatiden waar-schijnlijk niet verbonden m e t vetdeeltjes, zoodat h e t niet mogelijk zal zijn de correctie te bepalen door middel van een bepaling van de extraheerbare phosphor in „ v e t v r i j " gecentrifugeerde karnemelk. Bovendien kan karne-melk moeilijk vetvrij worden gecentrifugeerd, omdat het vet er voor een belangrijk deel in een colloidalen vorm in voorkomt (11, 3 8 ) . Tabel 1 bevat eenige cijfers, waaruit blijkt, d a t h e t vet en de Phosphatiden niet door middel van centrifugeeren uit zure karnemelk kunnen worden verwijderd. Bij de betreffende proeven werden de karnemeytmonsters gedurende 1\ uur in een laboratoriumcentrifuge krachtig gecentrifugeerd.

T A B E L 1 Monster n°. 1 2 3

% volgens HOLWEKDA'S methode „extraheerbare phosphor", uitgedrukt als phosphatide Karnemelk (zuur) (0,67) *) 0,08 (0,62) 0,075 (0,57) 0,08 N a centrifugeeren (0,15) 0,04 (0,12) 0,045 (0,16) 0,04

*) De tusschen ( ) geplaatste cijfers geven het vetgehalte (Gerber) aan.

D a a r de correctie voor de storende phosphorverbindingen niet kan worden bepaald in het centrifugaat van karnemelk, zal dit moeten geschieden in h e t ultrafiltraat. D e storende verbindingen passeeren volgens HOLWEEDA een ultrafilter, terwijl de Phosphatiden daardoor worden tegen-gehouden. Als ultrafilter gebruikten we een volgens OSTWALD bereid collodionfilter ( 3 2 ) . Bij alle de genomen proeven kon in h e t ultrafiltraat van

zure karnemelk slechts een spoor extraheerbare phosphor worden aan-getoond, waaruit volgt, dat zure karnemelk nagenoeg geen storende phosphorverbindingen bevat. Tijdens de bewerkingen, die de room bij de boterbereiding ondergaat, schijnen deze verbindingen tot niet-extraheerbare stoffen te worden omgezet. Bij zoete karnemelk is het probleem geheel anders, zooals blijkt uit tabel 2. Bij de proeven, waarop deze tabel betrekking heeft, werden de karnemelk en h e t ultrafiltraat er van geëxtra-heerd volgens de methode van HOLWEBDA. D e gevonden hoeveelheden phosphor werden omgerekend t o t % phosphatide, ofschoon d a t natuurlijk niet juist is, daar b.v. h e t ultrafiltraat geen phosphatide bevat. Deze berekening werd echter uitgevoerd om t e laten zien welke fout gemaakt wordt als er bij h e t volgen v a n d e m e t h o d e van HOLWEKDA geen rekening wordt gehouden m e t de storende phosphorverbindingen. Tevens werd het phosphatidegehalte van de karnemelkmonsters bepaald volgens een methode, waarbij de extractie van Eöse-Gottlieb werd gevolgd. Op deze cijfers wordt op blz. 720 teruggekomen.

TABEL 2

Extractie volgens HOLWEKDA; schijnbaar phosphatidegehalte A. Karnemelk 0,163 0,11 0,13 0,08 0,08 0,12 B . Ultrafiltraat 0,t)48 0,03 0,03 0,01 0,02 0,04 Werkelijk phosphatidegehalte Volgens HOLWEBDA A — B 0,115 0,08 0,10 0,07 0,06 0,08 Extractie volgens RÖSE-GOTTLIEB 0,10 0,09 0,08 0,075 0,07 0,08

Uit de tabel volgt duidelijk, dat zoete karnemelk phosphorverbindingen, die storend werken bij de phosphatidebepaling volgens de m e t h o d e van HOLWEBDA, b e v a t .

Aangezien de bepaling van de correctie bij h e t onderzoek van het phosphatidegehalte van karnemelk uit zuren room volgens de m e t h o d e van HOLWEBDA kan vervallen, is deze m e t h o d e bij die karnemelksoort goed bruikbaar. Voor het onderzoek van zoete karnemelk is de methode zeer omslachtig, o m d a t telkens de hoeveelheid extraheerbare phosphor in het ultrafiltraat van karnemelk moet worden bepaald.

2. Het phosphatidegehalte van centrifugemelk en het bepalen van de

correctie, die bij de methode van HOLWEKDA moet worden aangebracht

Over het gebruik van deze m e t h o d e bij h e t bepalen van h e t phosphatide-gehalte van andere melkproducten zij nog het volgende opgemerkt. Volgens HOLWEKDA bevat ondermelk geen Phosphatiden. Ze k w a m t o t die veronder-stelling naar aanleiding van eenige pogingen, die zonder resultaat bleven, om uit centrifugemelk Phosphatiden af t e zonderen. Eenige andere experi-m e n t e n van haar lijken echter in strijd te zijn experi-m e t het bovenstaande. Bij

deze proeven t r a c h t t e ze de storende phosphorverbinding, waarvan ze veronderstelde, d a t het een phosphorzure ester is, in weegbare hoeveelheden uit ondermelkpoeder af t e zonderen. Uit 500 g van dit poeder verkreeg ze echter, n a a s t ca. 600 mg van de storende phosphorverbinding ongeveer 200 mg phosphatide. H e t ondermelkpoeder was dus lang niet phospbatide-vrij. Daartegenover echter staat, d a t h e t ook niet vetvrij was en dat de aanwezige Phosphatiden dus misschien aan h e t vet zouden kunnen zijn gebonden. H e t vetgehalte bedroeg omstreeks 1 % en kan dus niet uitzon-derlijk hoog worden genoemd. Men zou zich k u n n e n afvragen hoe hoog het phosphatidegehalte zou zijn geweest als h e t poeder in h e t geheel geen vet had bevat. HOLWERDA geeft reeds een antwoord op deze vraag. I m m e r s volgens haar verandert h e t phosphatidegehalte van centrifugemelk nagenoeg niet, als deze vloeistof aan een zeer scherpe centrifugeering wordt onderworpen en dus ten naaste bij vetvrij wordt gemaakt. Ook de proeven, die door mijzelf in deze richting werden genomen, hadden eenzelfde resultaat, zooals blijkt uit de cijfers, die in het laatst van de volgende alinea worden gegeven. Eerder dan aan te nemen, dat ondermelk geen Phosphatiden bevat, zou ik uit de proeven van HOLWEEDA willen afleiden, dat in ondermelk een geringe hoeveelheid Phosphatiden voorkomt.

Als we aannemen, d a t er bij de proeven van HOLWERDA over het afzon-deren van de Phosphatiden en de storende phosphorverbinding uit onder-melkpoeder van beide stoffen evenveel verloren ging, komen deze stoffen in centrifugemelk in een verhouding 1 : 3 voor, m . a . w . van de hoeveelheid extraheerbare phosphor b e s t a a t ongeveer £ deel uit Phosphatiden. D a a r er volgens HOLWERDA in centrifugemelk een hoeveelheid extraheerbare phosphor aanwezig is, die overeenkomt m e t 0,05 % Phosphatiden, zou er volgens de bovenstaande veronderstelling ongeveer 0,01 % phosphatide in dat product voorkomen. Deze geschatte hoeveelheid komt overeen m e t die, welke m e n vindt als m e n de Phosphatiden uit de centrifugemelk extraheert volgens de m e t h o d e van Böse-Gottlieb. W e vonden volgens de laatst-genoemde m e t h o d e in de centrifugemelk van h e t boterfabriekje van de proefzuivelboerderij gemiddeld 0,013 % Phosphatiden. Na deze ondermelk nog eens gedurende een u u r in een laboratoriumcentrifuge t e hebben gecentrifugeerd, zoodat ze nagenoeg geheel vetvrij was, vonden we gemiddeld nog 0,012 % Phosphatiden.

Ook op andere manieren kon h e t voorkomen van Phosphatiden in centrifugemelk waarschijnlijk worden gemaakt. Zoo kon worden aangetoond, dat h e t Eöse-Gottlieb-extract behalve phosphor ook stikstof bevat. D e stikstofhoudende stof is oplosbaar in organische oplosmiddelen en is dus waarschijnlijk geen eiwit. Verder bleek, d a t in h e t ultrafiltraat van onder-melk zoo goed als geen phosphor, die volgens de m e t h o d e van Eöse-Gottlieb kan worden geëxtraheerd, voorkomt (meestal vonden we minder dan 0,002 % ) . H i e r u i t volgt, d a t de phosphorverbinding, die bij de m e t h o d e van HOLWERDA storend werkt, niet of slechts in geringe sporen bij de m e t h o d e van Rose-Gottlieb wordt geëxtraheerd.

Eigenlijk m a g ook niet wrorden verwacht, d a t centrifugemelk phospha-tidevrij is. De Phosphatiden worden n.1. bij roeren, schudden, karnen, centrifugeeren en dergelijke bewerkingen, waarbij de melk in een krachtige

beweging komt, van h e t oppervlak van de vetbolletjes verwijderd en komen dan terecht in het melkplasma. Als room wordt gecentrifugeerd, blijft er in de „ v e t v r i j e " ondermelk een aanzienlijke hoeveelheid Phosphatiden a c h t e r ; in een dergelijke centrifugemelk vonden we b.v. meermalen 0,05 % Phosphatiden. Naar aanleiding hiervan m o e t dus wel worden aangenomen, dat in normale ondermelk een geringe hoeveelheid Phosphatiden voorkomt. Uit het voorgaande volgt, dat de correctie, die bij de methode van HOLWERDA moet worden aangebracht, niet mag worden bepaald door een

bepaling van de hoeveelheid extraheerbare phosphor in ,,vetvrij" gecentri-fugeerde ondermelk, m a a r d a t deze bepaling moet geschieden in h e t

ultra-filtraat van de melk of h e t melkproduct. Volgens deze redeneering bevat melk ongeveer 0,01 % meer phosphatide dan HOLWERDA aangaf, zoodat h e t gemiddelde cijfer niet 0,02 % m a a r 0,03 % wordt. Dit laatste cijfer komt goed overeen m e t door andere onderzoekers volgens andere verdedig-bare methoden gevonden waarden.

b. Vergelijking yan eenige geheel verschillende bepalingsmethoden

D a a r we het phosphatidegehalte van melk en d a t van melkproducten niet kennen en we niet weten of de extractie van de melkphosphatiden op dezelfde wijze kan geschieden als de extractie van aan ondermelk toege-voegde vreemde phosphatide!!, kunnen we moeilijk zeggen welke van de genoemde m e t h o d e n juist is. Als echter bij onderzoek van eenzelfde monster karnemelk volgens verschillende methoden een gelijk cijfer voor h e t phosphatidegehalte zou worden gevonden, zou m e n m e t een tamelijk groote waarschijnlijkheid mogen aannemen, d a t zoowel dit cijfer als de methoden juist zijn. Op grond van deze redeneering hebben we van eenige monsters zure karnemelk h e t phosphatidegehalte bepaald volgens de m e t h o d e van BBODRICK-PITTARD, volgens de methode van HOLWERDA en volgens een methode, waarbij gebruik werd g e m a a k t van de vetextractie-m e t h o d e van EÖSE-GOTTLIEB. De gevolgde voorschriften luiden :

1. BRODRICK-PITTARD : 100 g karnemelk werd onder schudden en roeren gedruppeld bij 100 cm3 van een alcohol-aether-mengsel ( 1 : 1 ) . Toen alle karnemelk was toegevoegd bleef het mengsel nog ca. 6 uren staan, terwijl dikwijls werd geschud. H e t gevormde neerslag werd door centrifugeeren verwijderd en gewasschen m e t een alcohol-aether-mengsel. D e wasch-vloeistof werd te zamen m e t h e t extract in vacuo t o t een dikke stroop i n g e d a m p t ; hierbij werd d e t e m p e r a t u u r beneden 50° C gehouden. De stroop werd m e t een drievoudige hoeveelheid watervrij natriumsulfaat aan-gewreven en daarna gedurende drie uren in een Soxhletapparaat geëxtra-heerd m e t chloroform. Na verdampen van de chloroform werd de droogrest verascht m e t soda en salpeter. H e t gevormde p h o s p h a a t werd volgens de m e t h o d e van LORENZ bepaald als phosphorammoniummolybdaat.

2. De methode van HOLWERDA. 1 cm3 karnemelk werd m e t 3 g watervrij natriumsulfaat aangewreven en gedurende een half uur geëxtra-heerd door schudden m e t 50 c m3 van een alcohol-aether-mengsel (3 dln alcohol 95 % en 1 dl a e t h e r ) . Daarna werd gefiltreerd en van 40 cm3 helder extract h e t oplosmiddel in vacuo v e r d a m p t in een microdestructiebuis.

H e t residu werd volgens NEUMANN verascht m e t 0,5 c m3 van een mengsel van 1 deel sterk zwavelzuur en 1 deel sterk salpeterzuur. Zoo noodig werd later nog wat salpeterzuur toegevoegd. Na afloop van de destructie werd m e t wat water verwarmd om het nitrosylzwavelzuur t e doen ontleden, waarna tot 10 cm3 werd aangevuld. H e t phosphaat werd nephelometrisch bepaald m e t behulp van een strychnine-molybdeen-reagens volgens MEDINGER * ) . De benoodigde hoeveelheid van de onbekende phosphaat-oplossing werd m e t water aangevuld t o t 9 cm3 en bedeeld m e t 1 cm3 reagens. D e o n t s t a n e troebeling werd in een cuvetje, zooals gebruikt in den colorimeter van H E L L I G E , vergeleken m e t de troebelingen van een vergelijkingsschaal, die werd verkregen door bij opklimmende hoeveel-heden (0,15—0,5 cm3) van een phosphaatoplossing, die 20 mg phosphor per 1 bevatte, 1 c m3 van h e t reagens t e voegen, n a d a t d e phosphaat-oplossingen waren aangevuld t o t 9 cm3 m e t verdund zwavelzuur (3,5 c m3 sterk zwavelzuur op 500 c m w a t e r ) . Volgens HOLWEKDA is deze methode nauwkeurig t o t op 10 % en kan de nauwkeurigheid worden opgevoerd door 2 verschillende hoeveelheden van de onbekende oplossing te n e m e n . D a a r slechts m e t zure karnemelk werd gewerkt, behoefde geen correctie t e worden aangebracht.

3. Extractie volgens EÖSE-GOTTLIEB. Deze werd volgens h e t in de Codex Alimentaris voorkomende voorschrift voor h e t bepalen van h e t vet-gehalte van melk uitgevoerd. Hierbij wordt na het bezinken een gedeelte van de heldere aetherische oplossing afgetapt en voor de verdere analyse gebruikt. I n het buitenland n e e m t m e n dikwijls alle aetheroplossing weg en s c h u d t daarna opnieuw m e t aether en petroleumaether. Bij de phosphatidebepaling bleek dit weinig zin t e h e b b e n ; h e t tweede extract b e v a t t e nagenoeg geen Phosphatiden. Aanvankelijk bestond h e t plan om het phosphorgehalte van de extracten op een door HORRALL beschreven methode t e bepalen, n.1. door verassching van de droogrest m e t magnesium-n i t r a a t emagnesium-n bepalimagnesium-ng vamagnesium-n h e t gevormde phosphaat volgemagnesium-ns D E N I G È S . D a a r deze colorimetrische bepaling moeilijkheden opleverde, werd van dit voor-n e m e voor-n afgestapt evoor-n werd h e t phosphorgehalte vavoor-n de extractevoor-n op dezelfde wijze bepaald als d a t bij de m e t h o d e van HOLWERDA geschiedt.

D e volgende tabel (3) geeft een overzicht van de resultaten, die m e t deze m e t h o d e n werden verkregen. (Ook tabel 2, op blz. 716 bevat eenige cijfers.)

D a a r de drie m e t h o d e n t e n n a a s t e bij hetzelfde cijfer voor h e t phospha-tidegehalte geven, zullen ze waarschijnlijk alle bij benadering juist zijn. Verder volgt- u i t de cijfers van tabel 3, d a t de onderzochte karnemelk-monsters zeer waarschijnlijk ongeveer 0,08 % Phosphatiden bevatten.

*) HOLWEKDA bereidde dit reagens als volgt: aan een helder gefiltreerde oplossing van 4 g ammoniummolybdaat in 100 cm water wordt zooveel van een verzadigde strych-nineacetaatoplossing (1 : 65) toegevoegd, dat een even blijvende troebeling o n t s t a a t . Hiervoor is noodig 8 à 9 cm3. De verkregen oplossing wordt gemengd met een gelijk volumen salpeterzuur (s.g. 1,33) en, na een nacht te hebben gestaan, gefiltreerd. H e t reagens moet in het donker worden bewaard eni blijft slechts eenige dagen bruikbaar.

720 T A B E L 3 Karne- melk-monster 1 2 3 4 5 6 7 8

Phosphatidegehalte (%) volgens de methode BKODKICK-PlTTAED 0,069 0,087 0,066 0,065 RÖSB-GOTTLIEB 0,09 0,08 0,08 0,075 0,08 0,09 0,07 0,07 HOLWEBDA 0,11 0,08 0,075 0,08

o. Het voorschrift, dat bij het verder onderzoek werd gevolgd

Van de genoemde drie extractiemethoden is die van BRODRICK-PITTARD het omslachtigst. Als m e n veel phosphatidebepalingen wil verrichten, komt ze dan ook minder in aanmerking d a n de beide andere methoden. Van deze beide is de extractie volgens KÖSE-GOTTLIEB h e t eenvoudigste uit t e voeren. D a a r deze m e t h o d e reeds door veel onderzoekers is toegepast en daar bij toepassing van de methode van HOLWERDA bij h e t onderzoek van zoete karnemelk en andere melkproducten een groote en moeilijk te bepalen correctie op de gevonden waarden moet worden aangebracht, geven we de voorkeur aan d e extractie volgens EÖSB-GOTTLIEB.

Als h e t phosphorgehalte van de extracten volgens de strychnine-molyb-deen-methode wordt bepaald, heeft m e n slechts weinig extract noodig. Teneinde chemicaliën te besparen, hebben we de hoeveelheden in het voorschrift iets gewijzigd. H e t gevolgde voorschrift l u i d t : I n een gecali-breerden schudcylinder m e t een inhoud van 50 cm3, die voorzien is van een ingeslepen stop, wordt 4 cm3 melk achtereenvolgens bedeeld m e t 0,8 c m3 sterke ammonia, 4 cm3 alcohol, 10 cm3 aether en 10 cm3 petroleumaether. Na elke toegevoeging wordt, evenals d i t geschiedt bij de vetbepaling volgens BÖSE-GOTTLIEB, geschud. N a d a t m e n heeft laten bezinken, leest m e n h e t volumen van de aetherlaag af en pipetteert 10 cm3 van h e t aethermengsel in een microdestructiekolfje. N a d a t de oplosmiddelen zijn v e r d a m p t door h e t kolfje in een waterbad t e verwarmen, wordt h e t phosphorgehalte van d e droogrest bepaald op de door HOLWERDA beschreven wijze (blz. 718). Uit h e t gevonden phosphorgehalte k a n d a t v a n de karne-melk worden berekend.

d. Eenige in de literatuur genoemde cijfers voor het phosphatidegehalte

van karnemelk

I n d e literatuur vindt m e n in het algemeen hoogere waarden voor het phosphatidegehalte van karnemelk opgegeven d a n de in tabel 3 genoemde. MOHR en Moos hebben e e n uitvoerig literatuuroverzicht

gegeven v a n de t o t 1932 gepubliceerde waarden. Ze o n t m o e t t e n cijfers, die uiteenliepen van 0,0332—0,8768 % . Deze groote verschillen zullen voor een deel moeten worden toegeschreven aan verschillen tusschen de gevolgde methoden. Misschien ook kunnen een deel v a n de verschillen zijn ontstaan doordat de onderzochte soorten karnemelk niet op dezelfde wijze en uit dezelfde melksoort waren bereid.

Tabel 4 bevat eenige van de in de literatuur genoemde cijfers.

TABEL 4 M O H R en BROCKMANN M O H E en M o o s . . . H O L M en W R I G H T HORRALL. . »> CHAPMAN. . B I R D en SANDS . . B I R D , B R E A -ZEALE, SANDS . . » »» HOLWEKDA . Extractie-methode BRODRICK-P I T T A R D — MojONNIER » ,, ,, " " " HOLWEKDA Phosphatide (%) 0,1142 0,8433 0,284—0,382 0,14—0,16 0,10—0,17 0,1036—0,148 0,149 0,1329 0,1670 0,2154 0,10—0,125 Vetgehalte (%) 0,50 0,45 0,96—1,64 — — 0,643 0,70 — — — Phosphatide, berekend op v e t (%) 22,8 187,4 — 19,7 17,9 20,25 25,26 — — — Opmerkingen E x t r a c t bevatte anorg. P ? Zoete karne-melk Zure karnemelk Uit room m e t 20 % vet Uit room m e t 30 % v e t Uit room m e t 40 % vet

Als we de door M O H R en M o o s en d e door H O L M en W E I G H T vermelde cijfers, waarvan bijna m e t zekerheid k a n worden gezegd d a t ze niet juist zijn, uitschakelen, is er een tamelijk goede overeenstemming tusschen de volgens verschillende m e t h o d e n gevonden cijfers.

Volgens de tabel zou karnemelk 0,11—0,17 % Phosphatiden bevatten. Zelf vonden we volgens de drie genoemde m e t h o d e n v a n onderzoek in h e t algemeen lagere waarden; meestal 0,08 % . E e n verklaring voor dit verschil vermogen we niet t e geven. Misschien m o e t deze worden gezocht bij een verschil in vetgehalte van d e n room, waaruit de karnemelk werd bereid, en mogelijk bij een verschil in samenstelling v a n de melk of bij de gevolgde techniek in de boterfabriek.

e. Het phosphatidegehalte van de karnemelk van het proefboterfabriekje

Tabel 5 geeft een overzicht van de voor liet phosphatidegehalte gevonden waarden, die betrekking hebben op karnemelksoorten, die in h e t boter-fabriekje van de Proefzuivelboerderij werden vervaardigd uit zuren room m e t ongeveer 20 % vet. E r werd even voor h e t afkarnen doorgaans 6—10 % water in de karn gespoeld. D e tusschen ( ) geplaatste cijfers zijn afkomstig van een niet gepubliceerd onderzoek van HOLWEKDA; deze werden bepaald volgens de door haar ontworpen methode.

TABEL 5 .

in 4 karnemelkmonsters werd gevonden 0,05—0,06 % Phosphatiden 10 (4) 15 (40) 21 (13) 0,06—0,07 % 0,07—0,08 % 0,08—0,09 % 0,09—0,10 %

H e t gemiddelde van deze cijfers is 0,07—0,08 % . Zonder inspoelen van water bij h e t karnen zou dit gemiddelde zijn: 0,08—0,09 %.

D a a r de karnemelkmonsters gemiddeld ongeveer 0,5 % vet bevatten k w a m e n er op 100 deel en vet ca. 15 deelen phosphatide voor.

f. De invloed van eenige factoren op het phosphatidegehalte van

karne-melk

Voor een deel moeten de geconstateerde schommelingen in het phos-phatidegehalte van de karnemelk waarschijnlijk worden toegeschreven aan schommelingen in h e t vetgehalte van den room en andere m i n of meer kleine variaties bij de boterbereiding. De grootste schommelingen k u n n e n d a a r m e d e echter niet worden verklaard. Waarschijnlijk zijn h e t geen seizoenschommelingen, w a n t binnen betrekkelijk kleine perioden werden relatief groote veranderingen in het phosphatidegehalte waargenomen. SIEKS (39) vond soortgelijke schommelingen in het phosphatidegehalte van melk. I n 1939 vond hij in gemengde stalmelk op 7 M a a r t 0,009 % Phospha-tiden, op 5 April 0,028 %, op 18 April 0,016 % en op 2 Mei 0,028 %.

H e t phosphatidegehalte van karnemelk uit weidemelk en van karnemelk

uit stalmelk bereid was even hoog (tabel 6 ) . De melkmonsters, waarop

de cijfers van deze tabel betrekking hebben, waren afkomstig v a n twee groepen koeien; de eene groep liep in de weide, de andere stond in dien-zelfden tijd op stal.

T A B E L 6

Karnemelk van weidemelk Karnemelk van stalmelk

Phosphatidegehalte (%) Proef n°. 1 0,08 0,11 2 0,10 0,105 3 0,10 0,10 4 0,10 0,08 5 0,09 0,09 6 0,09 0,09 7 0,10 0,085 Ge-middeld 0,094 0,094

H e t resultaat v a n deze proeven is in overeenstemming m e t oudere, niet gepubliceerde proeven, die in dit laboratorium werden genomen en waarbij werd gevonden, d a t er weinig verschil b e s t a a t tusschen h e t phosphatide-gehalte v a n weidemelk en d a t v a n stalmelk. Ook volgens GOULD (14) is het phosphatidegehalte v a n melk niet sterk afhankelijk v a n de voeding v a n h e t vee.

H e t is bekend, d a t sommige factoren, die bij de boterbereiding v a n belang zijn, ook invloed hebben op h e t phosphatidegehalte v a n karnemelk. Daarom werd de invloed van eenige van deze factoren nader onderzocht. H e t pasteuriseeren van den room h a d geen invloed op h e t phosphatide-gehalte v a n karnemelk (tabel 7 ) .

T A B E L 7

Phosphatidegehalte (%)

Karnemelk uit rauwen, zoeten room Karnemelk uit gepasteuriseerden room Karnemelk uit rauwen, gezuurden room

Karnemelk uit gepasteuriseerden en gezuurden room

0,09 0,08 0,09 0,085

Het uuren van den room h a d volgens tabel 7 evenmin invloed op h e t

phosphatidegehalte v a n de karnemelk als h e t pasteuriseeren. D a t h e t zuren geen invloed heeft, blijkt ook u i t de proeven, waarvan de resultaten in tabel 8 zijn vermeld. U i t de cijfers van deze tabel blijkt, dat de wijze

waarop de room werd gekoeld geen invloed h a d .

T A B E L 8

Temperatuurbehandeling v a n den room n a h e t pasteuriseeren „ 20° C; „ 15° C 19 19 0; „ 14° C 0—20—5; „ 14° C 20 20 5; „ 14° C 25—25 0; „ 12,5° C 25—25—0; „ 20° C Zoete karnemelk 0,085 0,095 0,075 0,09 0,09 0,09 0,09 0,085 Zure karnemelk 0,08 0,08 0,09 0,08 0,10 0,10

Het vetgehalte van den room, waaruit de karnemelk werd bereid,

had, zooals reeds was bekend (b.v. B I R D , BREAZEALE en S A N D S ) , een grooten invloed op h e t phosphatidegehalte v a n de karnemelk (tabel 9 ) .

724 T A B E L 9

Vetgehalte v a n den zuren room . . . Phosphatidegehalte v a n de karnemelk

39,0 % 0,125 %

M e n zou zich k u n n e n indenken, d a t d é Phosphatiden vrij snel in karne-melk worden ontleed en dat d a a r m e d e de schommelingen in h e t phospha-tidegehalte v a n dit product moeten worden verklaard. Van eenige monsters karnemelk werd h e t phosphatidegehalte dadelijk n a h e t karnen bepaald en tenslotte nogmaals n a d a t d e monsters ongeveer 10 dagen bij kamer-t e m p e r a kamer-t u u r kadden geskamer-taan.

Dadelijk n a het karnen N a 10 dagen bewaren 0,08 % 0,07 % 0,09 % 0,09 % 0,07 % 0,07 % 0,07 % 0,07 % 0,055% 0,05 % 0,055% 0,05 % 0,05 % 0,05 % 0,06 % 0,06 %

Uit deze cijfers volgt, d a t h e t phosphatidegehalte van de karnemelk-monsters bij de bewaring weinig of niet was veranderd.

SAMENVATTING

I n de voorgaande mededeeling werd een overzicht gegeven v a n in de literatuur genoemde methoden ter bepaling v a n h e t phosphatidegehalte van karnemelk. E v e n m i n als m e n h e t eens is over de bruikbaarheid v a n deze methoden, is m e n het er over eens hoeveel phosphatide in melk en melkproducten voorkomt. D e m e t h o d e n k u n n e n niet worden gecontro-leerd door bepalingen u i t t e voeren in zelfbereide suspensies v a n Phospha-tiden, o m d a t niet precies bekend is welke Phosphatiden in melk voorkomen en in welken vorm ze aanwezig zijn.

Uitgaande v a n de veronderstelling, d a t wanneer voor eenzelfde monster karnemelk volgens verschillende bepalingsmethoden hetzelfde cijfer voor h e t phosphatidegehalte wordt gevonden, zoowel de toegepaste m e t h o d e n als h e t cijfer zeer waarschijnlijk juist zullen zijn, hebben we de hoeveelheid Phosphatiden in eenige monsters karnemelk volgens drie geheel verschil-lende methoden bepaald. Deze m e t h o d e n waren 1°. die v a n BRODRICK-P I T T A E D , 2°. die v a n HOLWBBDA, en 3°. een m e t h o d e , waarbij dezelfde extractiemethode werd toegepast als bij de vetbepaling volgens BÖSE-GOTT-LIEB. De drie methoden gaven gelijke cijfers voor h e t phosphatidegehalte, zoodat we aannemen, d a t ze juist zijn.

De methode van BRODRICK-PITTARD is heel bewerkelijk, zoodat ze niet voor serieonderzoek in aanmerking komt.

D e methode van HOLWEHDA is bruikbaar voor zure karnemelk, m a a r minder goed voor zoete en voor andere melkproducten, die storende P-ver-bindingen bevatten. Tegengesteld aan de meening van HOLWERDA, d a t er in scherp gecentrifugeerde ondermelk geen Phosphatiden voorkomen, vonden we, d a t in dit product een kleine hoeveelheid (0,01—0,015 % ) van deze verbindingen aanwezig is. D e correctie, die HOLWERDA bij h e t

onderzoek van melk voor de storende P-verbinding aanbracht en die ze bepaalde door een , ,phosphatidebepaling" in gecentrifugeerde ondermelk t e doen, is dus te hoog en haar bepalingen zijn dientengevolge alle ruim 0,01 % te laag uitgevallen. I n gecentrifugeerde karnemelk k o m t een aanzienlijke hoeveelheid Phosphatiden voor (soms wel 0,05 % ) . De correctie voor de P-verbinding, die storend werkt bij d e methode van HOLWERDA, k a n worden bepaald door middel van een „phosphatide-b e p a l i n g " in h e t ultrafiltraat van h e t te onderzoeken melkproduct. De m e t h o d e wordt dan echter nog bewerkelijker dan die van

BRODRICK-PlTTARD.

De derde methode, waarbij gebruik werd g e m a a k t van d e

extractie-methode van EÖSE-GOTTLIEB, is gemakkelijk en snel u i t t e voeren. Ook

o m d a t reeds dikwijls gebruik is g e m a a k t van deze methode, geven we aan haar de voorkeur.

W e hebben een voorschrift uitgewerkt, waarbij van 4 cm3 karnemelk wordt uitgegaan (blz. 720). H e t phosphatidegehalte van het extract wordt bepaald door h e t phosphorzuur, dat bij de verassching van de droogrest volgens NEUMANN ontstaat, te bepalen m e t behulp van h e t reagens van MEDINGER volgens een door HOLWERDA uitgewerkte m e t h o d e (blz. 719). Bij de berekening van h e t phosphatidegehalte werd aangenomen, dat de melk-phosphatiden gemiddeld 4 % P bevatten.

D e karnemelk, die in h e t proefboterfabriekje van de proefzuivelboerderij uit room m e t 20 % vet werd bereid, b e v a t t e 0,04—0,10 %, gemiddeld 0,08 %, Phosphatiden; d.i. 15 g per 100 g vet.

Karnemelk, bereid u i t weidemelk, bevatte evenveel Phosphatiden als karnemelk u i t stalmelk. H e t pasteuriseeren en h e t zuren van d e n room hadden evenmin invloed op het phosphatidegehalte van de karnemelk als de temperatuurbehandeling van den room. Daarentegen had h e t vetgehalte van den room een grooten invloed. Bij een bewaring van de karnemelk gedurende ca. 10 dagen bij k a m e r t e m p e r a t u u r veranderde h e t phosphatide-gehalte niet.

D e beschreven methode is even goed t e gebruiken voor andere melk-producten en melk als voor karnemelk.

Z U S A M M E N F A S S U N G

Die Literatur über die B e s t i m m u n g von P h o s p h a t i d e n in B u t t e r m i l c h wurde besprochen.

D e r Phosphatidgehalt von einigen. Buttermilchsorten wurde auf drei verschiedenen Weisen b e s t i m m t . Da diese Methoden dieselben Zahlen für den Phosphatidgehalt gaben wurde angenommen, dasz sowohl die Metho-den als die gefunMetho-dene Gehalte richtig waren. Die drei MethoMetho-den waren :

1°. Die Methode von BRODRICK-PITTARD. Sie fordert viel Arbeit und eignet sich nicht für Serienuntersuchungen.

2°. Die Methode von HOLWERDA. Diese Methode ist geeignet für Buttermilch aus gesäuertem B a h m , fordert aber für Süszrahmbuttermilch und andere Molkereiprodukte welche störende P-Verbindungen enthalten,

sehr viel Arbeit. I m Widerspruch m i t der B e h a u p t u n g von HOLWERDA, dasz in Magermilch keine Phosphatide vorkommen, wurde auch darin eine kleine Menge von den g e n a n n t e n Verbindungen (etwa 0,01—0,015 % ) gefunden. Deshalb ist es nicht möglich die Korrektion für störende Phosphor enthaltende Verbindungen durch eine „ P h o s p h a t i d b e s t i m m u n g " in den „ f e t t f r e i " zentrifugierten P r o d u k t e n anzubringen, sondern m a n musz diese B e s t i m m u n g in den Ultrafiltraten ausführen.

3°. Bei der dritten Methode wurden die Phosphatide nach der F e t t -extraktionsmethode von EÖSE-GOTTLIEB extrahiert. Der P-gehalt der E x t r a k t e wurde, n a c h d e m die Trockenmasse nach NEUMANN zerstört war, m i t d e m Reagenz von MEDINGER, nach einer von HOLWERDA ausgearbeite-t e n Meausgearbeite-thode, b e s ausgearbeite-t i m m ausgearbeite-t . E r wurde angenommen, dasz die Phosphaausgearbeite-tide der Milch 4 % P e n t h a l t e n . Diese Methode ( S . 720) ist schnell durchführbar. F ü r eine B e s t i m m u n g b r a u c h t m a n n u r 4 cm3 B u t t e r m i l c h .

Die Methode ist auch für andere Milchprodukte brauchbar.

Die B u t t e r m i l c h von der Versuehsbutterei (von R a h m m i t 20 % F e t t ) enthielt 0,04—0,10 %, im Mittel 0,08 %, P h o s p h a t i d e ; dies bedeutet 15 g Phosphatide auf 100 g F e t t .

Buttermilch, "von L a n d m i l c h h a t t e denselben P h o s p h a t i d g e h a l t wie B u t t e r m i l c h von Stallmilch. Der Phosphatidgehalt der B u t t e r m i l c h wurde weder von der Pasteurisierung u n d der Säuerung, noch von der Temperaturbehandlung, wohl aber von dem F e t t g e h a l t e des B a h m e s beeinfluszt.

Der Phosphatidgehalt der B u t t e r m i l c h änderte sich nicht während einer 10-tägigen Aufbewahrung bei Z i m m e r t e m p e r a t u r .

SUMMARY

A review of literature on t h e estimation of p h o s p h o l i p i d in buttermilk was given.

F r o m some samples of buttermilk t h e phospholipincontents were esti-m a t e d by t h r e e different esti-m e t h o d s . As these esti-methods gave t h e saesti-me result it was concluded t h a t t h e y were right and t h a t t h e figures for t h e lipincontents too were right. The three m e t h o d s were :

1. The method of BRODRICK-PITTARD; a very workable one. 1. The method of HOLWERDA, fit for sour, b u t less fit for sweet butter-milk and other dairyproducts in which disturbing P-compounds occur. Contrary t o t h e s t a t e m e n t of HOLWERDA t h a t skimmilk does not contain any p h o s p h o l i p i d , we found in t h a t product a slight a m o u n t of these compounds (0,01—0,015 % ) . Therefore t h e correction for extractable non-lipin P-compounds, which has to be m a d e when this m e t h o d is used, cannot be found by a phospholipin estimation in skimmilk, b u t has to be determined in an ultrafiltrate of t h e concerning milkproduct.

3. B y t h e third method t h e fat-extraction-method of RÖSE-GOTTLIEB was applied, while t h e phosphorcontents of t h e extract were estimated after a destruction of t h e residu after NEUMANN, with t h e reagent of MEDINGER after a method worked out by HOLWERDA. I t was assumed t h a t

t h e p h o s p h o l i p i d of t h e milk contain 4 % P . This method can be carried out quickly; for one estimation only 4 c m3 buttermilk are sufficient. A detailed description of t h e method was given on page 720.

This method can be used good for other milkproducts as well as for buttermilk.

The buttermilk from cream with 20 % fat, manufactured in t h e experi-m e n t a l butterfactory, contained 0,04—0,10 % (average 0,08 %)

phospho-lipins; this m e a n s 15 g lipins for 100 g fat. • B u t t e r m i l k from stable-milk contained t h e same q u a n t i t y of

phospho-lipins as buttermilk from pasture-milk. Pasteurization and souring of t h e cream, just as t h e t e m p e r a t u r e - t r e a t m e n t , had no influence on t h e lipin-contens of buttermilk, b u t t h e fatcontents of t h e cream had a great influence. The phospholipincontents did not alter when te buttermilk was k e p t at roomtemperature during 10 days.

(1 (2 (3 (4 (5 (6 (7 (8 (9 (10 ( H . (12 (13 (14 (15 (16. (17 (18 (19 (20 (21 (22 (23 A A N G E H A A L D E L I T E R A T U U R W . B . BLOOE, J o u r n . Biol. Chem. 12 (1915) 133.

E . W . B I B D en G. E . SANDS, J o u r n . Dairy Sc. 13 (1930) 453.

E . W . B I R D , D . F . BREAZEALE en G. E . SANDS, Iowa S t a t e College,

Agr. E x p . Stat. E e s . Bull. 175 (1935).

G. B I S C H O F F , Zeitschr. physiol. Chem. 173 (1928) 227.

F . BORDAS en S. DE KACSKOWSKY, Corrupt.-Bend. Acad. Sc. (1902). B . B U R O W , Zeitschr. physiol. Chem. 30 (1900) 495.

L . BURUIANA en A. FURTUNESCO, L a i t 21 (1941) 9.

N. A. BRODRICK-PITTARD, Biochem. Zeitschr. 67 (1914) 382. J . T. CUSICK, Cornell University Agr. E x p . S t a t . , Memoir No. 30

(1920).

O. W . CHAPMAN, J o u r n . Dairy Sc. 11 (1928) 429.

W. VAN DAM en B . J . HOLWBRDA, Versl. landbk. Onderz. $0 (1934) 175.

W . DIEMAIR, B . BLEYER en M. O T T , Biochem. Zeitschr. 272

(1934) 119.

M. DORNIC en M. DAIRE, B e v . gen. du L a i t 8 (1910) 385.

GOULD, Zeitschr. U n t e r s . L e b e n s m . 83 (1942) 309 ( r é f . ) . W . B . GRAHAM en H . D . KAY, J o u r n . Dairy Bes. 5 (1933) 54.

J . GROSZFELD en G. WALTER, Zeitschr. U n t e r s . Lebensm. 68 (1934) 270.

A. F . H E S S en F . D . HELMAN, J o u r n . Biol. Chem. 64 (1925) 781. G. E . H O L M , P . A. W R I G H T en E . F . DEYSHER, J o u r n . Dairy Sc. 16 (1933) 445.

B . J . HOLWBRDA, Versl. landbk. Onderz. 12 (1936) 335.

B . E . HORRALL, P u r d u e University Agric. E x p . Stat., Bull. 501 (1935).

T H . HILDITCH en L . MADDISON, Biochem. J o u r n . 35 (1941) 2 4 ; ref. Chem. Zentralbl. (1942) I 1070.

W . KOCH en H . S. WOODS, J o u r n . Biol. Chem. 1 (1906) 203.

F . E . KURTZ, Bogers Associates: F u n d a m e n t a l s of Dairy Science, 2e d r u k ) , bldz. 77.

(24 (25 (26 (27 (28 (29 (30 (31 (32 (33 (34 (35 (36 (37 (38 (39 (40 (41 (42 (43 (44 J . E . LOBSTEIN en M. FLATTER, L a i t 141 (1935) 946.

J . LYONS en W . FTNLAY, Econ. Proc. Royal Dubl. Soc. I I (1932) 445. M. A. MACHEBOEUF en G. SANDOR, Bull. Soc. Chim. Belg. 14 (1932) 1168.

W . MOHR en I . Moos, Molkerei Ztg. Hildesheim 46 (1932) 1451. W . MOHR, C. BROCKMANN en W . M Ü L L E R , Molkerei Z t g . H i l d e s h e i m , 46 (1932) 634.

H . MULDER, Handelingen Genootschap t.b.v. Melkkunde (1942) I . T. B . OSBORNE en A. J . WAKEMAN, J o u r n . Biol. Chem., 21 (1915) 539. T. B . OSBORNE en A. J . WAKEMAN, J o u r n . Biol. Chem., 28 (1916) 1. W. OSTWALD, Kleines P r a k t i k u m der Kolloidchemie (1920). L . S. PALMER en H . F . W I E S E , J o u r n . Dairy Sc. 16 (1933) 4 1 . W . E . PETERSEN en E . O. H E R R E I D , University Minnesota, Techn. Bull. 63 (1929).

B . R E W A L D , L a i t 17 (1937) 225.

R. SASAKI, Bull. Agr. Chem. Soc. J a p a n 6 (1930) 5 1 , ref.

R. SASAKI en E . HIRATSUKA, Proc. I m p . Acad. Tokyo 7 (1931) 99, ref. H . A. SIRKS, Versl. landbk. Onderz. 41 (1935) 1.

H . A. SIRKS, Jaarverslag van h e t Rijkslandbouwproefstation t e Hoorn 1939, biz. 10.

SCHMID-MÜHLHEIM, J a h r e s b . Fortschr. Tierchemi (1883) 166. G. C. SUPPLEE, Cornell University Agric. E x p . Stat., Memoir No. 29 (1919).

F . TAYEAU, L a i t 20 (1940) 129.

L . M . THURSTON en W . E . PETERSEN, J o u r n . Dairy Sc. 11 (1928) 270. H . F . WTIESE, J . H . NAIR en R. S. FLEMING, I n d . E n g . Chem., Anal. E d . 4 (1932) 362.