Het begrijpen hoe bacteriën groeien en delen is cruciaal om de veelvoudigheid van processen die deze organismen om ons heen reguleren te kunnen waarderen. Ook is het belangrijk en zelfs nodig om zo veel mogelijk informatie te verkrijgen over pathogene stammen om deze beter te kunnen bestrijden. Streptococcus pneumoniae, ook pneumokok genoemd, is een commensale bacterie die een serieuze pathogeen kan worden. De pneumokok is jaarlijks verantwoordelijk voor miljoenen doden doordat deze bacterie gemakkelijk ouderen en mensen met een verzwakt immuunsysteem kan infecteren. Omdat vaccinatie slechts deels effectief is en er veel antibioticaresistente pneumokokkenstammen zijn, is er een dringende behoefte aan nieuwe therapeutische doelwitten. S. pneumoniae is een grampositieve bacterie en is daarom verwant aan Bacillus subtilis. Toch zijn er fundamentele verschillen die laten zien dat ze niet zo nauw aan elkaar verwant zijn als vaak wordt aangenomen. Wat bekend is in andere organismen, is vaak voor de pneumokok nog een grijs gebied.
Belangrijke, onbeantwoorde vragen blijven hoe het geheel aan celdelingseiwitten de exacte mid-cellocatie in S. pneumoniae vindt, en hoe de celdeling synchroniseert met DNA-replicatie en chromosoomsegregatie. In andere, goed bestudeerde modelbacteriën (zoals Escherichia coli of B. subtilis) is het Min-systeem hoofdzakelijk verantwoordelijk voor het lokaliseren van het voornaamste celdelingseiwit FtsZ in het midden van de cel. Echter, hoe cellen de delingsstatus kunnen peilen en hoe dat leidt tot start van DNA-replicatie in deze organismen blijft tot nu toe onduidelijk en is het onderwerp van verschillende hypothesen. Aangezien zowel het Min-systeem als veel andere, geconserveerde mechanismen niet aanwezig zijn in S. pneumoniae, lijkt het erop dat er eigen ontwikkelde systemen zijn. Het identificeren van deze systemen en routes kan nieuwe, tot nu toe onbekende eiwitten aan het licht brengen die potentiële doelwitten kunnen zijn voor nieuwe medicijnen. Het zal zeker relevant zijn om de pijlen te richten op de basis, de kern van de celcycluseiwitten, omdat deze vaak betrokken zijn in essentiële processen en slechts in een deel van de bacteriën geconserveerd zijn. Ideale doelwitten zijn eiwitten die specifiek zijn voor S. pneumoniae, en essentieel voor de groei.
Verschillende methoden kunnen worden gebru ikt om nieuwe, essentiële bacteriële genen te identificeren. De meest gebruikte methode is Transposoninsertie- Sequencing (Tn-Seq). Deze methode werkt op basis van de insertie van transponeerbare elementen in het gehele genoom, om zo onderbrekingen te creëren in genen en operonen. De kwantificatie hiervan door middel van next-generation sequencing kan ons meer vertellen over of een gen overbodig is of juist essentieel. Deze methode leidt echter vaak tot een overschatting van essentiële genen en de experimentele validatie van de verkregen data kan langdurig zijn. Genen die
6
strikt noodzakelijk zijn, kunnen ook niet verder bestudeerd worden met Tn-Seq, omdat deze mutanten niet kunnen groeien. Tn-Seq studies die uitgevoerd zijn met S. pneumoniae suggereren dat ongeveer 350 genen essentieel zijn, waarvan velen een onbekende functie hebben. Om een betrouwbare methode te verkrijgen om genen die essentieel zijn bevonden vlug en gemakkelijk te analyseren, hebben we een induceerbaar systeem gemaakt dat gebaseerd is op CRISPR interference (CRISPRi). Terwijl transposoninsertie het open leesraam of het gen onderbreekt, resulterend in ofwel geen transcriptie ofwel afgebroken translatie, gaat CRISPRi uit van een inactieve vorm van Cas9, dat zich richt op de promotorregio van het beoogde gen en leidt tot geblokkeerde transcriptie. In Hoofdstuk 2 hebben we een aantal bekende genen uitgeschakeld die betrokken zijn bij essentiële routes. Daarvan hebben we de groei, morfologie en het DNA verder geanalyseerd om zo een fenotype- depletiekaart te maken. Vervolgens hebben we ook alle genen die geen bekende functie in S. pneumoniae hebben, maar wel essentieel zijn volgens Tn-Seq studies, uitgeschakeld en de depletiefenotypes verder geanalyseerd en vergeleken met onze fenotypekaart. Deze aanpak maakte het voor ons niet alleen mogelijk om diverse genen te annoteren die eerder genegeerd waren of verkeerd geannoteerd werden door geautomatiseerde bioinformaticamethodes (bijvoorbeeld murT en gatD, beiden betrokken bij de biosynthese van peptidoglycaan) maar ook om twee nieuwe eiwitten te identificeren (TarP en TarQ) die beiden betrokken zijn bij de biosynthese van teichoïnezuren. Het gebruik van CRISPRi maakte het mogelijk om juist die genen waarvan de deletie lastig te bestuderen is te onderzoeken en demonstreerde de betrokkenheid van protease ClpX in de ontwikkeling van competentie.
Tussen de onbekende eiwitten die geclassificeerd zijn als betrokken bij DNA- / chromosoomreplicatie (ofwel waar CRISPRi-depletie leidde tot cellen zonder DNA en met vertraagde groei) hebben we ook het eiwit CcrZ gevonden. In Hoofdstuk 3 demonstreren we dat CcrZ een nieuwe DNA-replicatieregulator is die de celdeling co-reguleert met de chromosoomreplicatie. In bacteriën is de belangrijkste initiator van DNA-replicatie DnaA verantwoordelijk voor het rekruteren van het DNA-replicatiecomplex op de specifieke startplek van de replicatie, de origin, maar er is weinig bekend over de verdere replicatie. In S. pneumoniae vindt DnaA- gemedieerde replicatie van begin tot beëindiging plaats in het midden van de cel. Hoe cellen bepalen om slechts één nieuwe replicatieronde per celdeling uit te voeren, is onbekend. We laten zien dat de voorspelde fosfotransferase CcrZ een interactie aan kan gaan met het belangrijke celdelingseiwit FtsZ, dat lokaliseert op de celdelingsplek, mid-cel. CcrZ blijkt essentieel te zijn voor DnaA-gemedieerde DNA- replicatie-initiatie, omdat de deletiecellen slecht repliceerden en er abnormale septa gevormd werden. Welbeschouwd is de coördinatie door CcrZ is een effectief systeem dat ervoor zorgt dat replicatie alleen op mid-cel plaatsvindt en dat een nieuwe ronde
6
van DNA-replicatie begint als CcrZ op de nieuwe delingsplek lokaliseert. Dit wijst op een sterke correlatie tussen de celdeling en de DNA-replicatie in S. pneumoniae.
In Hoofdstuk 4 laten we zien dat de lipide-samenstelling cruciaal is voor de morfologie van de cel en het overleven van S. pneumoniae. Eerder was aangetoond dat de deactivatie van het eiwit PapP leidt tot sterke afname van de pathogeniteit van de pneumokok. Bij de deletie van papP zagen we morfologische defecten en afwijkende lokalisatie van de celdelingseiwitten FtsZ en FtsA. We stelden vast dat PapP een DHH-subfamilie-1-fosfatase is, die AMP maakt van pAp (fosfoadenosine-5’- fosfaat), een vetzuur-biosyntheseremmer. Deze verandering in lipide-samenstelling was direct verantwoordelijk voor de verandering in morfologie, wat duidt op een verband tussen de celdeling en de lipide-samenstelling van het membraan.
Het werk in dit proefschrift maakt de weg vrij voor de identificatie van nieuwe celcyclusregulatiemechanismen die wellicht geconserveerd blijken te zijn voor een breed scala aan bacteriën. De verkregen data kan ook relevant zijn voor toekomstig onderzoek naar nieuwe antibacteriële verbindingen en bijdragen aan het begrip van tot nu toe minder goed bestudeerde organismen.