Bacteriën zijn essentieel voor leven. Deze organismen zijn ongeveer 1µm (oftewel 1/1000ste van een millimeter) groot en dragen bij aan allerlei essentiële processen.
Het bestuderen van de onderliggende biologie kan bijdragen aan een beter begrip van deze gigantische, maar microscopisch kleine wereld. Sommige bacteriën kunnen infecties veroorzaken. Daarom is het van belang om hun groei te stoppen en zo de vermeerdering en een erge invasie van de bacteriën in het lichaam te voorkomen. Streptococcus pneumoniae is een bacterie die normaal gesproken gevonden wordt in de keel van gezonde mensen, maar de bacterie kan een ziekmaker worden die leidt tot longontsteking of hersenvliesontsteking. Bij dit soort ontstekingen worden vaak antibiotica als effectieve middelen gebruikt. Deze over het algemeen synthetische moleculen inactiveren voornamelijk cruciale, essentiële eiwitten. Echter, meer en meer stammen worden resistent tegen verschillende antibiotica. Om nieuwe antibiotica te ontwikkelen is het cruciaal om de biologie van de pneumokok te begrijpen. Deze bacterie heeft de vorm van een rugbybal en deelt zich in het midden van de cel, de evenaar van de cel, door het samenknijpen van de cel tot twee nieuwe cellen. Hoe dit gebeurt, door middel van een speciaal “delingsmachientje” dat precies op de evenaar zit, snappen we eigenlijk nog niet zo goed. Daarnaast is het zo dat terwijl de moedercel langzaam twee dochtercellen maakt, ook het DNA (het chromosoom) zich rond de evenaar bevindt, en zich vermeerdert tot twee exemplaren voor de twee nieuwe dochtercellen. Dit proces wordt de replicatie genoemd. Deze celdelings- en replicatieprocessen zijn essentieel in de zin dat als één van deze twee mechanismen wordt geïnactiveerd, ook de pneumokok stopt met groeien. Een eiwit dat hierbij betrokken is, is daarom ook een ideale kandidaat voor een antibacterieel medicijn. Op grote schaal fenotyperen voor het karakteriseren van onbekende eiwitten
Eiwitten zijn de producten van genen (bestaande DNA-sequenties) en de aanmaak ervan kan direct geblokkeerd worden op genniveau. Een manier om essentiële genen te vinden is willekeurig elk gen te inactiveren en te zien of ze al dat niet essentieel zijn (S. pneumoniae heeft ~2.000 genen). Deze methode heet Tn-Seq (wat staat voor transposoninsertiesequencing) en kan worden gebruikt om kleine stukjes DNA willekeurig in alle pneumokokgenen in verschillende cellen in te brengen, om op die manier de genen te inactiveren. Na het groeien van alle cellen met verstoorde genen, genaamd een ‘bibliotheek’, kunnen eigenlijk alleen de cellen overleven waarin slechts overbodige genen zijn geïnactiveerd. De genen die niet geïnactiveerd zijn, zijn dus essentieel. Door middel van deze techniek zijn er zo rond de 350 genen ontdekt die essentieel zijn voor pneumokokken.
Desalniettemin kost het valideren van de essentialiteit van deze genen met traditionele methoden, waarbij elk gen apart wordt verwijderd, veel tijd. Daarom
6
maken we gebruik van de CRISPRi techniek, die heel simpel en snel elk gen kan inactiveren (Hoofdstuk 2). We inactiveerden alle genen die essentieel bleken te zijn of waarvan de functie onbekend was. Daarbij keken we naar de groei en de vorm van elke mutant met behulp van de microscoop. Het fenotype, dus hoe ze er uit zien qua vorm en bijvoorbeeld hoe ze groeien, werd verder geclassificeerd om zo alles in beeld te krijgen in een specifieke “fenotypische kaart”. Door het vergelijken van deze fenotypen van mutanten met fenotypen die al wel gelinkt zijn aan genen, waren we in staat om ook de functie van deze eerder onbekende genen te bepalen. Op deze manier vonden we dat twee eiwitten (MurT en GatD) betrokken waren bij het aanmaken van de celwand, een beschermende barrière van de cel. We vonden ook dat TarP en TarQ betrokken zijn bij de productie van teichoïnezuren, specifieke essentiële moleculen die verankerd zijn in de celwand.
Een ring die de celcyclus synchroniseert
Door middel van de screening uit Hoofdstuk 2 hebben we ook een tot nu toe onbekend eiwit geïdentificeerd dat betrokken leek bij processen rondom het DNA. Dit eiwit hebben we CcrZ genoemd (Cell cyclus regulator Z) (Hoofdstuk 3). In een normale situatie moet S. pneumoniae er voor zorgen dat er slechts één chromosoom per cel is. Daarom moet de bacterie, als deze zich deelt tot twee nieuwe cellen, ook het DNA kopiëren op het goede moment en slechts één keer. Hoe een cel weet dat dit in gang gezet moet worden, wisten we nog niet, ook niet van andere bacteriën. We hebben nu dit coördinerende eiwit gevonden dat juist deze celdeling aan het kopiëren van DNA linkt. We vonden dat CcrZ ook lokaliseert op de evenaar van de cel, op de delingsplaats. In cellen zonder dit eiwit zagen we dat het kopiëren van DNA ernstig was verstoord. CcrZ kan dus kennelijk het startsein van deze DNA- replicatie activeren. Dit betrekkelijk simpele systeem zorgt er voor dat wanneer cellen beginnen met delen, de chromosoomreplicatie dan ook start tot een nieuwe ronde van celdeling.
De samenstelling van het membraan is cruciaal voor de vorm van de cel
Wanneer een cel deelt, produceert het meer celwand op de delingsplek voor het maken en “groeien” van twee nieuwe cellen. Er is een ongelofelijke hoeveelheid onderzoek gedaan om te begrijpen hoe de celwandsamenstelling de vorm van de cel beïnvloedt. Bovendien ligt er onder de celwand een lipidemembraan, een dubbele laag van vetzuren waar water onmogelijk doorheen kan. Zonder celwand verliest de cel zijn vorm en zonder membraan is er geen levende cel mogelijk, omdat dat nodig is voor de energieproductie (en voor nog vele andere eigenschappen). Daarom is het heel belangrijk om te begrijpen hoe veranderingen in de lipidesamenstelling de cel beïnvloedt. In Hoofdstuk 4 hebben we een eiwit (PapP) gekarakteriseerd dat belangrijk is voor de aanmaak van die lipides. We hebben laten zien dat er zonder
6
dit eiwit vormdefecten waren en dat er een impact was op de celdelingsorganisatie. We concludeerden hieruit dat deze veranderingen van lipidesamenstelling ook de vloeibaarheid van het membraan veranderden en daarom defecten in het celdelingsproces veroorzaakten.
In dit proefschrift hebben we diverse onbekende en eerder onvolledig gekarakteriseerde eiwitten geïdentificeerd en bepaald hoe ze verwikkeld zijn in de groei en deling van de pneumokok. Dit werk kan in de toekomst bijdragen aan de ontwikkeling van antimicrobiële stoffen om zo een slag te leveren tegen pneumokokinfecties. Bovendien verbreedt dit ook onze kennis over essentiële processen in andere type bacteriën.