Op DUX4 mRNA kan men ingrijpen ter hoogte van het DUX4 ORF of ter hoogte van regulerende sequenties.
Ter hoogte van het mRNA kan men inwerken op twee mechanismen: ‘Cleavage and polyadenylation’ (CPA) enerzijds en splice modulatie anderzijds. Bij CPA zijn AO’s tegen het PAS- signaal het meest efficiënt. AO’s tegen andere plaatsen betrokken in CPA waren duidelijk minder efficiënt of niet bruikbaar omwille van de veiligheid. Bij splice modulatie zijn AO’s tegen splice acceptor site van exon 3 het meest efficiënt (21). Beide targets geven een significante daling van
41
het DUX4 mRNA in differentiërende myogene celculturen en in vivo in ‘muscle xenografts’. De resultaten suggereren dat de daling efficiënter is met AO’s tegen PAS. De studie van Chen (2016) testte zowel een AO tegen het PAS-signaal als een AO tegen een splice site. De AO tegen het PAS was efficiënter in DUX4 mRNA reductie. Chen (2016) maakte echter gebruik van een splice site die enkel gebruikt wordt tijdens alternatieve splicing. Hierdoor wordt niet al het DUX4 mRNA getarget, wat de mindere efficiëntie mogelijks verklaart (21). Tevens zijn de in vivo resultaten van de studies niet te vergelijken aangezien men ze via een andere techniek heeft geïnterpreteerd. Ter hoogte van het DNA kan men zowel de D4Z4 regio targetten als de regio net upstream van de D4Z4 repeat array. De regio upstream van de D4Z4 repeats is belangrijk in de regulatie van de D4Z4 regio. De resultaten van deze review laten toe te suggereren dat de upstream regio betrokken is zowel in de repressie als de derepressie van de D4Z4 regio. Enerzijds is het via siRNA’s betrokken in de epigenetische repressie van de D4Z4 regio (34), anderzijds is het betrokken in de derepressie via transcriptie van DBE-T RNA (33). Deze twee mechanismen zijn niet tegengesteld maar een aanvulling op elkaar.
Ter hoogte van de D4Z4 regio ontstaan verschillende niet-coderende sense en antisense transcripten (32). Endogene siRNA’s zijn, via epigenetische repressie, betrokken in het verkrijgen en behouden van de gesloten conformatie van de D4Z4 regio (zie paragraaf 2.5). siRNA’s zijn in staat te binden ter hoogte van de D4Z4 regio zelf maar ook ter hoogte van de regio upstream van de D4Z4 regio. Binding van siRNA’s upstream verhoogt de epigenetische repressie (34). Dit mechanisme is intact bij mensen met FSHD1.
Bij gezonde personen is de upstream regio daarnaast sterk verrijkt met H3K27me3, kenmerk van PCR2, en wordt ook sterk gebonden door PCR1 (19, 33). Contractie van de D4Z4 repeats geeft een daling van PCR1 binding, wat copy number dependent is (19). Contractie geeft daarnaast een daling ter hoogte van de upstream regio van PCR2 gemedieerde suppressie en daarmee een daling van zijn geassocieerde H3K27me3 merker ter hoogte van de upstream regio (33). Dit is opvallend aangezien PCR2 gemedieerde suppressie niet ‘copy number dependent’ is ter hoogte van de D4Z4 regio zelf (19). Ter hoogte van de D4Z4 regio zelf zijn de PCR2 binding en de H3K27me3 merker nog intact (19, 30). Verlies van H3K27me3 geeft een relaxatie van de regio upstream van de D4Z4 regio. Relaxatie maakt transcriptie van DBE-T RNA mogelijk (33). Dit is een long non-coding RNA-fragment dat door de D4Z4 regio loopt maar zijn TSS upstream van deze regio heeft. Het DBE-T RNA is in staat ASH1L, een antagonist van PCR2 te rekruteren, en zo derepressie van de D4Z4 regio te induceren (zie paragraaf 2.5.3) (33).
42
Het belang van de upstream D4Z4 regio dat blijkt uit deze resultaten gaat in tegen de studie van Himeda (2016). Zij gebruikten een sgRNA gericht tegen exon 1 dat tevens de upstream regio targette (Afbeelding 14). Dit gaf een toename van de repressie ter hoogte van de upstream regio. Zij besloten echter dat dit een achtergrondmechanisme was als gevolg van toeval en schreven de volledige DUX4 suppressie toe aan targetten van exon 1. Deze resultaten tonen aan dat de upstream regio betrokken is in regulatie van de D4Z4 regio en dus niet gezien kan worden als een achtergrond mechanisme.
Targeted therapie kan op beide mechanismen ingrijpen om de derepressie tegen te gaan. Enerzijds kan men de epigenetische repressie via siRNA’s versterken door het geven van exogeen siRNA’s tegen de upstream regio. Exogene siRNA’s blijken een effectieve manier om de DUX4 expressie te laten dalen. Anderzijds kan men proberen de PCR2 gemedieerde repressie te stimuleren.
PCR2 gemedieerde suppressie stimuleren kan ook effect hebben ter hoogte van de D4Z4 regio zelf. Ter hoogte van de D4Z4 regio zelf is PCR2 gemedieerde suppressie essentieel. In cellen van gezonde personen ziet men dat de D4Z4 tandem repeats sterk gebonden worden door PCR1 en PCR2 (33). Contractie bij FSHD1 patiënten geeft een daling van het ‘copy number dependent’ PCR1. Contractie geeft echter geen daling van de PCR2 binding of van zijn geassocieerde H3K27me3 ter hoogte van de D4Z4 regio (19, 30, 33). Wel ziet men een 4-voudige daling van H3K27me3 ter hoogte van de tandem repeats in FSHD-cellen die DUX4 tot expressie brengen in vergelijking met FSHD-cellen die DUX4 niet tot expressie brengen (30). Dit komt overeen met het feit dat 95% van de FSHD-cellen in staat is om DUX4 expressie tegen te gaan. Slechts 5% van de cellen kan dit niet, deze cellen worden gekenmerkt door een daling van de PCR2-gemedieerde suppressie ter hoogte van de D4Z4 regio (30). Men kan hieruit concluderen dat PCR2 gemedieerde suppressie essentieel is in FSHD1.
De studie van Balog 2015 gaf aan dat PCR2 betrokken is in de repressie van FSHD2 maar niet van FSHD1. Zij concludeerden dit op basis van het feit dat H3K27me3 niet verschillend is tussen FSHD1-cellen en controle-cellen. De studie van Haynes, 2018, die pas 3 jaar later verscheen en het verschil aantoonde in H3K27me3 tussen FSHD1-cellen die DUX4 tot expressie brengen en diegene die dit niet doen, laat ons nu toe dat tegen te spreken en te zeggen dat PCR2 essentieel is in de suppressie van DUX4.
PCR2 gemedieerde suppressie heeft dus effect zowel op de regio upstream van de D4Z4 tandem repeats, als op de D4Z4 tandem repeats zelf. Targeted therapie die de PCR2 gemedieerde DUX4-
43
suppressie laten toenemen zijn tot nu toe nog weinig bekend, maar zouden een zeer goede interventieplaats zijn. In dit kader is het belangrijk verder onderzoek te verrichten naar de mechanismen die de D4Z4 repeats in staat stellen PCR2 te rekruteren (33). Tot nu toe is dit onbekend. Wel weet men dat het onafhankelijk is van aantal D4Z4 repeats, CpG methylatie en H3K9me3 (19, 30). Deze merkers zijn namelijk gedaald in FSHD-cellen ten opzichte van controle- cellen, terwijl de PCR2 rekrutering hetzelfde blijft. In dit opzicht is verder onderzoek naar mechanismen die een invloed uitoefenen op H3K9ac ook belangrijk. Deze merker is toegenomen in FSHD-cellen die DUX4 tot expressie brengen in vergelijking met FSHD-cellen die DUX4 niet tot expressie brengen. De literatuur hieromtrent is beperkt. NuRD, met zijn core proteïnen HDAC1 en HDAC2, kan in dit kader belangrijk zijn en vereist verder onderzoek.