Verdubbelde haploïede (VH)

Haploïede plante kom teen ‟n lae frekwensie in die natuur voor. Haploïede kan in teelprogramme gebruik word om volledig homosigotiese, diploïede plante (VH) in ‟n enkele generasie te produseer, in vergelyking met die ses generasies wat dit met konvensionele inteling sou neem, wat die ontwikkeling en vrystelling van nuwe kultivars uiteindelik versnel. (Thomas et al., 2003) Nog ‟n voordeel van VH is dat resessiewe gene in haploïede plante uitgedruk word. Die kans om ‟n spesifieke resessiewe genotipe in die haploïede nageslag waar te neem is ½^x, waar x die hoeveelheid heterosigotiese loci verteenwoordig. Die kans om dieselfde genotipe waar te neem wanneer konvensionele intelingsmetodes gebruik word, is ¼^x. Seleksie vir kenmerke wat deur resessiewe gene beheer word is moontlik, aangesien uitdrukking van die gene nie deur dominante gene verskuil word nie. (Lesch, 1997) Die homosigositeit wat verkry word wanneer ‟n VH sisteem gebruik word, verhoog die doeltreffendheid van seleksie vir beide kwalitatiewe en kwantitatiewe eienskappe. Dit verlaag ook die variasie tussen individuele plante van dieselfde populasie (Hu, 1997). Die tekortkominge van VH is dat slegs een siklus van rekombinasie toegelaat word voordat die gene gefikseer word. Boonop word ‟n lukrake versameling gamete gefikseer en genetiese dwaling (“drift”) kan veroorsaak dat slegs ‟n klein proporsie lyne aan die verlangde kriteria voldoen (Hu, 1997). Uit ‟n praktiese oogpunt is die VH tegnieke dikwels duur en vereis dit tegniese vaardigheid van die navorser. Die groen plant regenerasiefrekwensie is ook dikwels laag en albino plante is volop in die nageslag, veral met gebruik van die helmknopkultuur-tegniek. Daarbenewens verleen nie alle genotipes hul tot in vitro vermeerdering nie. Indien die moontlike tekortkominge egter effektief aangespreek en/of bestuur word, kan die VH metode as ‟n integrale komponent in kultivarontwikkeling benut word, soos tans die geval by die welbekende Suid-Afrikaanse saadmaatskappy, Sensako, se koringteelprogramme. Die proses om haploïede in vitro te produseer kan in die algemeen in drie fases verdeel word: (1) die induksie van mikrospoor-verhaalde embrios of kallusse; (2a) plant regenerasie vanaf embrios (embriogenese) of (2b) die inisiasie en ontwikkeling van stingels en wortels (organogenese); en (3) chromosoomverdubbeling van geregenereerde plante, indien nodig (Kim & Baenziger, 2005). Daar is verskeie metodes wat vir die in vitro ontwikkeling van VH aangewend kan word: gino- en

38 androgenese, waar haploïede plante van stuifmeelkorrels of onbevrugte eierselle ontwikkel word; genoom-eliminasie, waar ‟n onverwante spesie as stuifmeeldonor gebruik word; semigamie, ‟n abnormale bevrugtingsproses waar die manlike gameet die eiersel bevrug, maar nie daarmee saamsmelt nie; chemiese behandeling; met behulp van fisiese agente soos bestraling; en deur die toediening van hoë of lae temperatuurskokke (Taji et al., 2002). Daar sal voorts aan metodes wat reeds suksesvol in koring aangewend is aandag geskenk word.

(a) Helmknopkulture en mikrospoor-embriogenese (androgenese)

Androgenese berus op die beginsel dat die normale ontwikkeling van die manlike gametofiet gewysig word om sporofities te word, wat, in die aanwesigheid van toepaslike groeimedium, tot die ontwikkeling van kallusse en embrios lei. Die haploïede chromosoomkompliment van die plante wat hieruit geregenereer word moet daarna verdubbel word om homosigotiese, diploïede plante te produseer. Vir hierdie tegniek word helmknoppe van die koringplant op regenerasiemedium uitgeplaat, terwyl stuifmeel (mikrospore) in vloeibare suspensie gekweek kan word. Tydens regenerasie kan die kulture deur ‟n kallusfase gaan (organogenese) of direk in embrios ontwikkel (embriogenese). Laasgenoemde word verkies in gevalle waar daar op plant-verbetering gefokus word, aangesien elke plant (“regenerant”) vanaf ‟n enkele mikrospoorsel afkomstig is. Indien daar van in vitro seleksie gebruik gemaak gaan word, word organogenese verkies omdat ‟n kallusfase normaalweg met gametoklonale variasie geassosieer word (Hu, 1997).

Die grootste voordeel van androgenese is dat dit die potensiaal het om meer as ‟n duisend haploïede plante per helmknop te produseer in vergelyking met ander metodes wat tot een haploïed per blommetjie beperk word (Kim & Baenziger, 2005). Die eerste kultivar wat sy oorsprong in helmknopkulture gehad het, was die Chinese “Jinghua No. 1”, wat in 1986 vrygestel is. Die suksesvolle ontwikkeling van VH vanaf helmknoppe en stuifmeel is egter van ‟n groot verskeidenheid veranderlikes afhanklik: genotipe, omgewingstoestande en die fisiologiese status van die donorplante, voorafbehandeling van die donorplante, die chemiese samestelling en gebruik van groeireguleerders in die groeimedium, inkubasietoestande en laastens die lengte van die induksie. Sekere aspekte rakende die tegniek, te wete die

39 kompleksiteit daarvan, genotipe-afhanklikheid, albinisme in die nageslag en die lae frekwensie van kallusse, embrios en groen plante, behoort aangespreek te word voordat androgenese as ‟n roetine tegniek in teelprogramme aangewend word. (Pauk et al., 2004; Kim & Baenziger, 2005)

(b) Onbevrugte eierselkulture (ginogenese)

Vir die kweek van onbevrugte eierselle in vitro word ‟n soortgelyke prosedure as dié van androgenese gevolg. Dit is nie ‟n algemeen gebruikte tegniek nie, hoofsaaklik vanweë die lae regenerasie van haploïede. Die prosedure is reeds suksesvol in koring aangewend, maar die protokol sal heelwat verfyn moet word (Niroula & Bimb, 2009). Daar word egter meer aandag aan die verbetering van die protokolle vir androgenese geskenk, aangesien die hoeveelheid eierselle in ‟n koringplant aansienlik minder is as die hoeveelheid helmknoppe en die kweek van helmknoppe dus meer potensiaal vir die ontwikkeling van ‟n groot haploïede populasie het (Hu, 1997).

(c) Wye kruisings: die Hordeum bulbosum chromosoom-eliminasie tegniek

Die bulbosum tegniek is oorspronklik vir gars (Hordeum vulgare) ontwikkel en is later ook vir koring aangepas. Hierdie tegniek behels dat die teikenplant (koring) met ‟n geneties verwyderde spesie van dieselfde genus, in hierdie geval Hordeum bulbosum, bestuif word. Na kruising vind saadontwikkeling vir ongeveer 10-14 dae plaas, waarna die embrio gered en verder in vitro gekweek moet word. Tydens die ontwikkeling van die hibried-sigoot word die bulbosum chromosome geëlimineer en ‟n haploïede koringembrio word verhaal. Beide diploïede en tetraploïede bulbosum kan gebruik word, hoewel meer sukses met laasgenoemde behaal is (Hu, 1997). Die ontwikkeling van die embrios en die sukses van die tegniek berus op verskeie faktore, waaronder die aanvoelbare pre- en post-bestuiwing temperatuur, die tydsberekening van kruisings en embrioredding, die regenerasiemedium, die korrekte toediening van groeireguleerders na bestuiwing en die genotipe van die koringplante (Lesch, 1997; Devaux & Pickering, 2005). Die kruisbaarheid van koring met Hordeum bulbosum word geneties beheer en word beperk tot genotipes wat homosigoties

40 resessief is vir die koring kruisbaarheidsgene Kr1 en Kr2 (wat ook vir die kruisbaarheid met rog verantwoordelik is) wat op chromosome 5A en 5B onderskeidelik geleë is. Hoewel die bulbosum tegniek gereeld suksesvol in garsteelprogramme aangewend word, is die sukses daarvan in koring egter beperk. (Niroula & Bimb, 2009)

(d) Wye kruisings: mielie (Zea mays) x koring kruisings

Hierdie tegniek berus op dieselfde beginsel as die bulbosum tegniek, met die verskil dat mieliestuifmeel gebruik word. Koringare word ontman en met mieliestuifmeel bestuif. Sitokinien word toegedien om saadontwikkeling te fasiliteer. Die ontwikkelende hibried sigoot bevat 21 koring- en 10 mieliechromosome. Die sigoot is egter kariotipies onstabiel en tydens die daaropvolgende seldelings word die mieliechromosome geëlimineer, moontlik omdat die sentromere nie aan die spindels heg nie en dus nie na die selpole getrek word nie. ‟n Embrio met ‟n haploïede koringchromosoomkompliment word verhaal. Embrios word na 15-21 dae gered, waarna dit op regenerasiemedium vir in vitro regenerasie geplaas word. Haploïede plantjies word met kolgisien behandel om verdubbeling van die chromosoomgetal te induseer. (Niroula & Bimb, 2009)

Die chromosoom-eliminasie tegnieke word algemeen vir die produksie van haploïede in monokotiele spesies aangewend. Voordele hieraan verbonde is dat dit minder tyd in beslag neem en dus meer doeltreffendheid as ander tegnieke is. Daar word ook meer genetiese stabiliteit in die nageslag waargeneem, hoewel navorsing rakende hierdie aspek beperk is. Studies het getoon dat die mielie-tegniek 3-4 maal meer effektief as die helmknopkultuur-tegniek is (Niroula & Bimb, 2009). Dit word toegeskryf aan groter getalle embrios wat ontwikkel en ontkiem, asook die afwesigheid van albinisme in die nageslag. Albinisme is veral by helmknopkulture ‟n beperkende faktor. Hoewel beide die koring- en mieliegenotipes ‟n beduidende invloed op die sukses van die mielie-tegniek het, is dit in ‟n mindere mate daarvan afhanklik as wat helmknopkulture- en die bulbosum metode is. (Niroula & Bimb, 2009)

41 Die mielie-tegniek is oorspronklik deur Laurie en Bennet (1988) ontwikkel. Verskeie pogings is intussen aangewend om die protokol te verfyn. Fokusareas was die kruisingstegniek, groeireguleerder-toediening en die samestelling van die weefselkultuurmedium (Verma et al., 1999). Die protokol wat hier gebruik word, is ontwikkel deur Pienaar et al. (1997) met die oog op die produksie van VH in Suid-Afrika.

2.4.2 Vergelyking tussen VH en ander metodes vir die ontwikkeling van