3.6.1 Beschrijving van de biomarker-analyses
Van een deel van de F1 stekelbaarzen die zijn opgegroeid in de mesocosms in de zuiveringsmoerassen (zie hoofdstuk 3.4) zijn de levers uitgeprepareerd en gereed gemaakt voor ‘transcriptomics’- onderzoek, waarbij met één analyse de expressie van 15.000 genen werd geanalyseerd. De genexpressie van de stekelbaarzen uit de moerassystemen is vergeleken met die uit een niet blootgestelde controlegroep. Verschillende stressfactoren (zoals giftige stoffen) kunnen de expressie van bepaalde genen remmen of stimuleren, waardoor verschillen tussen blootgestelde en niet blootgestelde vissen een indicator kunnen zijn voor de toxische stress van het RWZI-effluent. De verschillen in genexpressie tussen controles en blootgestelde stekelbaarzen werden met uitgebreide statistische en bioinformatica-pakketten geanalyseerd.
3.6.2 Belang van het biomarker-onderzoek
Het oppervlaktewater kan verontreinigd zijn met naar schatting ruim honderdduizend stoffen die mogelijk giftig zijn (Depledge en Fossi, 1994). Het is onmogelijk om het milieurisico van het complexe mengsel chemische verontreinigingen te schatten, omdat i. het technisch en financieel onmogelijk is om al deze stoffen chemisch te analyseren, ii. van de meerderheid van de stoffen weinig of niets bekend over de toxiciteit, iii. de biologische beschikbaarheid van de stoffen niet bekend is, iv. de mengseleffecten (versterking of verzwakking van toxiciteit) onbekend zijn en v. de effecten van giftige omzettingsproducten niet bekend zijn. Om een enigszins betrouwbare schatting te kunnen maken van de milieurisico’s van het RWZI-effluent moet dus niet alleen naar stoffen, maar vooral naar toxische effecten worden gekeken.
De biochemische veranderingen in levende waterorganismen die indicatief zijn voor de waterkwaliteit worden biomarkers genoemd. Biomarkers kunnen al een respons vertonen als nog geen nadelige effecten op de organismen te zien zijn, waardoor ze als vroege waarschuwing voor mogelijke effecten van milieuverontreiniging kunnen worden gebruikt. Genexpressie zoals met het transcriptiomics onderzoek voor de stekelbaarzen is bepaald kan worden beschouwd als in-vivo biomarker. De biomarker-analyses zijn toegepast als gevoelige indicator om de milieurisico’s van de RWZI effluenten en de mogelijke effecten op het welzijn van in het moeras levende vissen te analyseren. Doordat vissen zijn blootgesteld aan water uit verschillende posities in het moeras kan ook het zuiveringsrendement (de mogelijke vermindering van de milieurisico’s) van de systemen worden beoordeeld.
3.6.3 Het (milieu)risico van de RWZI-effluenten
Het hoofdexperiment voor dit werkpakket zou worden uitgevoerd met 20 stekelbaarzen (10 man- netjes en 10 vrouwtjes) per positie. Op enkele posities waren echter onvoldoende vissen aanwezig
Figuur 15 Principale componentanalyse (PCA) op de genexpressie van mannelijke (Male) en vrouwelijke (Female) stekelbaarzen, gemiddeld van alle onderzochte locaties/posities. Waarop te zien is dat de genexpressie van de niet blootgestelde vissen (Blank)afwijkt van de in de zuiveringsmoerassen blootgestelde exemplaren.
Er werden duidelijke effecten gevonden op de totale genexpressie van vissen uit de zuiveringsmoerassen ten opzichte van de niet blootgestelde blanco vissen (Figuur 8). Ook binnen de zuiveringsmoerassen was het veelal mogelijk om op basis van de genexpressie de verschillende posities te onderscheiden.
Deze gegevens laten zien dat de stekelbaarzen uit de moerassen met RWZI-effluenten aan andere prikkels waren blootgesteld dan de controlevissen. De meeste genexpressie-biomarkers zijn niet alleen gevoelig voor chemische verontreiniging, maar ook voor factoren zoals voedsel, micro- biologische verontreiniging (pathogenen), predatie, competitie, etc. Het is daarom belangrijk om bij de beoordeling van de resultaten ook rekening te houden met de mogelijke invloed van deze factoren.
Om de mogelijk nadelige effecten van RWZI-effluent te analyseren is een nader bioinformatica- onderzoek uitgevoerd op individuele genen en clusters van genen die bepaalde processen aansturen.
Figuur 16 Vitellogenine-expressie in stekelbaars, gemiddelden per groep, genormaliseerd naar vrouwelijke blanco’s, ; = significante remming van VTG’s in vrouwelijke vis; = stimulatie van VTG- expressie in mannelijke vis (ruim 10x hoger, niet significant door hoge spreiding)
Zoals verwacht is er sprake van hormoonverstoring door RWZI-effluent, maar de effecten van anti- estrogenen lijken sterker dan die van estrogene stoffen. Het is opvallend dat de anti-estrogene effecten (VTG remming ♀) overheersen en dat deze in Cuijk alleen optreden op de posities C1 en C4, waar geen estrogeen effect (VTG stimulatie ♂) wordt waargenomen. De (anti)estrogene effecten kunnen mogelijk invloed hebben op de voortplanting van de vissen, hoewel geen effecten werden gevonden bij de reproductieproef). Hierbij moet worden aangetekend dat de reproductie van vissen uit de locaties C2 en C3 niet kon worden onderzocht door een hoge sterfte in deze mesocosms (alle vis werd gebruikt voor het biomarkeronderzoek).
De expressie van cytochroom P450 (CYP1A), een enzym met een belangrijke rol bij o.a. ontgifting, was significant verhoogd in stekelbaars van Grou en Land van Cuijk, terwijl de expressie in Hapert niet veranderde. Omdat CYP1A wordt gestimuleerd na blootstelling aan stoffen met dioxine-achtige activiteit (zoals PCB’s en PAK’s) is het waarschijnlijk dat de vis uit deze twee moerassen aan dergelijke stoffen werd blootgesteld. In de pilotstudie van 2010 werd in de F0-vis uit het Land van Cuijk een verhoogde expressie gevonden van genen die betrokken zijn bij DNA-reparatie, wat een indicatie kan
responsen (o.a. glucocorticoïden) en glucosemetabolisme op veel locaties verhoogd, terwijl de expressie van genen die betrokken zijn bij celdeling, DNA-replicatie, mitochondriën (energievoorziening), cholesterol-biosynthese en eiwittransport op veel locaties verlaagd waren. Er was een sterke overeenkomst in veranderingen in genexpressie na blootstelling aan alle RWZI- effluenten, die alleen op detailniveau verschilden. Ook waren er duidelijke verschillen in respons tussen mannelijke en vrouwelijke vissen. Het effect van een aantal van deze genetische veranderingen ten opzichte van de niet blootgestelde vissen lijkt voor de gezondheid van de vis niet gunstig te zijn.
3.6.4 Vermindering van het milieurisico van het RWZI-effluent door het
zuiveringsmoeras
Om de invloed van het zuiveringsmoeras op de stekelbaarzen te bepalen is onderzocht of de gevonden effecten op de totale genexpressie ten opzichte van de niet blootgestelde controle vissen afnamen van positie 1 naar positie 4 in de zuiveringsmoerassen. Het bleek dat zowel voor de gestimuleerde als de geremde genen de expressie niet terugkeerde naar de niveaus van de controles, maar daar juist verder vanaf lag op positie 4. Wanneer gekeken wordt naar de verschillen tussen posities 1 en 3 van de zuiveringsmoerassen, blijken dat zowel de gestimuleerde als de geremde genexpressies in het Land van Cuijk (alleen ♀, te weinig ♂) en Hapert dichter bij de niveaus van de controle vissen lagen, terwijl die in Grou iets verder van het controleniveau waren verwijderd. Dit kan duiden op een licht positief effect van de eerste twee compartimenten (sedimentatievijvers en rietvelden) van de zuiveringsmoerassen.
Omdat niet ieder verschil in genexpressie schadelijk hoeft te zijn kan het zuiverende effect van de moerassen op de toxische stress beter worden bestudeerd met individuele genen of genclusters. Als we de verschillen in expressie van individuele genen vergelijken met de blanco-controles, dan lijkt er voor de hormoonverstoring in het Land van Cuijk een zuiverend effect op te treden, omdat de sterke vitellogenine-inductie in mannetjes verdwenen is op positie 4 (Figuur 3). Voor de overige onderzochte genen en genclusters zijn deze effecten minder duidelijk. Er is echter nog veel werk te doen om alle mogelijke effecten te onderzoeken.
3.6.5 Aanbevelingen ter optimalisering van het zuiveringsmoeras
Voor de meeste afwijkingen in genexpressie werd trad in de loop van het zuiveringsmoeras geen herstel op. Toch leek een lichte verbetering zichtbaar op de gemiddelde afwijkingen van de controlevis, vooral na de eerste twee compartimenten van de moerassen (sedimentatievijvers en rietvelden). Het is moeilijk hieruit een aanbeveling voor optimalisering van de zuiveringsmoerassen te destilleren; een langere verblijftijd van het water in rietvelden zou een mogelijke aanbeveling kunnen zijn.
bemonstering van de vis uitgevoerd, zodat het lastig is om de toxicologische relaties tussen biomarkers en de overige parameters aan te tonen.
Met een experimentele CTD-enrichment analysis zijn veranderingen in genexpressie gerelateerd aan blootstelling aan bepaalde typen stoffen. Hierbij werden overeenkomsten gevonden tussen stoffen die zowel chemisch als genetisch in de zuiveringsmoerassen werden aangetoond (bijvoorbeeld pyreen, cafeïne, benzo(a)pyreen, chlorpyrifos, hexachloorbenzeen, carbamazepine, acetaminofen). De genexpressie van de vissen zou ook kunnen duiden op blootstelling aan medicijnen zoals resveratrol, fluorouracil, irinotecan en cytaribine, die worden toegepast bij de chemotherapie tegen kanker en ethynylestradiol uit de anticonceptiepil. Zeker voor de laatste is het aannemelijk dat deze in rwzi effluent voorkomt, maar deze stof kon niet chemisch worden geanalyseerd.
Met zes in-vitro bioassays zijn de celtoxiciteit, de hormoonverstoring (estrogene, androgene en groeihormoonactiviteit), de dioxine-achtige toxiciteit en het effect op cellulaire uitscheiding van stoffen onderzocht. Over het algemeen was er een grote spreiding in de effecten, zowel in de tijd als per locatie/positie. Het is daarom lastig om duidelijke relaties aan te tonen tussen de responsen van bioassays en biomarkers.
Enkele opmerkingen zijn echter wel mogelijk. Zo was de gemiddelde respons van de DR-Luc om stoffen met dioxine-achtige effecten aan te tonen was op alle locaties gemiddeld even hoog, terwijl de vergelijkbare expressie van cytochroom P4501A in de stekelbaars duidelijk verhoogd was in Cuijk en Grou.
Bij de laatste bemonstering werd met de ER-Luc een verhoogde estrogene activiteit (♀ hormoon) waargenomen op positie Cuijk 2, hetgeen goed overeenkwam met de sterke vitellogenine-inductie in de stekelbaarzen op die positie. Hoewel de ER-Luc-activiteit sterk afnam in de rietvelden verdween de sterke estrogene hormoonverstoring in mannelijke stekelbaars uit Cuijk echter pas in de afvoersloot, na passage door de rietvelden.
Met de TR-Luc-bioassay voor het thyroïde groeihormoon werd vrijwel geen respons gevonden, en ook de genexpressie van dit hormoon in de stekelbaars was slechts weinig verhoogd.
Met de CEPIA-test werd een lichte remming gevonden van de activiteit van de cellulaire uitscheiding van chemicaliën (MXR = Multi Xenobiotic Resistance) terwijl in de vis werd juist een licht verhoogde expressie van P-glycoproteïne (P-gp) gevonden, vooral in de vrouwtjes. P-gp is een van de belangrijkste eiwitten die een rol spelen bij dit cellulaire MXR verdedigingsmechanisme.
Een opvallende correlatie was de relatie tussen de cytotoxiciteit (MTT) en de verhoogde expressie van genen die betrokken zijn bij apoptose (geprogrammeerde celdood) in de stekelbaars. Daarnaast werd een interessant verband waargenomen tussen de verhoogde respons in de algentest en de expressie van genen die betrokken zijn bij de energievoorziening van de cellen (bijvoorbeeld ATP-synthese en ademhaling).