RESULTATEN EN DISCUSSIE - De invloed van bacteriën uit het longmicrobioom op de virulentie van

4.1. BEPALEN VAN DE CORRELATIE TUSSEN DE OD EN CFU VOOR ALLE BACTERIËN Voor elke bacterie werd de OD/CFU

relatie bepaald. Hierbij werd de optical density gemeten met de EnVision spectrofotometer bij 590 nm. Deze meet zowel de dode als de levende bacteriën. Na het uitplaten van de verschillende verdunningen en het tellen van de levende, gevormde kolonies werd de CFU/mL bepaald. CFU is het aantal kolonievormende eenheden

per mL. Elke bacterie vormt namelijk 1 kolonie na een incubatie bij 37°C. De CFU/mL werd berekend door het aantal kolonies in 1 druppel te vermenigvuldigen met de verdunningsfactor en 102_{(1 druppel is 10 µL).}

Het OD/CFU experiment werd in biologisch triplicaat uitgevoerd. Voor 5 ∙ 107CFU/mL werd de overeenstemmende OD590 per bacterie bepaald a.d.h.v. de verkregen relaties. Deze hoeveelheid aan bacteriën is

nodig om de cellen in de antivirulentie experimenten te infecteren met telkens eenzelfde MOI. In Figuur 4.1 is een voorbeeld weergegeven van de OD/CFU correlatie voor R. mucilaginosa. Het gemiddelde van de OD590-

waarden die correleren met 5 ∙ 107 CFU/mL wordt voor elke bacterie weergegeven in Tabel 4.1.

Tabel 4.1: OD590-waarden die correleren met 5 ∙ 107CFU/mL volgens y = ax en de gemiddelde CFU/mL van de

startcondities die overeenstemmen met 5 ∙ 107 CFU/mL verkregen uit de antivirulentie-experimenten

Naam bacterie OD590 (gemiddelde) OD590 (standaarddeviatie)

Gemiddelde CFU/mL van startcondities Pseudomonas aeruginosa 0.03 0.05 5.65 ∙ 107 Delftia lacustris 0.06 0.01 7.09 ∙ 107 Rothia mucilaginosa 0.50 0.39 4.39 ∙ 107 Streptococcus salivarius 0.04 0.03 7.88 ∙ 107

Bij het begin van elk volgend experiment werden de startcondities uitgeplaat om na te gaan of de infectie van de A549 cellen met de gewenste hoeveelheid bacteriën naar behoren was verlopen, m.a.w. dat er een juiste MOI werd gebruikt. Deze startcondities kwamen telkens ongeveer overeen met 5 ∙ 107 CFU/mL (zie Tabel 4.1), waaruit we kunnen besluiten dat de OD590-waarden voor alle bacteriën uit Tabel 4.1 wel degelijk kloppen.

y = 8E-09x + 0,0467 R² = 0,9754 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9

0,00E+00 2,00E+07 4,00E+07 6,00E+07 8,00E+07 1,00E+08

CFU/mL

4.2. MICROSCOPISCHE ANALYSE VAN DE BIOFILMVORMING DOOR P. aeruginosa PAO1 BIJ EEN MOI VAN 10 OP 3-D A549 LONGEPITHEELCELLEN NA 4 UUR

Er werd een microscopische analyse uitgevoerd van 3-D A549 cellen die geïnfecteerd waren met een P. aeruginosa PAO1-GFP stam om na te gaan of PAO1 bij MOI 10 wel degelijk associeert met de 3-D A549 cellen. Deze P. aeruginosa stam brengt GFP tot expressie. De GFP-activiteit is direct zichtbaar met een fluorescentiemicroscoop, er is geen staalvoorbereiding vereist. [103] Belangrijk, in de literatuur werd beschreven dat de groei en associatie van PAO1-GFP aan gastheercellen hetzelfde is als de wild type PAO1 stam. [102]

Zoals weergegeven in Figuur 4.2 kan er kwalitatief bevestigd worden dat P. aeruginosa PAO1 een biofilmachtige structuur ontwikkelt bij een MOI van 10 na een incubatieperiode van 4 uur. Dit resultaat werd verwacht, er werd in de literatuur reeds bevestigd dat P. aeruginosa bij een MOI van 30 microkolonies vormt op het 3-D longepitheel na een infectie van 2 uur. Deze studie toonde ook aan dat de associatie van P. aeruginosa aan 3-D longepitheelcellen voor minstens 17 uur geen effect had op de levensvatbaarheid van de 3-D A549 cellen. [102] Omdat P. aeruginosa PAO1 bij MOI 10 associeerde aan de 3-D longepitheelcellen (zie Figuur 4.2) zonder een cytotoxisch effect (zie deel 4.3.) uit te oefenen, werd deze MOI in de antivirulentie experimenten gehanteerd.

4.3. CYTOTOXICITEIT VAN LONGMICROBIOOM BACTERIËN IN HET 3-D A549 LONGMODEL

Het tweede deel van de thesis was de bepaling van het effect van bacteriën uit het longmicrobioom op de adhesie van P. aeruginosa aan 3-D longepitheelcellen. Hiervoor werden de 3-D A549 cellen geïnfecteerd met de bacteriën gedurende een tijdspanne van 4 uur. Om er zeker van te zijn dat er MOI’s werden aangewend die tijdens de infectie geen cytotoxisch effect veroorzaakten, werd voorafgaand aan de test die de associatie van P. Figuur 4.2: Beide afbeeldingen zijn een samengesteld, overschrijvend beeld van een lichtmicroscoop en fluorescentiemicroscoop (links objectief 10x - rechts objectief 20x) dat de PAO1-GFP biofilm (MOI 10) weergeeft na 4 uur infectie.

aeruginosa aan de gastheercellen bepaalt, de levensvatbaarheid van de cellen geëvalueerd met een aangepaste LDH-test. LDH is een oplosbaar cytosolisch, oxidoreductase enzym en wordt vrijgegeven in het supernatans wanneer cellen sterven. Een klassieke LDH-test bepaalt a.d.h.v. deze hoeveelheid vrijgegeven LDH het cytotoxisch effect of de dode fractie aan cellen. Vermits P. aeruginosa LDH afbreekt m.b.v. proteasen, werd er een aangepast protocol gehanteerd. Na de infectie werden de cellen gespoeld met HBSS om P. aeruginosa te verwijderen. Vervolgens werd de levende fractie aan 3-D A549 cellen gelyseerd met 1% Triton X-100 en werd de intracellulaire LDH-activiteit bepaald. Deze aangepaste LDH-test gaat de hoeveelheid gehechte, levende cellen na.

Voor P. aeruginosa werd enkel MOI 10 gehanteerd, omdat er in de literatuur beschreven staat dat de leefbaarheid van de A549 cellen na een infectieduur van 4 uur met P. aeruginosa bij een MOI van 100 ongeveer 75% is, dus vrij toxisch is voor de 3-D cellen. [104] Aangezien P. aeruginosa bij een MOI van 10 reeds biofilmachtige structuren kan vormen op de 3-D cellen, is er geen nood om de hoeveelheid aan bacteriën 10 keer te verhogen. Ook werd MOI 10 voor P. aeruginosa en een gelijke/ hogere hoeveelheid van de microbioom bacterie gebruikt om de kans te verhogen om een mogelijk effect op de adhesie van P. aeruginosa waar te nemen. D. lacustris, R. mucilaginosa en S. salivarius werden getest bij zowel MOI 10 als 100. Deze voorbereidende test is noodzakelijk aangezien we bij de adhesietest het effect van de longmicrobioom species op de biofilmvorming van PAO1 willen onderzoeken, een cytotoxische impact kan dit effect beïnvloeden waardoor we een verkeerd beeld zouden verkrijgen. 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 PAO1 10 D10 D100 R10 R100 S10 S100 Le ve ns va tb aa rhe id A5 49 ce lle n (% )

Figuur 4.3: Levensvatbaarheid van A549 cellen na een infectie van 4 uur met enkelvoudige culturen van P. aeruginosa (PAO1), D. lacustris (D), R. mucilaginosa (R) en S. salivarius (S). 10 en 100 duiden respectievelijk op een infectie met MOI 10 of MOI 100 van de overeenkomstige bacterie.

Figuur 4.4: Beelden genomen met de optische microscoop (objectief 10x, modus BF) van de onbehandelde controle en D. lacustris (D), R. mucilaginosa (R) en S. salivarius (S) bij MOI 10 en MOI 100 na een infectie van de 3-D A549 cellen gedurende 4 uur. De zwarte pijlen duiden clusters van beads aan. De rode pijlen duiden beads aan die gedeeltelijk of volledig vrij zijn van cellen.

Na de infectieperiode van 4 uur werden de cellen onderworpen aan een LDH-test die de levensvatbaarheid van de cellen kwantificeert. De resultaten van deze test worden weergegeven in Figuur 4.3. We verkregen een levensvatbaarheid van 85% voor P. aeruginosa PAO1 bij MOI 10. D. lacustris zorgde voor een gemiddeld overlevingspercentage van 95% bij MOI 10 en 88% bij MOI 100. Vervolgens is er R. mucilaginosa die na een incubatie van 4 uur zorgde voor een cytotoxiciteit van ongeveer 15% bij zowel MOI 10 als MOI 100. De cellen die geïnfecteerd werden met S. salivarius hadden slechts een levensvatbaarheid van minder dan 50%.

Ook werden de cellen na 4 uur incubatie m.b.v. de lichtmicroscoop gevisualiseerd, zoals weergegeven in Figuur 4.4. Hierop kan men duidelijk zien dat zowel D. lacustris als R. mucilaginosa, bij MOI 10 en MOI 100, weinig invloed uitoefenden op de morfologie van de 3-D aggregaten. Clusters bestaande uit beads worden aangeduid met een zwarte pijl en wijzen er op dat de cellen geen schade ondervinden van de infectie. S. salivarius daarentegen heeft wel een cytotoxisch effect op de 3-D A549 cellen. Er werden namelijk veel (gedeeltelijk) vrije beads waargenomen, waarvan de cellen losgekomen zijn. We kunnen besluiten dat deze S. salivarius stam een zeer uitgesproken celdodend effect heeft.

De resultaten van de LDH-test (Figuur 4.3) komen overeen met de bevindingen uit de microscopische beelden (Figuur 4.4). De uitkomst is dus consistent, wat echter opvalt is het resultaat van S. salivarius. De 3-D A549 cellen hebben nl. een heel laag overlevingspercentage. Omwille van het cytotoxisch effect werd er niet verder gewerkt met S. salivarius in de adhesietest na 4 uur incubatie en de LDH-test na 16 uur incubatie.

Een cytotoxisch effect van S. salivarius werd niet verwacht omdat het niet overeenstemt met de in de literatuur gepubliceerde bevindingen. Er is namelijk tot op heden nog geen cytotoxisch effect van S. salivarius op humane cellen vastgesteld. Als gevolg van de vele voordelen van deze bacterie voor de menselijke gezondheid wordt S. salivarius K12 ingezet als een oraal probioticum in de profylactische behandeling tegen faryngitis door streptococcen. [105,106] Ook werd er aangetoond dat de K12 en M18 stammen tandplak verminderen en een bescherming bieden tegen persistente tonsillitis en otitis door streptococcen. Virulente bacteriën zoals S. pneumoniae kunnen niet meer hechten aan het epitheel na de kolonisatie en binding van S. salivarius. [105]

Alvorens er een probioticum op de markt gelanceerd wordt, moet het verschillende veiligheidstesten hebben doorstaan. Een belangrijk onderdeel hiervan zijn de in vitro veiligheidstesten die bestaan uit een analyse van gevaarlijke bijproducten, een antibiogrambepaling, een cytotoxiciteitstest en een beoordeling van de aanwezige virulentiefactoren. Vervolgens worden er ook nog dierenproeven en klinisch testen uitgevoerd. [107]

Verder verschenen er in de literatuur verscheidene onderzoeken die bepaalde MOI’s hanteerden waarbij er geen cytotoxiciteit werd vastgesteld. Een eerste studie infecteerde CCL-23 (HEp-2) cellen met S. salivarius bij

een MOI van 100, 10 en 1 met als doel de invloed op de binding van S. pneumoniae aan de cellen te bestuderen. Hier werden de cellen onder een microscoop bekeken om te bepalen of deze nog levensvatbaar waren. [91] Deze MOI’s werden ook gebruikt in een volgend experiment om de humane faryngale epitheliale carcinoma cellijn (Detroit 562) te infecteren. Ook hier werd het effect van de S. salivarius infectie op de cellen nagegaan door een controle onder de microscoop en niet cytotoxisch bevonden. Deze studie stelde vast dat S. salivarius K12 de S. pneumoniae bindingsplaatsen op de D562 cellen blokkeert en zo de S. pneumoniae adhesie tegenwerkt. [62] Verder beschreef een ander onderzoek het gebruik van MOI 50 van S. salivarius om de humane broncheale epitheliale 16HBE140 cellijn te infecteren. Hier werd er een LDH-test uitgevoerd om de cytotoxiciteit van S. salivarius na te gaan. Na een incubatieperiode van 48 uur werd er geen celdodend effect vastgesteld. [108]

De S. salivarius stam die werd gebruikt in het experiment is geïsoleerd uit het sputum van een CF-patiënt. De bacterie werd vervolgens geïdentificeerd m.b.v. de matrix assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS). De MALDI-TOF MS is een snelle, betrouwbare en kosteneffectieve methode waarbij het verkregen massaspectrum wordt vergeleken met referentiespectra uit een databank. De staalvoorbereiding, de kwaliteit van de databank met referentiespectra en de algoritmes die de resultaten verwerken hebben een invloed op het resultaat van de MALDI-TOF. [109] Een studie uit de literatuur stelde vast dat de mogelijkheid tot identificatie van de specifieke soort verschilt tussen diverse geslachten. [109] Uit die studie bleek dat er met de MALDI-TOF enkel een geslachtsbepaling (Streptococcus), geen soortbepaling, mogelijk was van de nauw verwante bacteriën binnen de S. anginosus groep, S. bovis/equinus groep, S. mitis groep en S. salivarius groep. [109] Het lijkt plausibel dat S. salivarius a.g.v. het laag onderscheidingsvermogen van de MALDI- TOF MS verkeerdelijk is geïdentificeerd.

Om een eenduidig antwoord te verkrijgen op de vraag of deze bacterie al dan niet S. salivarius is, zou er een 16S rRNA sequenering kunnen worden uitgevoerd. Het Streptococcus geslacht werd o.b.v. gelijkaardige 16S rRNA gensequenties onderverdeeld in verschillende groepen: pyogenic, anginosus, mitis, mutans, salivarius en bovis. [110] S. salivarius, S. vestibularis en S. thermophilus zijn genetisch zeer gelijk en vormen samen de salivarius groep. [106] Een onderscheid maken tussen deze verschillende groepen en soorten wordt vaak gedaan via arbeidsintensieve hemolytische reacties en fenotypische testen, maar is niet eenvoudig. Daarnaast kunnen verschillende stammen afkomstig uit de S. salivarius soort onderling verschillen in bepaalde eigenschappen en zelfs binnen één stam kan er biochemische variabiliteit optreden. [110] Een alternatief voor deze biochemische analyse is de 16S rRNA sequenering, een methode om isolaten te identificeren die moeilijk te onderscheiden zijn door nauw gelijkende eigenschappen en biochemische karakteristieken, en is bovendien ook snel en kosteneffectief. [110] Het 16S rRNA is universeel in bacteriën en een cruciaal element van de celfunctie. Deze

gensequentie is groot genoeg en bevat interspecifieke variaties om een onderscheid te maken tussen verschillende bacteriën. [111]

Anderzijds kan er ook een alternatieve uitleg gegeven worden aan de hoge cytotoxiciteit van het S. salivarius isolaat in deze studie. In een studie werd aangetoond dat verschillende S. salivarius isolaten, ondanks afkomstig uit dezelfde mondholte, toch een groot niveau van genetisch diversiteit vertoonden. [106] Genetische analyses op populatieniveau geven aan dat een constante verandering van de genotypes, door het ontstaan van mutaties en recombinaties door horizontale gentransfer, aan de basis ligt van de genetische diversiteit van Streptococci sp. [112] S. salivarius bevat een van grootste genomen van het streptococci geslacht. Twee derde van dit genoom bestaat uit genen die coderen voor alle belangrijke functies en eigenschappen, ook wel het hoofddeel van het genoom genoemd. Dit wijst op de aanwezigheid van een aanzienlijk variabel deel in het genoom dat S. salivarius de mogelijkheid verstrekt zich aan te passen aan de CF-longen. [106]

S. salivarius past zich aan aan zijn de omgeving door het verkrijgen van nieuwe genen via horizontale gentransfer. Deze specifieke genen voorzien de bacterie van de capaciteit om zich aan te passen en te overleven in een bepaald milieu. [106] Daarnaast vinden er ook intraspecifieke recombinaties plaats in het hoofddeel van het genoom die zorgen voor een diversiteit. [106] De twee S. salivarius stammen die het grootste genoom bevatten, K12 en M18, bezitten megaplasmiden, die coderen voor specifieke functies bv. de productie van bacteriocines. Specifieke regio’s in deze megaplasmiden komen zeer goed overeen met chromosomale genen uit S. salivarius. Dit suggereert de uitwisseling van genen tussen plasmiden en chromosomale regio’s. [106] Daarnaast kan er ook een uitwisseling plaatsvinden tussen S. salivarius en andere bacteriële soorten. Dit alles samen suggereert dat de bacterie de mogelijkheid heeft genetische wijzigingen te ondergaan. [106] Indien de identiteit van S. salivarius wordt bevestigd met de 16S rRNA sequenering, kunnen wijzigingen in het genoom bestudeerd worden om de hoge cytotoxiciteit te verklaren. Ook is het interessant om vervolgens andere S. salivarius isolaten uit verschillende sputumstalen te testen.

4.4. EVALUEREN VAN DE ANTIVIRULENTIE ACTIVITEIT M.B.V. EEN IN VIVO-LIKE INFECTIEMODEL

4.4.1. Inhibitie van P. aeruginosa PAO1 adhesie aan 3-D longepitheelcellen na 4 uur door D. lacustris en R. mucilaginosa

Voor het experiment met D. lacustris werd, zoals weergegeven in Figuur 4.5, geen verschil in PAO1 adhesie waargenomen tussen de incubatie van PAO1 alleen en PAO1 in combinatie met D. lacustris. Opvallend is het kleine verschil in CFU-count tussen D. lacustris bij MOI 10 en de duale infectie op NMC-agar. Dit kan wijzen op een toxisch of groei-inhibitie effect van P. aeruginosa op D. lacustris. De log CFU/mL voor D. lacustris bij MOI 100 en de duale infectie op NMC-agar zijn beiden ongeveer 7.5. Wanneer de hoeveelheid aan D. lacustris 10 keer hoger is dan

PAO1, is het aannemelijk dat PAO1 een minder sterk effect kan uitoefenen op D. lacustris. De literatuur beschreef de antibiofilmcapaciteit van 1 Delftia stam, D. tsuruhatensis. [29,89] Deze eigenschap kan echter niet worden toegeschreven aan D. lacustris o.b.v. de verkregen resultaten.

Vervolgens wordt in Figuur 4.6 het resultaat weergegeven van de test die de associatie van P. aeruginosa met gastheercellen bepaalt in de aan- en afwezigheid van R. mucilaginosa. De CFU/mL voor PAO1 en PAO1 in combinatie met R. mucilaginosa bij MOI 10 is ongeveer 7.6. Er wordt een lichte stijging waargenomen van de PAO1 CFU-count in combinatie met R. mucilaginosa bij MOI 100. Infectie van de 3-D cellen met R. mucilaginosa bij een MOI van 10 in de af- en aanwezigheid van P. aeruginosa PAO1 bij een MOI van 10 veroorzaakt een dalende trend in de CFU-count van R. mucilaginosa. Dit zou kunnen wijzen op een toxisch of groei-inhibitie effect van PAO1 op R. mucilaginosa. Als laatste wordt er tussen R. mucilaginosa bij MOI 100 en de combinatie van R. mucilaginosa bij MOI 100 met PAO1 geen duidelijk verschil geconstateerd. Ook werd er van R. mucilaginosa nog niets gerapporteerd over een eventuele antibiofilmcapaciteit in de literatuur. Integendeel, P. aeruginosa zou metabolieten geproduceerd door R. mucilaginosa gebruiken voor de aanmaak van o.a. glutamaat, een component van de celwand. Dit geeft P. aeruginosa een metabole boost en leidt tot een verhoogde afgifte van exotoxine A en een inductie van swarming. R. mucilaginosa speelt dus een rol in de virulentie van P. aeruginosa. [74]

5,00 5,50 6,00 6,50 7,00 7,50 8,00 8,50 PAO1 10 P (+D10) P (+D100) D10 (P+) D10 D100 (P+) D100 lo g CFU/ mL

Figuur 4.5: Weergave van log CFU/mL voor de verschillende testcondities van de adhesietest na 4 uur infectie. De groene balken geven de log CFU/mL weer van P. aeruginosa. PAO1 10 duidt op de infectie met P. aeruginosa bij MOI 10, P (+D10) duidt op de infectie van PAO1 bij MOI 10 met D. lacustris bij MOI 10 (uitgeplaat op LB/Triclosan) en P(+D100) duidt op de infectie van PAO1 bij MOI 10 met D. lacustris bij MOI 100 (uitgeplaat op LB/Triclosan). De grijze balken geven de log CFU/mL van D. lacustris weer. D10 duidt op de infectie met D. lacustris bij MOI 10 en (P+) D10 duidt op de infectie van PAO1 bij MOI 10 met D. lacustris bij MOI 10 (uitgeplaat op NMC). D100 duidt op de infectie met D. lacustris bij MOI 100 en (P+) D100 duidt op de infectie van PAO1 bij MOI 10 met D. lacustris bij MOI 100 (uitgeplaat op NMC). Deze figuur rapporteert het gemiddelde en SEM van 2 onafhankelijke experimenten uitgevoerd in duplicaat.

Naar de toekomst toe kan het interessant zijn om naast de coadditie van PAO1 en een bacterie uit het longmicrobioom ook het effect van preadditie en postadditie te testen. Hierbij wordt de specifieke longmicrobioom bacterie respectievelijk een bepaalde tijd voor of na PAO1 toegevoegd. [91]

4.4.2. Invloed van longmicrobioom bacteriën op het cytotoxisch effect van P. aeruginosa PAO1 op 3-D longepitheelcellen na 16 uur

Na een incubatieperiode van 16 uur werd een LDH-test uitgevoerd om het cytotoxisch effect van PAO1 en de duale infecties op de 3-D A549 cellen te bepalen. Zoals weergegeven in Figuur 4.7 is de levensvatbaarheid van de cellen na een incubatie van 16 uur met PAO1 bij een MOI van 10 ongeveer 3%. Het effect van D. lacustris of R. mucilaginosa bij een MOI van 10 op de cytotoxiciteit van PAO1 bij een MOI van 10 is niet duidelijk. Een mogelijke oplossing voor dit probleem is het aanpassen van de condities, bv. een lagere MOI van P. aeruginosa. Zo zal het effect van P. aeruginosa minder sterk aanwezig zijn en kan het effect van D. lacustris en R. mucilaginosa duidelijker weergegeven worden. De levensvatbaarheid van de cellen is ongeveer 23% gedaald bij de infectie met D. lacustris en R. mucilaginosa bij MOI 10. Deze gedaalde leefbaarheid is ook te zien in Figuur 4.8 en niet abnormaal gezien de zeer lange infectieperiode van 16 uur.

5,00 5,50 6,00 6,50 7,00 7,50 8,00 8,50 PAO1 10 P (+R10) P (+R100) R10 (P+) R10 R100 (P+) R100 lo g CFU/ mL

Figuur 4.6: Weergave van log CFU/mL voor de verschillende testcondities van de adhesietest na 4 uur infectie. De groene balken geven de log CFU/mL weer van P. aeruginosa. PAO1 10 duidt op de infectie met P. aeruginosa bij MOI 10, P (+R10) duidt op de infectie van PAO1 bij MOI 10 met R. mucilaginosa bij MOI 10 (uitgeplaat op LB/Triclosan) en P(+R100) duidt op de infectie van PAO1 bij MOI 10 met R. mucilaginosa bij MOI 100 (uitgeplaat op LB/Triclosan). De grijze balken geven de log CFU/mL van R. mucilaginosa weer. R10 duidt op de infectie met R. mucilaginosa bij MOI 10 en (P+) R10 duidt op de infectie van PAO1 bij MOI 10 met R. mucilaginosa bij MOI 10 (uitgeplaat op NMC). R100 duidt op de infectie met R. mucilaginosa bij MOI 100 en (P+) R100 duidt op de infectie van PAO1 bij MOI 10 met R. mucilaginosa bij MOI 100 (uitgeplaat op NMC). Deze figuur rapporteert het gemiddelde en SEM van 2 onafhankelijke experimenten uitgevoerd in duplicaat.

Net zoals bij de adhesietest is er niets in de literatuur vermeld over enige invloed van D. lacustris op het cytotoxisch effect van P. aeruginosa. Wel werd er beschreven dat er ‘cross-feeding’ optreedt van P. aeruginosa met metabolieten van R. mucilaginosa. Dit leidt vervolgens tot een verhoogde productie van exotoxine A dat verder zou kunnen bijdragen aan het toxisch effect op de A549 cellen. [74] Om dit effect te kunnen bevestigen, moet het experiment herhaald worden aangezien dit het resultaat is van 2 replicaten. Een volgende suggestie naar toekomstig onderzoek toe is het gebruik van een multidrugresistente P. aeruginosa stam, een klinisch isolaat, vermits hoofdzakelijk dit type problemen vormt tijdens de behandeling.

De adhesietest en LDH-test werden beiden uitgevoerd op een 3-D longepitheelmodel. Dit in vitro model bootst de in vivo gastcel-pathogeen interacties na om zo een realistische voorspelling te maken van de biofilmontwikkeling en cytotoxiciteit. [28,102] De efficaciteit van bv. probiotica in het bestrijden van P. aeruginosa wordt namelijk beïnvloed door longepitheelcellen en hun micro-omgeving. De groei,

In document De invloed van bacteriën uit het longmicrobioom op de virulentie van 'Pseudomonas aeruginosa' (pagina 48-68)