4.1 Pathosystemen Boon - Rhizoctonia solani & Botrytis cinerea
4.1.1 Direct in vitro antagonisme tegen Rhizoctonia solani
Rhizoctonia solani AG2-2
Directe antagonisme activiteit van verschillende Pseudomonas en Bacillus stammen werd in vitro getest. De verschillende behandelingen zijn weergegeven in Figuur 15. De behandelingen B-H behoren tot de Bacillus species, terwijl I-L tot de Pseudomonas species horen. Er werd een statistische test uitgevoerd op basis van totale oppervlakte en op basis van de ratio (lengte/breedte). Op de normaal verdeelde oppervlakte data werd een Anova test uitgevoerd (p= 5,841x10-7). Deze resultaten worden
weergegeven in Figuur 16. Omdat de ratio data niet normaal verdeeld waren, werd een niet parametrische Kruskal-Wallis test uitgevoerd (p= 0,01627). De resultaten van deze analyse zijn weergegeven in de Appendix (Figuur A.3).
Figuur 15 – Direct in vitro antagonisme van Pseudomonas en Bacillus isolaten en hun CLP-mutanten tegen R.
solani AG2-2. De behandelingen zijn weergegeven de vijfde dag na inoculatie bij 28°C waarbij (A) controle (B) B. amyloliquefaciens GA1 (C) GA1 delta iturin (D) GA1 delta surfactin (E) GA1 delta fengycin (F) GA1 delta surfactin
delta iturin (G) GA1 delta fengycin delta surfactin (H) GA1 delta fengycin delta iturin (C-H: CLP mutanten van B.
amyloliquefaciens GA1) (I) P. putida RW10S2 (J) CMPG 2120 (K) CMPG 2169 en (L) CMPG 2170 (J-L: WLIP-
mutanten van P. putida RW10S2). De bacteriën werden langs beide zijden van de pathogeen op 2 cm geënt. In de controle werd een zoutoplossing (0,85%) gebruikt. Per behandeling werden vijf herhalingen uitgevoerd. Visueel leek P. putida RW10S2 (Figuur 15-I) de pathogeen te inhiberen. Bij de mutanten leek de schimmel over de bacterie streep heen te groeien. Bij P. putida RW10S2 was de lengte/breedte ratio significant groter dan bij de controle behandeling (Figuur A.3), wat duidt op inhibitie. Tussen de mutanten en controle was er geen significant verschil op basis van de lengte/breedte ratio. De oppervlakte van de schimmel in de P. putida RW10S2 behandeling was significant kleiner dan de controle behandeling (Figuur 16). Daarnaast was de kolonie oppervlakte bij de mutanten significant groter dan de oppervlakte bij de P. putida RW10S2. Verder was er geen significant verschil tussen de mutanten onderling. De kolonie oppervlakte bij de mutanten was wel kleiner dan deze in de controle behandeling.
36
In vergelijking met de Pseudomonas stammen zagen de resultaten bij de Bacillus stammen er visueel helemaal anders uit (Figuur 15 B-H). Het leek erop dat de bacteriën afgedood werden door R. solani AG2-2. Op deze manier kon de schimmel verder doorgroeien naar de rand van de petrischaal. Alle mutanten leken in staat de schimmel af te doden. Enkel bij GA1 delta fengycin delta surfactin was dit minder zichtbaar (Figuur 15-G). Aangezien de schimmel door de bacteriële barrière breekt was het minder interessant om te werken met de lengte/breedte verhouding. Wanneer gebruik gemaakt werd van de kolonie oppervlakte was tussen de Bacillus stammen onderling geen significant verschil waarneembaar (Figuur 16). Alle Bacillus stammen scoorden wel steeds significant beter dan de controle.
Figuur 16 – Direct in vitro antagonisme van Pseudomonas en Bacillus isolaten en hun CLP-mutanten tegen R.
solani AG2-2. Overzicht van de behandelingen op basis van de relatieve oppervlakte R. solani AG2-2/petrischaal.
De geteste bacteriën zijn P. putida RW10S2 en WLIP-mutanten voor Pseudomonas, B. amyloliquefaciens GA1 (iturin, surfactin en fengycin) en CLP-mutanten voor Bacillus. Van drie herhalingen werd de oppervlakte bepaald. De data waren normaal verdeeld, waardoor een Anova test gedaan werd (p= 5,841x10-7). Behandelingen met
dezelfde letter zijn niet significant verschillend. De foutenvlaggen geven de standaarddeviatie weer.
Pseudomonas isolaten zijn blauw ingekleurd, de Bacillus isolaten rood. Afkortingen: I = iturin, S = surfactin, F =
fengycin, SF = surfactin en fengycin, IS = iturin en surfactin en IF = iturin en fengycin.
R. solani AG4
Naast R. solani AG2-2 werd ook R. solani AG4 gebruikt om de directe antagonisme activiteit van verschillende Pseudomonas en Bacillus stammen te testen. De verschillende behandelingen worden weergegeven in Figuur 17. Bij de behandelingen B-H werden Bacillus stammen gebruikt, terwijl bij I-L
Pseudomonas stammen gebruikt werden. Statistische testen werden uitgevoerd op basis van de ratio
(lengte/breedte) en R. solani kolonie oppervlakte. De ratio data waren niet normaal verdeeld waardoor een Kruskal-Wallis analyse werd uitgevoerd (p= 1,07762x10-6) (Figuur A.4). Op de normaal verdeelde
37
Figuur 17 – In vitro antagonisme van Bacillus en Pseudomonas isolaten en hun CLP-mutanten tegen R. solani AG4. De behandelingen zijn weergegeven de vijfde dag na inoculatie bij 28°C waarbij (A) controle (B) B.
amyloliquefaciens GA1 (C) GA1 delta iturin (D) GA1 delta surfactin (E) GA1 delta fengycin (F) GA1 delta surfactin
delta iturin (G) GA1 delta fengycin delta surfactin (H) GA1 delta fengycin delta iturin (C-H: CLP-mutanten van B.
amyloliquefaciens GA1) (I) P. putida RW10S2 (J) CMPG 2120 (K) CMPG 2169 en (L) CMPG 2170 (J-L: WLIP-
mutanten van P. putida RW10S2) . De bacteriën werden langs beide zijden van de pathogeen op 2 cm geënt. In de controle werd een zoutoplossing (0,85%) gebruikt. Per behandeling werden vijf herhalingen uitgevoerd.
De controle behandeling was na vijf dagen volledig dichtgegroeid. De groei bij de Pseudomonas behandelingen leek trager te verlopen. Hoewel deze petrischalen niet volledig dichtgegroeid zijn, lijkt het erop dat de schimmel amper onderdrukt wordt door de bacteriën. Bij de Pseudomonas stammen onderling waren weinig verschillen waar te nemen (Figuur 17 I-L). Op basis van de ratio’s vertoonden de Pseudomonas species geen significant verschil met de controle. Ook onderling was er geen significant verschil aanwezig (Appendix A.4). Wanneer de oppervlaktes in beschouwing werden genomen, waren alle Pseudomonas stammen significant verschillend van de controle behandeling (Figuur 18). Er was dus wel degelijk een kleine groeivertraging in vergelijking met de controle. Daarnaast waren er geen significante verschillen tussen de mutanten en het wild type onderling. In tegenstelling tot de Pseudomonas stammen vormden de Bacillus stammen een barrière waar de schimmelpathogeen niet doorheen kon groeien. B. amyloliquefaciens GA1 en de zes bijhorende CLP- mutanten vertoonden visueel een zeer gelijkaardig beeld. Bij geen enkele van de mutanten was de schimmel in staat om door de barrière te breken (Figuur 17). De Bacillus species vertoonden zowel op basis van de ratio’s (Appendix A.4) als op basis van de kolonie oppervlaktes (Figuur 18) geen significant onderling verschil. Wel waren ze allen significant verschillend van de controle behandeling. De groei van de bacteriën zelf lijkt enigszins afhankelijk van de mutanten. Bij GA1 delta surfactin delta fengycin (G) en GA1 delta iturin delta surfactin (F) beperkt de groei van de bacteriën zich tot de lijn waarop ze geënt zijn. Bij alle andere species (B-C-D-E-H) wijkt deze groei af naar de buitenkanten van de petrischaal (Figuur 17).
38
Figuur 18 – In vitro antagonisme van Bacillus en Pseudomonas isolaten en hun CLP-mutanten tegen R. solani AG4. Per behandeling is de relatieve oppervlakte R. solani AG4/petrischaal weergegeven. De geteste bacteriën zijn P.
putida RW10S2 en WLIP-mutanten voor Pseudomonas, B. amyloliquefaciens GA1 (iturin, surfactin en fengycin)
en CLP-mutanten voor Bacillus. Van drie herhalingen werd de oppervlakte bepaald. Er werd een Anova test uitgevoerd (p= 1,856x10-9). Behandelingen met dezelfde letter zijn niet significant verschillend. De foutenvlaggen
geven de standaarddeviatie weer. Pseudomonas soorten zijn blauw ingekleurd, de Bacillus soorten rood. Afkortingen: I = iturin, S = surfactin, F = fengycin, SF = surfactin en fengycin, IS = iturin en surfactin en IF = iturin en fengycin.
4.1.2 Direct in planta antagonisme tegen Rhizoctonia solani AG4
Naast in vitro werd de directe antagonisme activiteit van de bacteriën ook in planta getest. Hierbij werden kiemplanten geïnoculeerd met R. solani AG4, een agressieve veroorzaker van wortelrot bij bonen. Deze pathogeen werd toegevoegd onder de vorm van geïnfecteerde graankorrels in de trays waar de planten in opgekweekt werden. Twee weken na inoculatie met R. solani werden de wortels van de planten gewassen en gescoord op infectie. Aan de gezonde controle werden niet geïnfecteerde graankorrels toegevoegd. De scoredistributies na evaluatie zijn weergegeven in Figuur 19. De data waren niet normaal verdeeld waardoor gebruik werd gemaakt van een Kruskal-Wallis test (p= 1,8048x10-4).
In de gezonde controle was geen enkele aantasting zichtbaar aan de wortels. Bij de zieke controle kreeg 50% van de planten een score van 3 of hoger. De Pseudomonas isolaten CMR12a en RW10S2 scoorden niet significant beter dan de zieke controle. Hun scoredistributie is zeer gelijkaardig, waarbij geen van beide een duidelijk effect lijkt te hebben op wortelrot.
Enkel B. amyloliquefaciens GA1 deed de ziektesymptomen significant dalen. Iets minder dan 80% van de planten vertoonden zelfs geen enkel symptoom. Daarnaast kreeg geen enkele plant een hogere score dan 2. GA1 scoort dan ook zeer gelijkaardig met de gezonde controle (Figuur 19).
39
Figuur 19 – Direct in planta antagonisme van P. putida RW10S2, Pseudomonas sp. CMR12a en B.
amyloliquefaciens GA1 tegen R. solani AG4. De scores van de infecties veroorzaakt door R. solani AG4 zijn per
behandeling weergegeven. Per behandeling werden in principe 18 planten gescoord, bij sommige minder wegens matige opkomst (minimaal altijd 14 planten). De data waren niet normaal verdeeld, waardoor een Kruskal-Wallis test werd gedaan (p= 1,8048x10-4). Behandelingen met dezelfde letter zijn niet significant verschillend.
4.1.3 Geïnduceerde systemische resistentie (ISR) door Pseudomonas en Bacillus Experiment 3a – R. solani AG2-2
Naast het directe antagonisme werd ook bekeken of verschillende Pseudomonas en Bacillus isolaten ISR konden triggeren. De bacteriën werden toegevoegd aan de trays waar de planten in opgroeiden. Deze bacteriën konden de wortels koloniseren en eventueel een immuunrespons induceren bij de planten. Via infectie met R. solani AG2-2 op het blad werd gekeken of bij de plant inderdaad resistentie werd geïnduceerd. Tijdens de infectie viel op dat de bladeren opvallend licht gekleurd waren. Dit werd vermoedelijk veroorzaakt door een trips aantasting. De planten kregen daarnaast slechts één keer een Hoagland nutriëntenoplossing.
De proef werd beoordeeld op vijf en acht dagen na infectie. De verschillende behandelingen worden visueel weergegeven in Figuur A.5 in de Appendix. Omdat de data niet normaal verdeeld waren, werd voor beide tijdstippen overgegaan tot een Kruskal-Wallis test (p1= 0.005178 en p2 = 4.306x10-8). De
distributies van de scores per behandeling worden weergegeven in Figuur 20. Er moet opgemerkt worden dat de infectie na acht dagen al ver gevorderd was. De planten takelden snel af, los van de infectie.
Na vijf dagen waren er nog geen significante verschillen te zien tussen de Pseudomonas species (Figuur 20). Zowel P. putida RW10S2 als P. koreensis Cor10 waren niet significant verschillend van de zieke controle. De zieke controle was na vijf dagen nog maar voor 40% geïnfecteerd. Na acht dagen scoorde
P. putida RW10S2 nog steeds gelijkaardig met de zieke controle. Hoewel P. koreensis Cor10 significant
40
B. amyloliquefaciens GA1 scoorde na vijf dagen gelijkaardig als de zieke controle. Hier was wel meteen
een significant verschil met de gezonde controle. Na acht dagen zijn de resultaten duidelijker, GA1 scoorde significant slechter dan de zieke controle. Het lijkt er dus op dat GA1 de ziektesymptomen erger maakt wanneer de bonen via het blad worden geïnfecteerd door R. solani AG2-2.
Figuur 20 – Geïnduceerde systemische resistentie door wortelkolonisatie met B. amyloliquefaciens GA1, P. putida RW10S2 en P. koreensis Cor10 tegen de bladpathogeen R. solani AG2-2. De scores van de infecties veroorzaakt door R. solani AG2-2 zijn per behandeling weergegeven. De scores na vijf dagen zijn weergegeven op de linkse Figuur, deze na acht dagen op de rechtse Figuur. Per behandeling werden in principe 24 deelbladeren gescoord. Er werd voor beide tijdstippen een Kruskal-Wallis test gedaan (p1= 0.005178 en p2 = 4.306x10-8). Behandelingen
41 Experiment 3b – R. solani AG2-2 infectie
Het eerste experiment werd herhaald en uitgebreid met enkele extra stammen (Tabel 4: sectie 3.1.1). In Figuur A.6 in de Appendix is visueel een volledig overzicht gegeven van alle verschillende behandelingen. De foto werd genomen zeven dagen na de infectie. Het valt op dat de zieke controle amper symptomen vertoonde. De infectie van de bladeren is op een te laat tijdstip geëvalueerd en is niet volledig geslaagd (zie Preambule Covid-19). De bladeren van de gezonde controle waren nog lichtgroen maar begonnen kleurloos te worden. De infectie was al redelijk ver gevorderd wat het scoren moeilijk maakte. De data waren niet normaal verdeeld waardoor een Kruskal-Wallis test gedaan werd (p<10-14).
De xantholysine mutant CMPG 2183, de WLIP-mutant CMPG 2120 en Pseudomonas sp. CMR12a scoorden gelijkaardig als de zieke controle (Figuur 22). P. putida RW10S2 (WLIP-producent) en P.
putida BW11M1 (xantholysine producent), de wild types van respectievelijk CMPG 2120 en CMPG
2183, scoorden significant slechter dan bijhorende mutanten en zieke controle. Iets minder dan 70% van de deelbladeren van RW10S2 kreeg de zwaarste score van infectie. Bij BW11M1 was dit zelfs iets minder dan 80%. Verder waren de planten uit de RW10S2 behandeling opvallend groener dan de overige planten (Figuur 21). Bij deze planten werd een verhoogd aantal wortelnodules waargenomen. Wortelnodules werden bij andere behandelingen (inclusief de controle) ook aangetroffen maar slechts in beperkte mate.
Figuur 21 - De bladeren van de planten behandeld met P. putida RW10S2 (1a) ten opzichte van de gezonde controle (2). De planten werden opgekweekt voor de tweede ISR-proef. Bij de behandeling met RW10S2 zijn vele wortelnodules te zien (1b). Per plant werden zes bladeren uitgekozen om te infecteren met R. solani AG2-2.
Tussen de Bacillus stammen onderling waren geen significante verschillen op te merken (Figuur 22). Er zijn wel enkele trends waar te nemen wanneer naar de scoredistributie gekeken wordt. GA1 delta surfactin delta fengycin kreeg iets minder score 4 dan de andere twee mutanten. Er werd meer een score 2 gegeven wat wijst op een iets mildere infectie. Bij deze mutant wordt enkel iturin geproduceerd. GA1 delta iturin delta surfactin en GA1 delta iturin delta fengycin verschillen onderling nauwelijks. Een andere trend is dat het wild type B. amyloliquefaciens GA1 vaker de zwaarste score kreeg in vergelijking met bijhorende mutanten. Iets minder dan 70% van de deelbladeren kreeg een score 4.
42
Figuur 22 – Geïnduceerde systemische resistentie door wortelkolonisatie met B. amyloliquefaciens GA1 en zijn CLP-mutanten Delta SF, Delta IS en Delta IF; P. putida RW10S2 (WLIP-producent) en zijn WLIP-mutant CMPG 2120; P. putida BW11M1 (xantholysine producent) en zijn xantholysine mutant CMPG 2183, en Pseudomonas sp. CMR12a (sessiline en orfamide producent) tegen de bladpathogeen R. solani AG2-2. De scores van de 7de dag
na infectie door R. solani AG2-2 zijn per behandeling weergegeven. Per behandeling werden 24 deelbladeren gescoord. Er werd een Kruskal-Wallis test uitgevoerd (p<10-14). Wanneer twee behandelingen dezelfde letter
hebben zijn deze niet significant verschillend. Afkortingen: SF = surfactin en fengycin, IS = iturin en surfactin en IF = iturin en fengycin.
Tot slot werd ook de wortelkolonisatie van de verschillende bacteriën bekeken. In tabel 6 worden de waardes weergegeven in Log cfu/g verse wortel van boon. Ook de CLP’s die de bacteriën produceren zijn aan de tabel toegevoegd.
Tabel 6 – Kolonisaties van de bacteriën per gram verse wortel van boon. De waardes zijn weergegeven in Log cfu/g verse wortel
Bacterie CLP-productie Kolonisatie
(Log cfu/g verse wortel)
Pseudomonas putida RW10S2 WLIP 5,59 ± 0,39
RW10S2 CMPG 2120 WLIP deficiënt 5,14 ± 0,34
Pseudomonas putida BW11M1 Xantholysine 6,61 ± 0,50
BW11M1 CMPG 2183 Xantholysine deficiënt 6,26 ± 0,16
43 Experiment 3b – Botrytis cinerea infectie
Naast R. solani AG2-2 werden de planten in het tweede experiment ook met B. cinerea geïnfecteerd. De bedoeling was om na te gaan welke bacteriën resistentie kunnen induceren tegen de pathogeen B.
cinerea. Elk deelblad kreeg twee druppels van een sporenoplossing van 105 sporen/ml. De diameter van elke laesie werd gemeten na drie dagen. In Figuur 23 zijn enkele behandelingen visueel weergegeven op drie dagen na de infectie. Omdat de data niet normaal verdeeld waren, werd een Kruskal-Wallis test uitgevoerd (p<10-14). In Figuur 24 en 25 worden de resultaten weergegeven van
respectievelijk de Pseudomonas en Bacillus behandelingen. De kolonisaties van de bacteriën zijn dezelfde als bij de infectie met R. solani AG2-2, omdat dezelfde planten werden gebruikt (zie Tabel 6).
Figuur 23 – Geïnduceerde systemische resistentie tegen B. cinerea na wortelkolonisatie met B. amyloliquefaciens GA1, P. putida RW10S2 en hun CLP-mutanten. Visueel overzicht van infectie met een sporenoplossing van B.
cinerea. De symptomen van enkele behandelingen na drie dagen zijn weergegeven met (A) de zieke controle (B)
GA1 (C) GA1 delta iturin delta fengycin (D) de gezonde controle (E) RW10S2 en (F) CMPG 2120. Per deelblad werd 5 µl van een sporenoplossing 105sporen/ml gebracht. Per behandeling zijn 36 druppels aangebracht. De bladeren werden afzonderlijk geïncubeerd bij 24°C.
Bij de Pseudomonas species vertoonde RW10S2 in vergelijking met de zieke controle een significant kleinere laesie diameter (Figuur 24). CMPG 2120 (WLIP-mutant van RW10S2) en CMR12a scoorden gelijkaardig met de zieke controle. Verder scoorden BW11M1 en bijhorende xantholysine mutant CMPG 2183 significant beter dan de zieke controle. Deze bacteriën scoorden wel nog steeds significant slechter dan RW10S2. Het lijkt er dus op dat RW10S2 het meest in staat is om de infectie diameter te reduceren. Zoals eerder aangegeven werden bij de planten behandeld met RW10S2 meer wortelnodules gevonden dan bij alle andere behandelingen. Hoewel RW10S2 duidelijk het beste scoort, is de diameter van de laesie nog steeds aanzienlijk. Eens de infectie heeft plaatsgevonden, is deze nog zeer moeilijk af te stoppen.
44
Figuur 24 – Geïnduceerde systemische resistentie tegen B. cinerea op boon na wortelkolonisatie met P. putida RW10S2 en zijn WLIP-mutant CMPG 2120; P. putida BW11M1 en zijn xantholysine mutant CMPG 2183 en
Pseudomonas sp. CMR12a. Overzicht van de diameter van de laesies drie dagen na B. cinerea infectie voor alle Pseudomonas species Er worden boxplots weergegeven per behandeling waarop minimum, 1ste kwartiel,
mediaan, 3de kwartiel en maximum te zien is. Per behandeling werden 36 spots op de deelbladeren gebracht.
Een spot bestond uit 5 µl van een sporenoplossing van 105sporen/ml. De bladeren werden geïncubeerd bij 24°C. De resultaten van alle Bacillus species zijn weergegeven in Figuur 25. B. amyloliquefaciens GA1 had een negatief effect op de laesie diameter, het scoorde namelijk significant slechter dan de zieke controle. Het wild type lijkt dus de snelheid waarmee de infectie uitbreidt te verhogen. Alle mutanten van GA1 scoorden significant beter dan het wild type. Geen van de mutanten kon significant beter scoren dan de zieke controle. GA1 delta iturin delta fengycin (Delta IF) scoorde significant beter dan GA1 delta iturin delta surfactin (Delta IS). GA1 delta surfactin delta fengycin (Delta SF) was niet significant verschillend met de andere mutanten.
Figuur 25 – Geïnduceerde systemische resistentie tegen B. cinerea op boon na wortelkolonisatie met B.
amyloliquefaciens GA1 en zijn CLP-mutanten Delta IS, Delta SF en Delta IF. Overzicht van de diameter van de
laesies drie dagen na infectie veroorzaakt door B. cinerea voor alle Bacillus species. Er worden boxplots weergegeven per behandeling waarop minimum, 1ste kwartiel, mediaan, 3de kwartiel en maximum te zien is. Per
behandeling werden 36 spots op de deelbladeren gebracht. Een spot bestond uit 5 µl van een sporenoplossing van 105sporen/ml. De bladeren werden afzonderlijk geïncubeerd bij 24°C.
45
4.2 Pathosysteem Sla - Fusarium oxysporum f. sp. lactucae
4.2.1 Direct in vitro antagonisme tegen Fusarium oxysporum Experiment 4a
Directe antagonisme van verschillende Pseudomonas en Bacillus stammen tegen F. oxysporum werd
in vitro getest. De verschillende behandelingen na vijf dagen (2de tijdstip) zijn visueel weergegeven in
Figuur A.7 (Appendix). Omdat de ratio data (lengte/breedte) normaal verdeeld waren werd een Anova test uitgevoerd (p= 1,2x10-6). De resultaten na zeven dagen (3de tijdstip) zijn weergegeven in Figuur 26.
Figuur 26 – Direct in vitro antagonisme van Pseudomonas en Bacillus isolaten en hun CLP-mutanten tegen F.
oxysporum f. sp. lactucae. Per behandeling wordt de ratio lengte/breedte van de pathogeen F. oxysporum gegeven met vijf herhalingen per behandeling. Geteste bacteriën zijn P. putida RW10S2 en WLIP-mutanten (CMPG 2120, CMPG 2169 en CMPG 2170); P. putida Cor55 (putisolvin); P. koreensis Cow5 (cocoyamide A) en B.
amyloliquefaciens en CLP-mutanten (Delta I, Delta F en Delta S). Er werd een Anova test uitgevoerd op de
normaal verdeelde data (p= 1,2x10-6). De foutenvlaggen geven de standaarddeviatie weer. Pseudomonas soorten
zijn blauw ingekleurd, de Bacillus soorten rood. Wanneer twee behandelingen dezelfde letter hebben zijn deze niet significant verschillend. Afkortingen: I = iturin, S = surfactin, F = fengycin.
Voor de Pseudomonas species scoorden P. putida RW10S2 en bijhorende WLIP-mutanten (CMPG 2120, CMPG 2169 en CMPG 2170) niet significant beter dan de controle. Visueel zagen deze behandelingen er zeer gelijkaardig uit. Ze groeiden iets trager dan de controle met enkel Fol, maar de bacteriën lijken de schimmel amper te hinderen. De overige Pseudomonas species scoorden wel significant beter dan de controle. Zowel P. putida Cor55 als P. koreensis Cow5 lijken de pathogeen in beperkte mate af te remmen. Cor55 maakt putisolvin aan als CLP, terwijl Cow5 cocoyamide A (N1) kan produceren. Na zeven dagen (3de tijdstip) kon de pathogeen wel over de bacterie strepen heen groeien (eigen
observatie). De species vormden dus geen barrière waar Fol niet doorheen kon geraken.
Alle Bacillus species scoorden significant beter dan de controle met Fusarium (Figuur 26). Zowel het wild type B. amyloliquefaciens GA1 als de enkele mutanten konden de groei van de schimmel sterk