4.1 Klinische en genetische karakteristieken
De voorlaatste patiënt betreft een man van 34 jaar met een ANO5 homozygote mutatie (c. 659-2A>G, splice site modificatie intron7- exon8). Dit betekent dat ter hoogte van de overgang intron-exon, de plaats waar splicing gebeurt, een wijziging optreedt. Op -2 wordt de A vervangen door een G, wat gevolgen heeft voor de splicing. De patiënt heeft gezonde ouders en er is geen bloedverwantschap vermeld. Hij heeft geen broers of zussen, maar zelf wel twee kinderen. De persoon vertoont in de puberteit verhoogde CK-waarden, maar zonder enig klinisch symptoom. Pas rond de leeftijd van 30 jaar, is er sprake van atrofie ter hoogte van de onderste ledematen en moeilijkheden met stappen. Geen cardiale of pulmonale betrokkenheid is te vermelden bij deze patiënt.
De laatste persoon binnen deze cohorte is een vrouw van 56 jaar met LGMD2L door een homozygote frameshift mutatie in ANO5 (c.191dupA p.Asn64Lysfs*15 exon5). Op niveau 191 vindt een duplicatie plaats van A, waardoor op eiwitniveau asparagine vervangen wordt door lysine, waarna een frameshift optreedt. Dit is een pathologische variant volgens ClinVar. Klinisch vertoont de patiënt reeds proximale zwakte ter hoogte van de onderste ledematen, alsook ter hoogte van de schouders, en dit rond de leeftijd van 12 jaar. De CK-waarde bedraagt 1500 IU/L, en de vrouw is reeds afhankelijk van een rolstoel. Bij deze patiënt zijn er geen cardiale of pulmonaire klachten te vermelden.
4.2 Histologische karakteristieken
Er zijn tussen P7 en P8 drie grote verschillen. Fibrose is extensief aanwezig bij P7, terwijl bij P8 er geen sprake is van toegenomen collageneus bindweefsel (figuur 27). Necrotische vezels zijn in belangrijke mate zichtbaar bij P7, dit in tegenstelling tot bij P8, waar het maar in zeldzame mate voorkomt (figuur 22). Tot slot is er enkel bij P7 sprake van zogenaamde rubbed-out fibers (pijl), wat betekent dat de vezels als het ware uitgesmeerd zijn (figuur 22). Het grote verschil tussen beide patiënten zou kunnen liggen aan het leeftijdsverschil, waarbij de oudste patiënt het zwaarst is aangetast. De tijd tussen de symptomen en de biopsie is voor P8 langer dan voor P7. Wat betreft de atrofie, rimmed vacuolen, COX-deficiëntie en predominantie, kan gesteld worden dat dit bij beide personen niet aanwezig is.
4.3 Immunofluorescente karakteristieken
Hierbij is het resultaat voor MHC-I zwak positief is, daar waar MAC geen verhoogd signaal weergeeft bij P7. Bij deze patiënt zijn Dys1,2,3 en DAG1 normaal, terwijl het signaal voor dysferline verzwakt is. Binnen de groep van de sarcoglycanen zijn SGCA, SGCB en SGCD zwak, terwijl SGCG normaal is. MHC-I is negatief, daar waar MAC en NCAM wel in belangrijke mate een verhoging van het signaal geven. Bij P8 blijkt dat MHC-I zwak positief is, daar waar MAC duidelijk negatief is. Figuur 23 geeft een visualisatie van de voornaamste kenmerken bij deze patiënten.
Figuur 22: Histochemische analyse van NADH dehydrogenase, ATPase Ph 4,6 en H&E bij P7 en P8. Scale bar = 100 m. NADH-dehydrogenase: rubbed-out vezels bij P7 (pijl). ATPase Ph 4,6: dambord patroon bij P8.
H&E kleuring: necrotische vezels (pijl) bij P7 versus normale bij P8.
Figuur 24: Immunohistochemische analyse van ANO5 bij 3 controles (C1, C2 en C3) en 2 patiënten met een kenmerkende ANO5 mutatie (PT1 en PT2). Geen verschillen op te merken in
signaal tussen de controles en de patiënten. Scale bar = 100 m.
4.4 Immunohistochemische karakteristieken
Bij de cohorte van LGMD2L patiënten is er bijkomend een nieuwe kleuring uitgevoerd bij 2 personen. Hierbij wordt nagegaan of er een verschil te zien is tussen de controles en patiënten met een ANO5 mutatie en dit door middel van een antilichaam gericht tegen ANO5. Het resultaat dat hier naar voor komt is dat er puur op basis van een histochemische kleuring geen verschil kan waargenomen worden, waardoor een diagnose via dergelijk antibody op basis hiervan niet mogelijk is (figuur 24).
4.5 Western blot
Om de expressie te evalueren van ANO5 in het spierweefsel van patiënten, is een western blot uitgevoerd, waarbij het expressie patroon van het eiwit ANO5 van controles vergeleken wordt met de patiënten gekenmerkt door een ANO5 mutatie (figuur 25). De bedoeling is om na te gaan of een western blot voor ANO5 zou kunnen gebruikt worden in de diagnose van LGMD2L Het resultaat van de blot vertoont twee duidelijke bandjes en door gebruik te maken van de tabel met moleculaire massa’s overeenkomstig met de gebruikte gel (10% bis-tris MOPS), zijn deze gelokaliseerd rond de 40 en 50 kDa (hanteer figuur 17 op pagina 30). Het eerste bandje varieert in densiteit zowel bij de controles als bij de patiënten. De eiwitband van 40 kDa is opvallend stabieler in densiteit. Van de drie geteste stalen zijn er twee waarvan de 40kd eiwitband afwijkend is, met name bij PT3 en PT5.
5. Inflammatoire kenmerken
Binnen deze studie wordt geanalyseerd of er verschillen zijn tussen de inflammatoire infiltraten van de verschillende LGMD subtypes. Dit gebeurt aan de hand van een telling met behulp van de lichtmicroscoop waarbij een vergelijking wordt gemaakt tussen patiënt 1 (blauw) van LGMD2A en patiënt 6 (rood) van LGMD2J. Dit wordt visueel voorgesteld door middel van een grafiek (figuur 26). Het aantal intramusculaire cellen, geteld door twee onafhankelijke personen, wordt uitgedrukt in cellen per vierkante mm spierweefsel. Inflammatie is duidelijk aanwezig bij beide personen, maar verschillen tussen beide zijn niet vast te stellen.
Figuur 25: Western Blot (10% bis-tris MOPS) voor ANO5. Vergelijking tussen 6 controles (C1- C6) en 3 ANO5-patiënten (PT3-PT5). Twee eiwitbanden van 40 en 50 kDa. De eerste 50 kDa band: variatie bij zowel controles als patiënten. De onderste 40kDa band: uitsluitend afwijkend
bij PT3 en P5.
Figuur 26: Grafische voorstelling van de inflammatoire merkers CD1c, CD3, CD4, CD8 en CD68 bij P1 (blauw) en
Tabel 4: Schematische voorstelling van de patiëntengegevens van patiënt 1 tot en met patiënt 8: Elementen uit de kliniek, genetica, myopathologie en myoproteomica worden beschreven.
Patiëntnummer Patiënt 1 Patiënt 2 Patiënt 3 Patiënt 4 Patiënt 5 Patiënt 6 Patiënt 7 Patiënt 8
Geslacht + leeftijd bij biopsie
Vrouw/60 Vrouw/43 Vrouw/27 Vrouw/24 Man/38 Man/31m Man/42 Vrouw/29
CK (u/l) 384 u/l 324 u/l 1427 u/l 2614 u/l 262 u/l 454 u/l 4800 u/l 1500 u/l
Genetica Gen variant 1 Clinvar klinische significantie CAPN3 c.759_761delGAA p.Lys254del RCV000178708.2 Pathogeen CAPN3 c.759_761delGAA p. Lys254del RCV000178708.2 Pathogeen FKRP c. 826C>A p. Leu276lle VCV000004221.4 Pathogeen FKRP c. 826C>A p.Leu276lle VCV000004221.4 Pathogeen TTN c. 60754G>C p. Ala20252Pro Niet gerapporteerd Onzeker TTN c.84370_84373delGAG T p.Glu28124llefs*49; Niet gerapporteerd Waarschijnlijk Pathogeen ANO5 c.649-2A>G splice site modification RCV000663413 Waarschijnlijk pathogeen ANO5 c.191dupA p.Asn64Lysfs*15 RCV000002248 Pathogeen Gen variant 2 Clinvar accession significantie Homozygoot CAPN3 c.883_886delGATAinsCTT p.Asp295delinsLeufs*57 VCV000217160.3 Pathogeen Homozygoot FKRP c.1100T>C p. lle367Thr VCV000459227.1 Onzeker TTN c.12785C>T p.Ser4262Phe RCV000764351.1 Onzeker TTN c.67210G>A p.Val22404Met RCV000532135.1 Onzeker Homozygoot Homozygoot
LGMD type LGMD2A LGMD2A LGMD2I LGMD2I LGMD2J LGMD2J LGMD2L LGMD2L
Myopathologie Atrofische
vezels Veel
Verspreid of in kleine
groepen Weinig Enkele Geen Enkele Geen Geen
Fibrose Extensief Extensief Geen Geen Geen Extensief Extensief Geen
Regeneratie Enkele Weinig Weinig Geen Geen Geen Weinig Weinig
Rimmed
vacuole Enkele Geen Geen Geen Geen Geen Geen Geen
Cyclo- oxygenase
(COX) deficiëntie
Vezeltype predominantie
Type I
Type I Geen dominantie Geen dominantie Geen dominantie Meeste grote vezels zijn type I
Geen
dominantie Geen dominantie Necrotische
vezels Geen
Zeldzaam + soms verhoogde zure fosfatase activiteit in de macrofagen
Verscheidene + soms verhoogde fosfatase activiteit
in de macrofagen
Weinig Geen Geen Veel Zeldaam
Interne nuclei Veel Enkele
Veel, sommige omgeven door een leeg halo
Veel Weinig Weinig
Veel, soms rubbed-out
vezels
Weinig
Myoproteomica
DYS IF: zwak (Dys1); normaal (Dys2,3)
IF: zwak, mozaïek patroon(Dys1,3); normal (Dys2); WB: zwak (Dys1) IF: normaal (Dys 1,2,3) IF: normaal (Dys 1,2,3) WB: normaal (Dys1) IF: normaal (Dys1,2,3)
IF: zwak (Dys1,3); normal (Dys2); WB: normaal (Dys1) IF: normaal Dys(1,2,3); WB: zwak (Dys1) ND DAG
IF: zwak, mozaÎek patroon (A);
normal (B)
IF: heel zwak (A); normaal (B) IF; zwak, mozaïek patroon (A); Normaal (B) IF: enkele positieve vezels (A), normaal (B)
IF: normaal (A, B) IF: normaal (A, B) IF: normaal (A,
B) ND
SCG IF: normaal
(A, B, D) IF: normaal (A, B, D)
IF: normaal (A, B, D) IF: normaal (A, B, D) WB: weak (G) IF: normaal (A, B, D, G)
IF: normaal (A, B, D, G) WB: normaal (G) IF: zwak (A, B, D); normaal (G) ND
DYSF IF: zwak tot
normaal IF/WB: normaal IF: normaal WB: normaal IF: normaal
IF: zwak WB: normaal
IF: zwak
WB: normaal ND
CAPN3 ND WB: zwak ND WB: normaal ND WB: afwezig WB: zwak ND
MHC-I ND IF: veel positieve vezels IF: enkele vezels positief
IF: weinig vezels positief WB: positief
IF: negatief IF: negatief
WB: positief IF: negatief IF: zwak positief
MAC ND IF: sommige capillairen
positief
IF: sommige arteriolen positief
IF: capillairen
positief IF: negatief IF: negatief
IF: veel arteriolen positief, capillairen negatief IF: negatief
NCAM ND IF: negatief IF: veel kleine
vezels positief IF: negatief IF: negatief
IF: sommige kleine vezels positief
IF: veel vezels
Discussie
Het doel van deze studie is nagaan welke aanwijzingen een spierbiopsie kan geven voor de diagnose van LGMD en in hoeverre deze verschillen tussen de subgroepen. Daarnaast wordt bestudeerd of de inflammatoire kenmerken differentiatie met de idiopathische inflammatoire myopathieën toelaten. Binnen de discussie worden de gevonden resultaten besproken, en in het licht geplaatst van andere beschikbare wetenschappelijke artikels. Tevens zal een blik geworpen worden naar de toekomst toe over eventueel bijkomende onderzoeken en behandeling.
Door het bekijken van de weefselcoupes van de verschillende patiënten, kan geconcludeerd worden dat elke patiënt wel degelijk histologische afwijkingen vertoont passend binnen de musculaire dystrofieën. Wel kan er geen generalisatie gemaakt worden van specifieke veranderingen die uitsluitend voorkomen bij één welbepaald type. Eveneens kan er geen verband aangetoond worden tussen de histologie en de ernst van de aandoening bij deze cohorte.
Het is belangrijk om bij musculaire dystrofieeën de differentiële diagnose in acht te nemen, aangezien ze gekenmerkt worden door een heterogeen karakter. Patiënten presenteren zich met onder andere spierpijn, verhoogde CK-levels en gedaalde inspanningstolerantie. Dergelijke klachten behoren tot een breed scala aan uiteenlopende musculaire zieken, waardoor het uitermate belangrijk is om de diagnose op een correcte manier te stellen. Op pagina 46 is een tabel (tabel 6) opgenomen met verschillende casussen uit diverse artikels. Hierbij wordt er gekeken naar patiënten met LGMD, die aanvankelijk een foutieve diagnose hebben gekregen. Bij casus 1 presenteert de patiënt zich met een klassiek beeld qua kliniek en wordt er een IF-kleuring uitgevoerd met een verminderd signaal voor dystrofine. Er wordt onmiddellijk een link gelegd met de ziekte van Duchenne, terwijl genetisch onderzoek, IF-, IHC-kleuringen en western blots voor andere relevante eiwitten niet uitgevoerd worden. Acht jaar later komen artsen tot de constatatie dat de patiënt in kwestie compound heterozygoot is voor het SGCA gen en de dystrofine afwijking secundair is, met finaal de diagnose LGMD2D 19.
De immunofluoresente kleuringen uitgevoerd bij deze cohorte van acht patiënten tonen eveneens aan dat er secundaire veranderingen kunnen plaatsvinden. Dystrofine, voornamelijk dys1 en 3, is secundair verlaagd bij drie van de acht patiënten. Dit is een eiwit dat vaak als eerste bijkomend onderzocht wordt, maar het is dus belangrijk om rekening te houden met het feit dat een verzwakt signaal van dergelijke eiwitten wel degelijk bij verschillende dystrofieën
kan voorkomen en niet alleen bij de ziekte van Duchenne. Ondanks het feit dat de huidige behandeling louter ondersteunend is, is het wel van belang om de diagnose zo snel mogelijk te stellen, zowel naar genetische counseling toe, alsook wat betreft het emotionele aspect. Bij Duchenne overlijden patiënten vlug door hart- en ademhalingsproblemen, daar waar LGMD2D zich bijzonder variabel kan presenteren.
Een tweede vaak voorkomende diagnose die foutief vooropgesteld wordt bij LGMD is een inflammatoire myopathie. Personen presenteren zich met onder andere spierpijn, verhoogde CK-levels en gedaalde inspanningstolerantie. Inflammatoire infiltraten en een verhoging van MHC-I in de spierbiopsie zijn elementen die doen denken in de richting van een ontstekingsreactie, met de diagnose van inflammatoire myopathie tot gevolg. Dit is een idiopathische ziekte die voornamelijk een auto-immune pathogenese zou hebben, aangezien er evidentie is voor de cytotoxische aanval door T lymfocyten op de spiervezels. Deze laatste vertonen een verhoogde expressie van MHC-I op het celmembraan, hetgeen niet zichtbaar is bij gezonde vezels. MHC-I wordt verondersteld een rol te spelen in de initiatie en verderzetting van musculaire schade. Het onderzoek van Paolo Confalonieri toont aan dat patiënten met een dystrofie eveneens een verhoging van inflammatoire merkers kunnen vertonen, waardoor de aanwezigheid ervan niet absoluut is voor een inflammatoire myopathie (20). Dit wordt eveneens door deze huidige studie bevestigd. Ongeveer de helft van de LGMD-patiënten zijn eveneens positief voor MHC-I, waardoor het louter baseren op ontstekingskenmerken misleidend kan zijn. Dit geldt niet alleen voor MHC-I, aangezien MAC, onderdeel van het complementsysteem, eveneens een positief signaal kan vertonen bij een aantal van deze patiënten, met name dan vooral bij P2, P3, P4 en P7. Inflammatoire infiltraten met voornamelijk grote aantallen van CD68+ positieve cellen, alsook andere ontstekingsparameters kunnen aanwezig zijn bij patiënten met LGMD, wat blijkt uit de grafiek op pagina 36. Dit toont aan dat er wel degelijk sprake kan zijn van ontsteking ter hoogte van het spierweefsel, met geen duidelijk verschil tussen de geteste subtypes (P1 en P6). Dit is een bijzonder belangrijk element dat naar voor komt in deze studie, aangezien dit toont dat ontsteking niet alleen voorbehouden is voor een inflammatoire pathologie. LGMD kan eveneens inflammatie vertonen, wat naar de differentiële diagnose een belangrijk punt is.
Dit zijn twee voorbeelden, maar uit wetenschappelijk onderzoek blijkt dat secundaire veranderingen zich nog op andere niveau’s kunnen presenteren. Auteur Mayana Zatz geeft aan dat LGMD2J geassocieerd kan zijn met een secundaire CAPN3-deficiëntie aangezien de fout dicht bij titine gelegen is (6). De bekomen resultaten binnen deze studie tonen eveneens afwezigheid van CAPN3 op western blot bij een patiënt met LGMD2J, wat de resultaten van het gepubliceerde artikel bekrachtigt. Een bijkomende verandering die zich kan manifesteren
met name dan vooral bij patiënten met LGMD2I is een manifeste verlaging van DAG1, aangezien het FKRP instaat voor de -glycolysatie van dystroglycan. Dit wordt aangegeven door het wetenschappelijk artikel van Lydia U (12), maar eveneens bevestigd door de IF- kleuringen van P3 en P4. Bij deze cohorte zijn dysferline en sarcoglycaan eveneens getest, met als resultaat dat dysferline op IF zwak aankleurt bij drie patiënten (P1, P6 en 7), daar waar de sarcoglycanen bij de meeste normaal zijn met uitzondering van P8.
Op basis hiervan kan geconcludeerd worden dat het belangrijk is bij de diagnose van LGMD, en wellicht ook bij andere musculaire dystrofieën om verschillende onderzoeksmethoden mee in rekening te brengen. Louter genetisch onderzoek, zou soms misleidend kunnen zijn, aangezien niet elke variant als pathogeen kan geclassificeerd worden. Het is duidelijk in deze cohorte dat er een belangrijke variabiliteit aanwezig is, niet alleen tussen, maar eveneens binnenin een welbepaald subtype. Op basis van de kennis over het primaire gendefect, valt op dat de fenotypische presentatie breder is dan louter geassocieerd met de causale mutatie. De meeste monogenetische aandoeningen presenteren zich met een sterk variabel ziektebeeld en dit zelfs bij individuen met dezelfde ziekteverwekkende mutatie. Dit duidt op de aanwezigheid van aanvullende factoren, waaronder de zogenaamde modifiers, die de uitkomst van de ziekte in welbepaalde richting kunnen veranderen.
Een modifier is een genetische locus die de uitkomst van de causaal ziekteverwekkende mutatie verbetert, ofwel in welbepaalde mate onderdrukt. Ze kunnen verschillende aspecten van de ziekte beïnvloeden, waaronder de leeftijd bij aanvang, de ernst alsook de duur van de ziekte. Modifiers kunnen inwerken op sommige van de ziekteparamaters, zonder invloed uit te oefenen op de andere (21-22). Er zijn momenteel twee methoden voor het identificeren van modifiers. Ofwel wordt onderzoek uitgevoerd op de zogenaamde kandidaat genen op basis van de biologische kennis van een welbepaald gen. De tweede manier is een benadering via GWAS (genome wide association studies), om statistisch relevante associaties te vinden tussen genetische determinanten en kwantitatieve fenotypes, waaronder de ernst van de ziekte. De meeste wetenschappelijke artikels gepubliceerd over LGMD, handelen over het type 2B. Een voorbeeld dat gegeven wordt, zijn de annexines A1 en A2 die interageren met dysferline. Een overexpressie zou geassocieerd zijn met een toename in ernst van de ziekte (21).
De ontdekking van modificerende genen kan ook directe klinische toepassing hebben. Zo zouden genetische merkers die wijzen op een verhoogd potentieel voor cardiorespiratoire complicaties bijvoorbeeld kunnen gebruikt worden om al eerder ondersteunende therapie in te stellen (21). Het ontrafelen van dergelijke modifiers in de toekomst is belangrijk aangezien het
ervoor zou zorgen dat de pathogenese van bepaalde ziekten, waaronder LGMD beter zou begrepen worden.
Wat betreft de gehanteerde onderzoeksmethoden is een belangrijke opmerking dat er een discrepantie aanwezig kan zijn tussen de western blot en IF-kleuring die uitgevoerd wordt voor één en hetzelfde eiwit. Er zijn twee voorbeelden die uit deze studie duidelijk naar voorkomen. Een zwak IF-signaal is aanwezig voor dysferline bij P6 en P7, ondanks een normale western blot bij deze patiënten. Kijken we naar dys1, is een normale IF-kleuring aanwezig, dat niet bevestigd wordt door de blot, aangezien die eerder zwak is.
Dit alles toont mooi aan dat het louter baseren op 1 welbepaalde methode ertoe zou leiden dat patiënten aanvankelijk het ziekenhuis verlaten met een verkeerde diagnose. Deze studie toont aan dat verschillende elementen van belang zijn binnen een differentiële diagnose van een musculaire dystrofie. Dit betreft een onderzoek op een kleinschalige cohorte, en uit de resultaten kan gesteld worden dat het zinvol zou zijn om deze studie te herhalen op een grotere groep patiënten.
In het kader van correcte diagnostiek is een extra element opgenomen binnen deze masterproef, namelijk het nagaan of met behulp van een antibody tegen ANO5 het mogelijk zou zijn om patiënten van controles te onderscheiden. Een artikel van auteur Jing Xu heeft dit reeds toegepast, waarbij een western blot analyse wordt uitgevoerd met behulp van het N421A/85 antibody. Drie controles worden met drie patiënten gekenmerkt door een ANO5 mutatie vergeleken. Het resultaat is dat de controles een specifiek doublet vertonen rond de 49 kDA, welke niet aanwezig is bij de ANO5 patiënten. De voorspelde volledige lengte van
ANO5 met name 107Kda, wordt niet duidelijk gedetecteerd in een spierbiopt, noch bij de
controles noch bij de patiënten. De afwezigheid ervan zou bij hen niet veroorzaakt zijn door niet-specifieke degradatie gedurende de voorbereiding van het staal, dit omwille van het feit dat de dystrofine band wel duidelijk te zien is, wat gekend staat als een eiwit gevoelig voor degradatie. Deze resultaten veronderstellen dus dat ANO5 heel labiel is en snel proteolyse ondergaat via de proteasoom pathway. Dit artikel geeft aan dat het wel degelijk mogelijk is om via western blot een deel van de LGMD2L patiënten te onderscheiden van de controles (23). Het experiment binnen deze studie bevestigt grotendeels hun bevindingen, aangezien bij de uitgevoerde western blot met een commercieel antilichaam eveneens twee duidelijke bandjes te zien zijn van 40 en 50 kDA, met een afwezigheid van de volledige lengte van ANO5. Van de drie geteste stalen zijn er twee waarvan de 40kd eiwitband afwijkend is. Het antibody dat
hier gebruikt wordt is afkomstig van LSBio en betreft een ander dan hetgeen gehanteerd in het artikel van Jing Xu.
De vraag die gesteld wordt is het feit of western blot nu wel degelijk betekenis zou kunnen hebben voor de toekomst qua diagnostisch middel binnen LGMD type 2L. De 40kd band vertoont bij de patiënten een duidelijke variatie, maar niet bij alle drie deze patiënten. Hieruit