Liu et al onderzochten de rol van het aangeboren immuunsysteem in de pathogenese van APAP-geïnduceerd leverfalen, en kwamen tot de conclusie dat NK en NKT cellen een belangrijke rol speelden in de pathogenese via IFN-γ-productie, chemokine-productie, alsook door neutrofiel-accumulatie en FasL-expressie in de lever te verhogen. Dit werd onderzocht door C57BL/6 muizen intraperitoneaal te intoxiceren met acetaminophen, bij een groep met en zonder (wild type; WT) een anti-NK1.1 antilichaam, en vervolgens werden sALT (serum ALT), histologie, leukocyt accumulatie, overleving en cytokine/chemokine expressie beoordeeld. Bij de anti-NK1.1 antilichaamgroep was het sALT lager, was er verminderde histologische necrose, een verminderde IFN-γ en FasL (Fas ligand) expressie, een verminderde neutrofiel accumulatie (46% minder bij de anti-NK1.1 groep) en een verminderde expressie van chemokines. Dit suggereert een potentiele rol in de exacerbatie van APAP hepatotoxiciteit door neutrofielen die onderhevig is aan invloed van NK en NKT cellen. Ook werd gezien dat de leverschade (gebaseerd op sALT en histologie) verminderd was bij Fas/FasL deficiënte muizen, wat een bijdrage van dit systeem in APAP-toxiciteit suggereert. (63)
Tabel 8: invloed van NK(T) cellen op de pathogenese van APAP-hepatotoxiciteit NK(T) ↑ neutrofiele FasL expressie
↑ neutrofiel-accumulatie
↑ sALT en histologische leverschade ↑ IFNγ expressie
41 ↑ chemokines
Manakkat et al onderzochten de TLR-expressie en cytokine productie van circulerende neutrofielen bij 24 patiënten met APAP-geïnduceerd ALF (AALF) en vergeleken deze met 10 gezonde controles, en dit werd ook geëvalueerd na ex vivo stimulatie met LPS, oligodeoxynucleotiden, ammonium chloride en IL-8. De expressie van CD16 (FcγRIII structuur) en TLR4 waren significant verlaagd bij AALF patiënten op dag 1 in vergelijking met de controles (HC; healthy control). De expressie van TLR9 was significant verhoogd bij AALF- patiënten in vergelijking met HC op dag 1. Plasma IL-8, IL-6 en IL-10 waren allemaal significant verhoogd op dag 1 in vergelijking met HC. Ook de ernst van SIRS toonde een relatie met TLR9 neutrofiel expressie en IL-8 in het plasma bij AALF patiënten, en een analoge relatie werd gezien tussen de ernst van HE (hepatische encefalopathie) en TLR9 neutrofiel expressie en plasma IL-8. Wanneer gezonde neutrofielen gestimuleerd werden met IL-8 of NH4Cl, werd
gezien dat de TLR9 expressie enkel significant verhoogde bij costimulatie. Ook werd waargenomen dat de intracellulaire IL-8 productie toenam bij gezonde neutrofielen als deze gestimuleerd werden met NH4Cl of oligodeoxynucleotiden, wat suggereert dat dit chemokine
sterk opgereguleerd wordt na DAMP of ammonium contact. Neutrofiel TLR9 expressie bleef onveranderd na stimulatie met NH4Cl en LPS, bij HC en AALF-patiënten met matig tot milde
SIRS score en HE, wanneer vergeleken met ongestimuleerde cellen; echter bij AALF patiënten met een hoge SIRS score of een gevorderde HE werd na stimulatie met NH4Cl en LPS een
significante verlaging van de TLR9 expressie gezien alsook een daling in de productie van TNFα en IL-8 (wanneer vergeleken met ongestimuleerde neutrofielen), wat lijkt te wijzen op een uitputting van neutrofielfunctie bij een ernstig ziekteverloop. Verder werd de neutrofielfunctie geëvalueerd op basis van NPA (neutrophil phagocytic activity) en SOB (spontaneous oxidative burst); op dag 1 was de NPA significant verlaagd bij patiënten met AALF (vergeleken met HC), en de SOB was significant verhoogd (in vergelijking met HC). (64) Een studie door Graubardt et al onderzocht de functionele dichotomie (pro-inflammatoir en anti-inflammatoir) van leverinfiltrerende monocyt-afgeleide macrofagen (MoMF) in een muismodel met APAP-hepatotoxiciteit, in verschillende fases, namelijk de necroinflammatoire fase (24u na APAP-toediening) en de vroege resolutiefase (vanaf 48u na APAP-toediening). Bij een histologische analyse van levers van APAP-behandelde muizen kon gezien worden dat neutrofielen de necrotische zone infiltreerden na 24u, en aanwezig bleven tot de vroege resolutiefase na 48u, en dat er op dezelfde plaatsen zich ook monocyt-afgeleide macrofagen bevonden, en dat de rekrutering op een analoge manier verliep (zij het dat de neutrofielen- infiltratie de monocyt-infiltratie iets voorging). Tijdens de vroege resolutiefase waren neutrofielen dominant aanwezig, maar veel van de MoMFs waren al gedifferentieerd tot een
42 ander fenotype, namelijk van Ly6Chi naar Ly6Clo. Tijdens de resolutiefase (72u post APAP) was MoMF het dominante celtype. In vivo ablatie van MoMF door toediening van een anti- CCR2- antilichaam MC2 leidde 72u post APAP tot een significante verhoging van het aantal neutrofielen (vergeleken met controles), alsook een meer uitgebreide necrotische schade 48u post APAP. Tijdens de necroinflammatoire fase (12u en 24u post APAP) was de histopathologie en de sALT/sAST vergelijkbaar tussen de MC2 behandelde muizen en de controles. Via flow-cytometrie werd gezien dat MoMF ablatie leidde tot een verminderde aanwezigheid van ROS+ neutrofielen tijdens de necroinflammatoire en de resolutiefase postAPAP, met als extra kenmerk een reductie van NADPH oxidase 2 expressie, meest prominent tijdens de necroinflammatoire fase (24 post APAP), maar dat er ook een verhoogde aanwezigheid van ROS(-) neutrofielen was tijdens de resolutiefase (48 en 72u post APAP), allemaal in vergelijking met controles zonder MoMF ablatie. Deze resultaten suggereren dat MoMF neutrofielen activeren tot ROS productie tijdens de necroinflammatoire fase in een murien model. Wanneer CD14+ menselijke monocyten (menselijk equivalent van Ly6Chi) gestimuleerd werden met LPS (controles waren niet-LPS gestimuleerde monocyten) in cocultuur met gezonde menselijke CD66+ neutrofielen gebracht werden, en dat deze gestimuleerde monocyten in staat waren om neutrofielen op directe wijze te activeren tot ROS- productie en verhoging van de CD66b expressie. Verder voerde de studie een uitvoerige genetische analyse uit van neutrofiele-genen, in een vergelijking van MC2 behandelde muizen en muizen die PBS toegediend kregen 24u na APAP toediening, waaruit algemeen de conclusie getrokken kan worden dat Ly6chi monocyten de transcriptionele activiteit zo veranderen dat de neutrofiel een eerder pro-inflammatoir fenotype krijgt. Een RNA-analyse van de necroinflammatoire fase toonde dat neutrofielen anti-apoptotische genen opreguleerden en pro-apoptotische genen downreguleerden in de afwezigheid van Ly6Chi monocyten, wat suggereert dat Ly6Chi monocyten bijdragen tot de regulatie van neutrofiel- apoptose, en de onderzoekers bevestigden dit verder via ‘high resolution confocal imaging’, waarbij internalisatie van Ly6G+ neutrofielen door Ly6Chi monocyten gezien werd tijdens de vroege resolutie fase (48u post APAP). Ook een grote rol voor MoMF in het opruimen van apoptotische neutrofielen tijdens de resolutiefase werd gezien, via de verhoogde expressie van unieke receptoren en brugmoleculen voor de herkenning van apoptotische cellen, al wordt aangehaald dat ook Kupffer cellen in staat zijn om dezelfde receptoren en moleculen tot expressie te brengen, al halen de onderzoekers aan dat deze functie waarschijnlijk minder belangrijk is door de verschillende lokalisaties van KCs en neutrofielen tijdens de resolutiefase. (65)
43 Figuur 14: De neutrofiel onder invloed van pro- en anti-inflammatoire monocyten (65)
44
Discussie
De resultaten over de rol van neutrofielen in het APAP-model van steriele inflammatoire leverziekte zijn zeer controversieel, en dit kan verschillende oorzaken hebben. Dit kan onder andere liggen aan het gebruik van verschillende muismodellen, het gebruik van verschillende dosissen APAP om leverinflammatie te induceren, verschillende manieren van toediening (intraperitoneaal, oraal), effecten van uitgevoerde interventies op het APAP-metabolisme, uiteenlopende strategieën om neutrofielfunctie te beïnvloeden en andere. Bijvoorbeeld in de studie van Cover et al werd gezien dat er een relevant verschil in leverschade na APAP was tussen C3Heb/FeJ en C57BL/6 muizen, met ook een verschillende hoeveelheid accumulerende neutrofielen en een verschillende expressie van mRNA van pro-inflammatoire mediatoren. (56) Ook evalueerden vele studies de vroege fases van APAP-hepatotoxiciteit, terwijl latere fases waar resolutie en regeneratie optreedt minder vaak geëvalueerd werden. Verschillende studies lijken een rol voor neutrofielen in het exacerberen van APAP- hepatotoxiciteit aan te tonen.
Liu et al rapporteerden dat voorbehandeling met anti-Gr-1 (leidt tot neutrofiel-depletie) beschermde tegen APAP-cytotoxiciteit, en dat ICAM1 deficiëntie ook leidde tot bescherming tegen leverschade en een verminderde neutrofiel-infiltratie. (42) Jaeschke et al (66) publiceerden een commentaar op het werk van Liu et al, en stelden hypotheses op om een belangrijke vraag omtrent anti-neutrofiel-anti-Gr1 antilichaam te beantwoorden, namelijk: waarom is het aangetoond dat voorbehandeling met het antilichaam beschermde tegen APAP- cytotoxiciteit, maar nabehandeling niet, zoals gebruikt in de studie van Cover et al (56). Liu et al toonden reeds in hun originele studie aan dat de toediening van het antilichaam geen veranderingen bracht aan het metabolisme van APAP door de lever. (42) Een andere verklaring echter zou zijn dat bij voorbehandeling antilichaam-gecoate neutrofielen in de lever verwijderd worden door de residente macrofagen, de Kupffer cellen (KCs), en dat hierdoor bij deze KCs beschermende genen geïnduceerd worden, zoals HO-1 (haem oxygenase-1), metallothionein-1 (MT-1) en MT-2. MT-1 en MT-2 zijn in staat om ROS of RNS te neutraliseren. De hypothese van Jaeschke et al is bijgevolg dat voorbehandeling met anti-Gr-1 gekende en ongekende beschermende genen kan activeren, wat op zich hepatotoxiciteit kan verminderen, zonder dat dit iets zegt over de impact van neutrofielen. (66) Verder heeft de studie van Liu et al de beperking dat functionele informatie over de werking van de neutrofiel in het leverparenchym ontbreekt. (42) Ishada et al gebruikten een ander antilichaam (anti-Ly-6G) om neutrofiel-depletie te bekomen, maar de effecten van dit antilichaam op het metabolisme van APAP werden niet nagegaan. Wel werd functionele informatie gegeven, met een gerapporteerde verhoogde iNOS en CXCR2 expressie van neutrofielen na APAP toediening.
45 (43) Marques et al publiceerden sterke conclusies over de rol van neutrofielen in het verergeren van schade na APAP, maar hier zijn enkele zaken over op te merken. Allereerst kan, analoog met Liu et al (42), de activatie van protectieve genen na anti-Gr-1 toediening een verstorende factor zijn. Ten tweede wordt geen informatie over de activatie of de functie van neutrofielen gegeven, en ten derde zou de depletie van CXCR2 en FPR1 ongekende effecten op de metabolisatie van APAP kunnen hebben, waarbij een verminderde neutrofielinfiltratie simpelweg het gevolg van een verminderde schade zou kunnen zijn. (44) Verder moeten de conclusies die getrokken worden uit de experimenten met HepG2-cellen met voorzichtigheid geïnterpreteerd worden, omdat geweten is dat de expressie van bepaalde metabole pathways verschilt met primaire hepatocyten, waardoor de eiwit-adduct formatie bij APAP toediening kan verschillen. (67)
Huebener et al concludeerden dat HMGB1 als DAMP vanuit het leverparenchym een belangrijke rol speelt in het rekruteren van neutrofielen en versterken van steriele inflammatie, waarbij deze cytotoxiciteit NE-afhankelijk zou zijn. (68) Raevens et al toonden een rol voor NE aan in het onderhouden van steriele inflammatie, omdat in hun muismodel gezien werd dat sivelestat in combinatie met NAC na APAP leidde tot een verminderde leverinflammatie (gekwantificeerd via hepatische expressie van CCL2, CXCL2, CCR2, en de aanwezigheid van TNFα, IL-1b en TLR-4), wanneer vergeleken met muizen zonder behandeling of monotherapie met NAC of sivelestat. De combinatie van sivelestat en NAC leverde significante winst op in vergelijking met NAC of sivelestat in monotherapie qua leverschade na APAP-intoxicatie. Ook werd een rol voor NE in de infiltratie van monocyten richting het leverparenchym aangetoond. In conclusie suggereren deze resultaten dat neutrofielen en NE bijdragen tot het onderhouden van steriele inflammatie en bijgevolg leverschade na APAP-intoxicatie. (69)
Czepielewski legde een verband tussen onrechtstreekse inhibitie van IL-8 door toediening van een GRPR-antagonist, verminderde schade en verminderde neutrofiel-infiltratie na APAP- intoxicatie. De verminderde migratie zou verband houden met veranderingen in de expressie van CD11b en CD66b. De onderzoekers evalueerden eventuele APAP-metabolisme veranderingen op basis van ALT en ICG (isocyanide groen; functietest voor de lever), maar helaas werden de effecten op CYP activatie en GSH reserves niet gecontroleerd. (46) He et al kwamen tot de conclusie dat neutrofielen waarschijnlijk bijdragen aan leverschade op basis van een verergerde leverschade bij ICAM-deficiëntie, maar dit werd gedaan in combinatie met een miR-223 deficiëntie, waarbij dezelfde auteurs in hetzelfde artikel tot de conclusie komen dat miR-223 een fysiologische rol speelt in het verhinderen van excessieve neutrofiel-activatie na APAP-intoxicatie. Hoewel de auteurs duidelijk aangeven dat ze een rol voor neutrofielen in APAP-hepatotoxiciteit vermoeden, geven ze tegelijkertijd aan dat dit in fysiologische omstandigheden geattenueerd wordt. (47) Antunes et al toonden een rol aan voor IL-33 in de
46 exacerbatie van leverschade na APAP, omdat blokkade van de receptor leidde tot een verminderde leverschade en een verlengde overleving, en een relatie tussen IL-33 en neutrofiel-accumulatie werd ook gezien. Anti-Ly-6G gemedieerde depletie van neutrofielen leidde tot verminderde schade en verminderde vrijstelling van IL-33, maar bij de toediening van dit antilichaam werden wijzigingen van het APAP-metabolisme niet gecontroleerd. Ook gaf de studie geen functionele informatie over hoe neutrofielen de schade zouden verergeren. (48) Ayata et al toonden een rol aan voor P2Y2R op neutrofielen in het organiseren van neutrofielinfiltratie in de pathogenese van APAP hepatotoxiciteit, en legden hierbij een verband met leverschade, al wordt in dezelfde studie aangetoond dat P2Y2R op hepatocyten zowel celdood als de loslating van chemokines kan induceren, waardoor geen absoluut verband tussen neutrofielen-infiltratie en APAP-leverschade aangetoond kan worden. (52) Oancea et al rapporteerden een verminderde APAP-hepatotoxiciteit wanneer een E-selectine antagonist toegediend werd, maar effecten van de interventie op het APAP-levermetabolisme werden niet gecontroleerd. (54)
Langs de andere kant zijn er ook vele studies die het idee van een rol voor neutrofielen in het verergeren van APAP-geïnduceerde schade volledig verwerpen.
Lawson et al publiceerden reeds in 2000 dat neutrofielen niet systemisch geactiveerd waren na APAP-toediening, gebaseerd op de afwezige opregulatie van Mac-1 (CD11b/CD18) en L- selectine na APAP-toediening, en het feit dat CD18-antilichaam toediening geen effect had op de progressie van leverschade. Wel werd ook hier niet gekeken of het antilichaam wijzigingen in het APAP-metabolisme teweegbracht. (55) Een mogelijke verklaring voor de verschillende resultaten tegenover Liu et al (42), zou zijn dat CD18 antilichaam geen effect had op de FasL expressie, terwijl bij anti-Gr-1 het FasL mechanisme van cytotoxiciteit afwezig zou zijn. Cover et al (56) publiceerden tegenovergestelde resultaten dan Liu et al (42) en He et al (47), met ICAM-deficiëntie die niet beschermde tegen APAP-geïnduceerde leverschade, en anti-Gr-1 toediening na APAP toediening die niet beschermde tegen cytotoxiciteit. Ook hier werd het APAP-metabolisme niet gecontroleerd, maar er werd wel aangetoond dat neutrofielen functioneel niet actief waren tijdens APAP-cytotoxiciteit, gekwantificeerd via HOCl aanwezigheid in de lever. NADPH oxidase deficiëntie beschermde ook niet tegen APAP- hepatotoxiciteit, wat een rol voor neutrofiel-geproduceerd ROS in het verergeren van de pathogenese verwerpt. De inductie van oxidatieve stress is namelijk cruciaal in rechtstreekse neutrofiel-geinduceerde cytotoxiciteit, ook voor eventuele cytotoxiciteit door proteases, dus het feit dat NADPH oxidase niet beschermt kan als een sterk argument beschouwd worden. (zie supra) (56, 70) Williams et al toonde in 2010 aan dat CD18 deficiëntie niet beschermde tegen APAP hepatotoxiciteit, dat neutrofielen niet significant meer Mac1 tot expressie brachten of zich voorbereidden op ROS formatie na APAP-toediening en dat zelfs neutrofielen die extra
47 gestimuleerd werden met LPS na APAP-toediening geen extra schade toebrachten (maar wel een toegenomen accumulatie in de lever en toegenomen productie van pro-inflammatoire cytokines werd geobserveerd). Een hypothese die de onderzoekers formuleerden was de volgende: de celschade verricht door het inflammatoir proces zou afhankelijk zijn van de schade van het originele insult. Bij matige en niet-dodelijke stress zouden neutrofielen celdood kunnen induceren en zo schade verergeren, maar bij een lethale hepatotoxische celstress (zoals bij APAP-intoxicatie) verandert de neutrofiel hier niets aan. (57) Hou et al onderzocht de rol van IL-15 in de pathogenese van APAP-geïnduceerde leverschade, en wanneer neutropenie geïnduceerd werd door toediening van Vinblastine had dit geen enkel effect op de vatbaarheid voor APAP-intoxicatie, zowel bij IL-15KO muizen als het WT. (58) De resultaten uit de studie van Williams et al uit 2014 toonde een relatie tussen neutrofiel-accumulatie in necrotische zones tijdens regeneratie in een muismodel, en in neutrofielen van menselijke patiënten werd gezien dat neutrofiel-activatie zijn piek bereikte in een fase van herstel. Dit is een van de weinige studies die de rol van neutrofielen over een langere tijdspanne evalueerde, en ook resultaten kon weergeven van menselijke patiënten. Een voordeel van deze studie is ook dat er geen interferentie kon zijn door interventies op de interpretatie van resultaten. (59) Een rol voor neutrofielen in resolutie en regeneratie wordt door verschillende studies aangehaald en blijft een punt van waakzaamheid bij het onderzoeken van immuniteit- interveniërende therapie. Onder andere Alvarenga et al onderzochten dit, en rapporteerden dat anti-Ly6G toediening leidde tot een vertraagd functieherstel van de lever na APAP, en dat dit vertraagd herstel ook gezien werd bij de toevoeging van een MMP-1 inhibitor, farmacologische inhibitie van neutrofiel-degranulatie door middel van cromoglycaat, en de toevoeging van een protease-inhibitor, wat een rol voor deze neutrofiele functies in regeneratie suggereert. (61) Echter, bij het werk van Raevens et al werd aangetoond dat NE-inhibitie via sivelestat niet leidde tot vertraagde regeneratie post-APAP (gekwantificeerd via transaminasen en necrose). (69) Yang et al documenteerden uitvoerig dat het blokkeren van neutrofielen tijdens de resolutiefase (72u post APAP) leidde tot verhoogd sALT-niveau’s, meer necrotische zones en minder functionele hepatocyten. Ook werd gezien dat neutrofielen macrofagen kunnen aansturen tot een verandering tot een meer anti-inflammatoir fenotype, deels via ROS vorming. (62)
Er kan gesteld worden dat de rol van neutrofielen in APAP-geïnduceerde leverschade niet eenduidig is, en dat hun gedrag waarschijnlijk sterk afhankelijk is van het inflammatoir milieu waarin zij zich bevinden. Bijvoorbeeld, Kojo et al toonden aan dat BLT1 signaaltransductie een anti-inflammatoir effect had op de activatie van neutrofielen, omdat bij BLT1 deficiënte muizen een verhoogde ROS en MMP9 productie gezien werden, alsook een verhoogde mRNA expressie van CD11b en ICAM-1. (60) Manakkat et al toonden een relatie aan tussen
48 neutrofiele TLR-9 expressie, de aanwezigheid van IL-8, de aanwezigheid van verhoogde ammoniumspiegels in het bloed en de aanwezigheid van vrij DNA. (64) Ook de effecten van micro-RNA-223 als een negatief feedback mechanisme op de mtDNA/TLR9 signalisatie illustreert de complexe regulatie van neutrofiel-activatie. (47) IL-17 had effecten op MPO- activiteit, neutrofiel-accumulatie en de aanwezigheid van pro-inflammatoire cytokines. (50) Neutrofiel-functie is ook beïnvloedbaar door andere immuuncellen, zoals NK en NKT cellen (63) en monocyt-afgeleide macrofagen (65). Ook Triantafyllou et al identificeerden een anti- inflammatoir type macrofagen bij APAP-hepatotoxiciteit, waarbij verwijdering van dit fenotype leidde tot een verergerde leverschade met een verhoogde neutrofiel-activatie. (71) IL-33 had effecten op de accumulatie van neutrofielen en de progressie van APAP-geïnduceerde leverschade. (48)
Het is zeer moeilijk om te achterhalen waarom er zoveel tegenstrijdigheden bestaan over de bijdrage van de neutrofiel in het ontsporen van APAP-geïnduceerde leverschade, en dit kan maar opgehelderd worden als de onderzoekers een inspanning zouden doen om te kijken hoe de opstellen van hun experimenten verschilden, evalueren of hun resultaten reproduceerbaar zijn door andere onderzoekscentra en eventueel een internationale guideline zouden opstellen/afspreken om experimenten uit te voeren, om dergelijke fouten in de toekomst te vermijden en de complexe rol van neutrofielen sneller te kunnen ontrafelen. Hoewel de evidentie zoals hierboven in kaart gebracht geen eenduidig antwoord kan bieden over de neutrofiel en de exacerbatie van schade, wordt wel zeer duidelijk een rol voor de neutrofiel in resolutie en regeneratie aangegeven. Dit ligt in lijn met verschillende reviews die de rol van inflammatie in APAP-hepatotoxiciteit onderzochten. (21, 28, 72) Langs de andere kant zijn er vele argumenten beschreven waarbij het belang van steriele inflammatie in de progressie van APAP-geïnduceerde leverschade en de invloed van neutrofielen op dit proces geïllustreerd wordt. Met andere woorden, interventies tegen neutrofielen waarbij de inflammatoire respons