Voordat het onderzoek gestart werd, is gesteld om stafylokokken en Gram negatieve staven uit positieve bloedkweken te meten. Met de stafylokokken zijn verschillende problemen opgetreden. In totaal zijn er 9 stafylokokken gemeten waarvan 5 CNS en 4S. aureus. Bij 5 stafylokokken (4 CNS, 1 S, aureus) waren er problemen met de positieve controle. Deze groeide niet, nauwelijks of pas na minstens 120 minuten. Verwacht werd dat de positieve controle goed zou groeien omdat de stafylokokken uit de bloedkweek in de exponentiële fase zitten, in een rijk medium én bij een optimale temperatuur van 37°C geïncubeerd worden. Het kan lijken dat de stafylokokken gevoelig zijn voor het antibioticum waar op getest wordt terwijl dit niet zo hoeft te zijn omdat de positieve controle niet groeit, hierdoor zijn de andere metingen bij de bloedkweek minder betrouwbaar.
Nadat bloedkweken verdeeld waren over de antibiotica- en tijdsreeksen, werden de monsters meteen in een koelbox op koelelementen gezet. Deze stap is na vier gemeten stafylokokken weggelaten bij deze groep. Christof von Eiff et al [30] laat zien dat coagulase negatieve stafylokokken moeilijke groeiers zijn. Er werd gedacht dat door de monsters op ijs te zetten, de stafylokokken een te grote klap zouden krijgen en zo moeite hadden om te profileren. Echter, bij de 5 stafylokokken die na deze stap werden gemeten, zijn bij 2 CNS nog steeds problemen ondervonden met de positieve controle.
Naast problemen met de positieve controle bij stafylokokken zijn er nog andere problemen opgetreden. Bij 8 van de 9 stafylokokken (5 CNS, 3 S. aureus) zijn de resultaten
onbetrouwbaar omdat er gisten, abnormale rode bloedcellen en sperma cellen zijn gemeten. Bij 7 stafylokokken zijn er gisten gemeten door de UF-1000i, het is onwaarschijnlijk dat deze daadwerkelijk in de bloedkweek zaten. De gisten zijn niet gezien in het Gram preparaat, zijn niet gekweekt tijdens het onderzoek en zijn ook niet door de analisten op het bacteriologisch lab gekweekt die met de bloedkweken gewerkt hebben. De gemiddelde grootte van één losliggende kok is 0,5 – 1 µm, doordat stafylokokken in groepjes liggen kan de totale grootte van één trosje variëren tussen de 1 en 8 µm. De grootte van een gist is gemiddeld 5-10 µm. Één stafylokok kan net zo groot zijn als één gist cel. Het kan zijn dat stafylokokken zijn gemeten als één grote cel door de UF-1000i en hierdoor zijn geclassificeerd als gisten.[31] Niet alleen de grootte van de stafylokokken lijken op die van gisten, ook de celwand van beide micro-organismen is Gram positief. De UF-1000i kan de celwand van de stafylokokken mogelijk in combinatie met de grootte van de cellen, niet/moeilijk onderscheiden van gisten. Bij 6 stafylokokken werden er abnormale rode bloedcellen gemeten. Zo was bij een S. epidermidis bij t0 [0,125] gentamicine het aantal abnormale RBC 22,7 /µL en bij dezelfde concentratie maar bij t180 het aantal abnormale rode bloedcellen (RBC) 700,4/µL. Deze twee monsters zijn uitverdeeld vanuit één flesje MH bouillon met antibiotica en bacteriën. Er kan variatie zitten in het aantal RBC/µL, maar een verschil van 677,7 /µL is onwaarschijnlijk. Een rode bloedcel heeft een gemiddelde grootte van 7-8 µm. Mogelijk is hier dezelfde verklaring als bij de gisten die zijn gemeten. Normaal gesproken liggen rode bloedcellen tegen de Y-as in het plot. Bij alle 6 de stafylokokken waar abnormale RBC gemeten zijn, lag een gedeelte van de RBC tegen het spectrum van de bacteriën. De gemeten waarden zijn hierdoor onbetrouwbaar omdat het gedeelte RBC dat tegen het spectrum van bacteriën ligt ook bacteriën kunnen zijn die geclassificeerd zijn als RBC.[32]
Bij 2 stafylokokken zijn spermacellen gemeten. Het is onwaarschijnlijk dat er spermacellen in een bloedkweek aanwezig zijn. Dit is niet gezien met de Gram kleuring van de positieve bloedkweek en ook niet bij de Gram kleuring die direct van het gemeten monster is gemaakt nadat de UF-1000i spermacellen had gemeten.
34 De kop van een spermacel is 4,5 µm lang en 2,5 µm breed. Waarschijnlijk is de oorzaak van het meten van de spermacellen hetzelfde als bij de abnormale rode bloedcellen en bij degisten.
Er zijn verschillende testen uitgevoerd om te proberen de stafylokokken meer ‘uit elkaar te halen.’ Vóórdat een monster werd gemeten met de UF-1000i werd er kort gevortexed op 700 RPM. Een monster uit een willekeurige tijdsreeks is in duplo meegenomen waarbij het ene monster op de gebruikelijke manier kort gevortexed en gemeten werd en waarbij de duplo 60 seconden bij 700 RPM gevortexed en gemeten werd. Als het langer vortexen effect heeft op het ‘los maken’ van de stafylokokken werd er verwacht dat er meer bacteriën/µL gemeten zouden worden. Dit was echter niet het geval, de aantallen bleven navenant gelijk. Met een S. aureus stam geïsoleerd uit een positieve bloedkweek die onbetrouwbare resultaten gaf tijdens het meten met de UF-1000i zijn testjes uitgevoerd met saponine en ureum. Saponine is een zeepstofdie een oppervlaktespanning verlagende werking heeft en in staat is om de permeabiliteit van de celmembranen te verhogen zonder de cel kapot te maken. Ureum is een product dat wordt gevormd in de lever bij de afbraak van eiwitten en effect heeft op de permeabiliteit van membranen. [35] In een buis met MH bouillon met 5% saponine en in een ureum buis zijn enkele kolonies van S. aureus gesuspendeerd en twee uur in een stoof van 36°C gezet. Vervolgens werden hier Gram preparaat van gemaakt en werden vergeleken met dezelfde S. aureus stam die van de bloedplaat kwam. De S. aureus van de bloedplaat bestond alleen maar uit trosjes van tenminste 15 kokken. De S. aureus uit de saponine en uit ureum bestonden uit erg kleine trosjes van maximaal 8 kokken. Naast deze kleine trosjes lagen er erg veel losse kokken in het preparaat. De UF-1000i wordt in de routine wordt gebruikt om urines te meten. Bekend is dat ureum geen negatief effect heeft op de flowcytometer, er is geen ureum van de onderzoeken op stafylokokken gemeten met de UF-1000i. Om te kijken of saponine effect heeft op de UF-1000i is er een buis met MH bouillon met 0,5% saponine gemeten. Verwacht werd dat er in het MH bouillon geen bacteriën en andere cellen aanwezig waren en de UF-1000i bij alle te meten cellen 0/µL geeft. In plaats hiervan gaf de UF-1000i overal strepen als resultaat en bleef het langer spoelen dan normaal. Mogelijk heeft saponine een negatief effect op de UF-1000i.
Aan elke antibiotica concentratie en aan de positieve controle zijn bacteriën van de positieve bloedkweek toegevoegd. Tijdens het uitverdelen van het verdunde, afgedraaide bloed naar de verschillende concentraties ontstaat er vaak al een verschil in het aantal bacteriën / µL. Dit is het gevolg van bijvoorbeeld niet goed vortexen of bij de ene concentratie net iets meer of minder volume toe voegen dan bij een andere concentratie. Hierdoor was op tijdstip 0 het aantal bacteriën / µL niet overal hetzelfde.
Ook moest er tijdens het uitverdelen naar de antibiotica reeks rekening gehouden worden met de exponentiële fase van de bacteriën. Uit het meten van de beginwaarde van de
bloedkweek kan komen dat er 1:1000 verdund moet worden om ongeveer 300 bacteriën / µL te krijgen . Tussen de beginwaarde meten en de ‘echte’ reeks meten kan een tijdsverschil zitten van 60 minuten waarin de bacteriën in staat zijn om zich te vermenigvuldigen. Als er dan 1:1000 verdund is en de echte reeks wordt gemeten, kunnen de bacteriën bij t0 ipv 300 al 1200 bacteriën / µL zijn. Dit was vooral te merken bij Gram negatieve staven.
Één reeks (bijvoorbeeld t30 of t90) bestaat uit ongeveer 9 monsters. Tussen het meten van het eerste- en het laatste monster uit dezelfde tijdsreeks is een tijdsverschil van minimaal 10 minuten aanwezig. Zodra een te meten reeks uit de stoof gehaald werd, werd deze in een koelbox met koel elementen gezet. De intentie hiervan was de monsters koel te houden en zo doorgroei zo veel mogelijk te beperken. Maar omdat de monsters uit een stoof van 37°C kwamen, waren de monsters niet meteen koel. Hierdoor is er een mogelijkheid dat er doorgroei heeft plaatsgevonden.
35 Tijdens vorig onderzoek uitgevoerd door N.L.A Arents et al [6] was er een soortgelijke proef opzet als bij het BK AST-BCCM onderzoek. N.L.A Arents et al hebben stammen afkomstig van patiënten gebruikt, deze 18-24 uur opgekweekt op bloed agar en vervolgens gemeten met de UF-1000i. Tijdens het BK AST-BCCM zijn directe positieve bloedkweken gebruikt (zonder op te kweken) en gemeten met de UF-1000i. Het grote verschil is dat bij de
opgekweekte bacteriën deze zich in de stationaire fase bevonden en bij de bacteriën direct verkregen uit bloedkweken zich in de exponentiële fase bevonden. De Sysmex UF-1000i heeft een limiet van ongeveer 35.000 bacteriën/µL wat gemeten kan worden. Tijdens het vorige onderzoek bij bekende stammen kon door de stationaire fase tot t240 min gemeten worden omdat de bacteriën langzamer groeiden. Bij het AST-BCCM kon er in veel gevallen maar tot t120 min gemeten worden door het hoge aantal bacteriën wat op dat tijdstip al verkregen was. In theorie kunnen Gram negatieve staven per 20 minuten vermenigvuldigen, in praktijk bleek dat het aantal bacteriën tussen t0 en t30 soms wel 3 keer vermenigvuldigd waren. Dit komt doordat de groei van de bacteriën in de exponentiële fase extra
gestimuleerd werd omdat deze in een rijke omgeving (MH bouillon) en optimale temperatuur gezet werden.
In het begin van het onderzoek is gesteld om de BK AST-BCCM methode te vergelijken met de drie gouden standaarden samen. Tijdens het onderzoek bleek dat de MIC waarden van de macro dilutie, VITEK en de e-test in veel gevallen niet precies overeen kwamen. De VITEK en de e-test kwamen in de meeste gevallen wél overeen, zo waren er van de 49 VITEK bepalingen er 39 precies gelijk aan de e-test. Van de 10 MIC bepalingen die incorrect waren, lagen er 9 één dilutie hoger of lager. De MIC d.m.v. de macro dilutie kwam maar in 11 van de 49 VITEK en e-test bepalingen overeen. Volgens CLSI ‘Methods for Dilution
Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria That Grow Aerobically ; Approved Standard’ is het gebruikelijk dat de MIC voor Gram negatieve bacillen verkregen d.m.v. de macro dilutie vaak één of twee verdunningen hoger ligt dan de MIC verkregen d.m.v. micro dilutie.[34] Over het algemeen gaven de VITEK en de e-test de beste en de macro dilutie de minste resultaten als referentie methoden. De essential agreement bij de macro dilutie was op zijn hoogst 80% terwijl dit bij de VITEK 98% was en bij de e-test 96%. Ook de categorial agreement met de macro dilutie als referentie was het laagste, 86%. Bij de VITEK is de categorial agreement 98% en bij de e-test 96%.
Om met de BK AST-BCCM methode de meest betrouwbare MIC bepaling uit te voeren op een positieve bloedkweek, wordt cut off C gebruikt en op t120 afgelezen. Hierbij is de VITEK de referentie methode. De essential agreement is 98% waarbij maar bij één positieve
bloedkweek de MIC verkeerd bepaald was. Deze lag meer dan tweediluties lager dan de referentie. Volgens tabel 3 standard performance criteria accordingto U.S. Food and Drug administration is de nieuwe methode BK AST-BCCM aanvaardbaar voor de MIC bepaling op positieve bloedkweken.
Om met de BK AST-BCCM methode de meest betrouwbare S-I-R interpretatie uit te voeren op een positieve bloedkweek wordt ook cut off C gebruikt en op t120 afgelezen. Hierbij is de e-test de referentie methode. De categorial agreement is 96% waarbij geen minor en major errors aanwezig zijn maar wel 25%very major errors.
Het is erg belangrijk bij het stellen van de beste cut off voor de S-I-R interpretatie om te kijken naar de very major errors. Accurate resistentie detectie is erg belangrijk omdat er anders een mogelijkheid bestaat dat een patiënt antibiotica krijgt toegediend waar de bacterie ongevoelig voor is. Dit kan leiden tot falen van de behandeling wat ernstige gevolgen kan hebben voor de patiënt. Volgens de standard performance criteria is deze
36 methode onaanvaardbaar. De categorial agreement moet ≥90% zijn en de very major erros moeten ≤1,5% zijn.
In ‘Guidance for Industryand FDA Class II Special Controls Guidance Document: AST
Systems[33]’ staat een tabel waarin is het aantal very major discrepancies als functie van het aantal resistente organismen staat weergegeven. Om een betrouwbaar resultaat van very major discrepancies te krijgen moeten er met een nieuwe methode minstens 48 resistente stammen getest worden. Van de 50 positieve bloedkweken met Gram negatieve staven waren er volgens de VITEK en de e-test 8 resistent. Ondanks dat er te weinig resistente stammen zijn om VMJ betrouwbaar te berekenen is het toch berekend. De resultaten van VMJ zijn hierdoor onbetrouwbaar.
Verschillende bacteriën zoals Enterobacter- en Citrobacter species bezitten β-lactamase genen als TEM, SHV en AmpCdie in staat zijn om β-lactam antibiotica te hydrolyseren en zo onwerkzaam te maken. Het structurele AmpC gen is gelegen naast het regulerende ampR gen. Het ampR gen codeert voor een eiwit dat dient als activator in de aanwezigheid van een inductor. Vaak is AmpC expressie in normale omstandigheden laag. Zodra het ampR gen wordt blootgesteld aan β-lactam antibiotica wordt het AmpC gen geactiveerd. Deze activatie kan enige tijd in beslag nemen.[29] Met de BK AST-BCCM methode kan het lijken dat Gram negatieve staven met deze genen gevoelig zijn voor cefuroxime omdat er tot maximaal 180 minuten geïncubeerd wordt. Als de genen pas na 180 minuten geactiveerd worden en de Gram negatieve staaf toch ongevoelig blijkt, kan dit met deze methode niet gedetecteerd worden.Dit is de reden waarom er bij alle 9berekende categorialagreementsvery major errors aanwezig zijn. Van de 50 positieve bloedkweken met Gram negatieve staven was er één C. murlinia een één E. cloacae geïsoleerd. Bij geen van de drie gouden standaarden met drie cut offs zijn volgens de BK AST-BCCM methode deze 2 stammen als ongevoelig
geïnterpreteerd maar als gevoelig. Doordat de stammen met de nieuwe methode als gevoelig worden geïnterpreteerd maar ongevoelig zijn, ontstaat er een very major error. Hierdoor was er bij geen enkele categorial agreement een percentage lager dan 1,5% voor very major errors. De BK AST-BCCM methode blijkt niet in staat te zijn om bacteriën met deze resistentie genen als ongevoelig te detecteren.
Alles totaal genomen lijkt de BK AST-BCCM methode potentie te hebben als snelle methode voor de gevoeligheidsbepaling op positieve bloedkweken. Bij 98% van de positieve
bloedkweken met Gram negatieve staven werd de MIC juist bepaald en bij 96% werd de S-I-R interpretatie juist bepaald. Dit kan na 120 minuten al bepaald worden waardoor er een reductie in tijd is tussen de 85-89% t.o.v. de klassieke methode. Het grote voordeel hierbij is dat de bacteriën in de bloedkweek niet opgekweekt hoeven te worden. Doordat de BK AST- BCCM niet in staat blijkt te zijn om bacteriën met bepaalde resistentie genen te detecteren, zijn er geen resultaten zonder very major errors. Er zal verder onderzoek gedaan moeten worden om dit probleem verder uit te zoeken.
37