Bloedkweek antimicrobial susceptibility testing bacterial cell count monitoring

(1)

1

BK AST-BCCM project

Bloed Kweek Antimicrobial SusceptibilityTesting – Bacterial Cell

Count Monitoring

Eindverslag versie 2

Figuur 1 UF-1000i flowcytometer gebruikt voor bacterial cell count monitoring[1]

Michelle Pereira Afstudeer stage bij stichting PAMM

Medische microbiologie Afdeling bacteriologie Avans Hogeschool Breda

(2)

2

Bacterial-cell-count-monitoring voor de

gevoeligheidsbepaling van positieve bloed kweken

Afstudeer kandidaat : Michelle Pereira

Email : M.pereira@pamm.nl

: michellepereira@live.nl

Opleiding : Avans Hogeschool Breda

Academie voor de Technologie van Gezondheid en Milieu

Lovensdijkstraat 61-63 4818 AJ Breda

Biologie en Medisch Laboratoriumonderzoek Afstudeerrichting : Microbiologie

Afstudeerplaats : Stichting PAMM

Laboratorium voor Medische microbiologie Interne route 090

De Run 6250 5504 DL Veldhoven

Postbus 2, 5500 AA Veldhoven

Begeleiding laboratorium : Ellen Retera, senior analist bacteriologie, Bedrijf begeleidster

Niek Arents, arts-microbioloog, begeleider Gerard van Otterdijk, sectiehoofd

mediumbereiding

Maarten Broeren, klinisch chemicus Afstudeerdocent : Carla Remesal van Merode

(3)

3

Voorwoord

Dit eindverslag is geschreven naar aanleiding van de afstudeerstage bij Stichting PAMM te Veldhoven. De afstudeerstage is een onderdeel van de opleiding Biologie en Medisch Laboratoriumonderzoek te Breda. In deze periode is er onderzoek gedaan naar Bacterial Cell Count Monitoring als methode voor de gevoeligheidsbepaling op positieve bloedkweken. Tijdens dit onderzoek is er nauw samengewerkt met het klinisch chemisch laboratorium in het Máxima Medisch Centrum. De metingen die uitgevoerd zijn met de SysmexUF-1000i flowcytometer hebben op dit laboratorium plaatsgevonden. De begeleiding hierbij was afkomstig van Maarten Broeren, Kim van Nieuwenhuijzen, Gerard Coppens en Ingrid de Kruijff.Ook alle andere klinische analisten die geholpen hebben, hartelijk dank hiervoor en voor de ondersteuning die jullie geboden hebben.

Ook gaat mijn dank uit naar alle medewerkers van Stichting PAMM die mij hebben geholpen tijdens het onderzoek. In het bijzonder bedank ik mijn stagebegeleidster Ellen Retera en arts-microbioloog dr. Niek Arents voor de begeleiding en feedback. Gerard van Otterdijk voor het maken van de specifieke antibiotica reeksen en Carla Remesal van Merode mijn

stagebegeleidster vanuit school, voor de begeleiding die ze heeft gegeven door de gehele stage periode.

Michelle Pereira 21-05-2013

(4)

4

Samenvatting

Tijdens het vierde leerjaar van de opleiding Biologie en Medisch Laboratoriumonderzoek te Breda is een afstudeerstage uitgevoerd bij Stichting PAMM te Veldhoven. Deze

afstudeerstage is uitgevoerd ter afronding van de opleiding.

Patiënten met een sepsis zijn ernstig ziek en hebben een grote kans om in korte tijd te overlijden. Een snelle gevoeligheidsbepaling voor deze patiënten is essentieel.

Het doel van de afstudeeropdracht is onderzoek te doen naar bacterial cell count monitoring m.b.v. flowcytometrie als methode voor de gevoeligheidsbepaling op positieve bloedkweken. Nadat de BacT/ALERT een positieve melding gaf werd van de bloedkweek een Gram

preparaat gemaakt om te kijken of er stafylokokken of Gram negatieve staven in zaten. Vervolgens werd de bloedkweek gecentrifugeerd, verdund met MH bouillon en toegevoegd aan een antibiotica reeks en de positieve controle. Deze werden vervolgens verdeeld over verschillende tijdsreeksen. t0 werd meteen gemeten met de Sysmex UF-1000i flowcytometer en de andere tijdsreeksen werden in een stoof van 37°C gezet. t30 werd na 30 minuten en t60 na 60 minuten etc uit de stoof gehaald en gemeten met de UF-1000i. Vervolgens werd alle data geanalyseerd met drie gouden standaarden, verschillende cut off’s en essential- en categorial agreement.

Uit het onderzoek bleek dat stafylokokken te vaak onbetrouwbare resultaten gaven tijdens het meten met de UF-1000i. Zo werden er abnormale rode bloedcellen, gisten en

spermacellen gemeten waarvan onwaarschijnlijk is dat dit daadwerkelijk in de monsters zat. Ook groeide bij veel stafylokokken de positieve controle niet of nauwelijks waardoor de resultaten van de metingen onbetrouwbaar werden. Stafylokokken zijn daarom niet verder meegenomen in het onderzoek.

In totaal zijn er 59 positieve bloedkweken onderzocht. Uit 9 positieve bloedkweken zijn stafylokokken geïsoleerd en uit 50 positieve bloedkweken zijn Gram negatieve staven geïsoleerd. Uit één bloedkweek zijn twéé soorten Gram negatieve staven geïsoleerd

waardoor het totaal 51 geïsoleerde Gram negatieve staven is uit 50 positieve bloedkweken. Om een MIC bepaling uit te voeren bleek de VITEK het beste als referentie methode met cut off C; er is binnen één concentratie bij het volgende tijdsstip maximaal 10% groei of afname op t120. De essential agreement is 98% en aanvaardbaar volgens U.S. Food and Drug Administration. Deze methode reduceert de tijd om een MIC bepaling op bloedkweken uit te voeren met 85-89% t.o.v. van de klassieke methode.

Om een S-I-R interpretatie uit te voeren op positieve bloedkweken met Gram negatieve staven bleek de e-test het beste als referentie methode met cut off C die ook op t120 wordt afgelezen. De categorial agreement is 96% en heeft 25% very major errors. Volgens U.S. Food and Drug Administration is dit niet aanvaardbaar omdat het aantal very major errors ≤1,5% moet zijn.

Stafylokokken geven onbetrouwbare resultaten. Onderzoek voor een voorbehandelingsstap wordt aangeraden. Met bacterial cell count monitoring kan betrouwbaar een MIC bepaling uitgevoerd worden op positieve bloedkweken met Gram negatieve staven maar geen betrouwbare S-I-R interpretatie.

(5)

5

Abstract

During last year of Applied Science followed at Breda University an internship has been conducted at Stichting PAMM in Veldhoven. This internship is performed to complete the training.

Patients with sepsis are likely to be very ill and have an increased chance of death as a result of the condition. A rapid susceptibility testing for these patients is essential. During this study, the concept of bacterial cell count monitoring using flowcytometry has been evaluated as a method for antimicrobial susceptibility testing on positive blood cultures.

After BacT/ALERT had given a positive message of blood cultures, a Gram stain was made to determine whether there were staphylococci or Gram negative rods in it. Then, the blood culture was centrifuged, diluted with MH broth and added to a serie of antibiotics and positive control. Series of antibiotics were divided into different time series. t0 was immediately measured by Sysmex UF-1000i flowcytometer while other time series were put into an incubator of 37°C. t30 was measured after 30 minutes incubating and t60 was measured after 60 minutes etc. All data is analyzed with three golden standards, different cut offs and essential- and categorial agreement.

This project showed that staphylococci in most cases gave unreliable results when these were measured with flowcytometer. For example, abnormal red blood cells, yeasts and sperm cells were measured which is unlikely to actually be present in blood cultures. There also were troubles with the positive control which didn’t or poorly grew which made

measurement unreliable. For this reason, staphylococci aren’t included in this study. 59 blood cultures were examined of which 9 included staphylococci and 50 included Gram negative rods.

For MIC determination, VITEK showed to be the best as reference with cut off C; whitin one dilution there’s a maximum of 10% growth or decrease in number of bacteria at t120. The essential agreement was 98% and acceptable according to U.S. Food and Drug

Administration. This method reduced time with 85-89% compared to the traditional method for susceptibility testing on positive blood cultures.

For SIR interpretation, e-test showed to be the best as reference also with cut off C at t120. The categorial agreement is 96% with 25% very major errors. According to U.S. Food and Drug Administration this is not acceptable because the number of very major errors must be ≤ 1.5%.

Staphylococci produce unpredictable results. Research for a pretreatment step is recommended.

This study showed that the principle of bacterial cell count monitoring for antimicrobial susceptibility testing on positive blood cultures correctly predict MIC determination. SIR interpretation is incorrectly predicted.

(6)

6

Inhoud

1. Inleiding ... 7

2. Theoretische achtergrond ... 8

2.1 BacT/ALERT 3D Dual-T ... 8

2.2 Sysmex Uf-1000i flowcytometer ... 8

2.3 Bloed ... 9

2.4 Sepsis ... 10

2.5 Empirisch antibiotica therapie ... 13

2.6 Cefalosporine ... 14

2.7 Aminoglycoside ... 15

2.8 Traditionele methode gevoeligheid bloedkweken ... 16

3.2 Aantal bacteriën per µL volgens UF-1000i ... 17

3.3 Uitverdelen naar concentraties en tijdreeksen ... 17

3.4 Data analyse en interpretatie van MIC waarden ... 17

4. Resultaten ... 20

4.1 Meting positieve bloedkweek ... 21

4.2.Macro dilutie ... 24

4.2.1Essential agreement (MIC bepaling) ... 24

4.2.2Categorial agreement ( S-I-R interpretatie ) ... 25

4.3 VITEK ... 26

4.4 E-test ... 28

4.5 Optimale cut off voor essential agreement en categorial agreement ... 30

4.6 Klassieke methode VS. BK AST-BCCM methode essential agreement ... 31

5. Conclusie ... 32

6. Discussie ... 33

7. Aanbevelingen ... 37

(7)

7

1. Inleiding

Een snelle diagnose door middel van traditionele methodes van een infectie is een tijdrovend proces. Bacteriële detectie, identificatie en bepaling van antibiotica gevoeligheid van een klinisch monster vergt minimaal 24 uur. Tegenwoordig geldt voor veel infectieziekten hoe langer de patiënt onbehandeld blijft, de kans op overlijden of schade waardoor langer herstel vereist is, groter wordt. Daarnaast is het erg belangrijk om snel geïnformeerd te worden over het gevoeligheidspatroon van de verwekker.[2][3] Voor patiënten met een sepsis is dit essentieel. Sepsis is een klinisch syndroom dat gekenmerkt wordt door de gehele ontstekingsreactie die in gang wordt gezet door het lichaam op een infectie in het bloed. Tijdens een sepsis zijn er veranderingen in lichaamstemperatuur, hartslag en bloeddruk waar te nemen. Dit kan leiden tot een levensbedreigende situatie door de slechte doorbloeding van belangrijke organen als nieren, lever, longen en het centraal zenuwstelsel.[4] In

Nederland overlijden jaarlijks ongeveer 3500 mensen aan sepsis. 30-40% van alle patiënten in Nederland met een ernstige sepsis overlijdt wat het de derde doodsoorzaak maakt in Nederland. Voor patiënten die in een shock verkeren door sepsis overlijdt zelfs 60%.[5] In het verleden was het mogelijk om nagenoeg alle patiënten snel en effectief te behandelen met breed spectrum antibiotica, tegenwoordig wordt dit steeds moeilijker door de wereldwijde opkomst van resistente bacteriën, welke in staat om verschillende resistentie mechanismen te ontwikkelen. Bacteriën kunnen enzymen produceren die antibiotica inactiveren, antibiotica kunnen actief de bacterie worden uitgepompt door efflux pompen, de celpermeabiliteit kan verminderd worden waardoor het antibioticum de cel niet/moeilijk in kan en het

aangrijpingspunt van het antibioticum kan veranderd worden. Snelle

gevoeligheidsbepalingen zullen daarom steeds belangrijker worden. Voor positieve bloedkweken neemt het opkweken van de bacterie gemiddeld 6 uur in beslag en het uitvoeren van de antibiotica gevoeligheid door middel van VITEK 2 (bioMérieux, Marcy-l’E´toile, France) gemiddeld 6-8 uur. In 2011 hebben N.L.A. Arents et al een onderzoek uitgevoerd waarbij er studie gedaan is naar bacterial cell count monitoring (BCCM) door middel van flowcytometrie (UF-1000i) als snelle methode om gevoeligheidsbepaling uit te voeren op stammen waarvan de soort en gevoeligheid bekend was. BCCM gaf voor E. coli na 90 minuten en bij P. aeruginosa en S. aureus na 120 minuten de gevoeligheidbepaling. Dit resultaat verminderde de tijd met 74%, 83% en 76% respectievelijk ten opzichte van de klassieke methode (VITEK 2) waardoor het potentie heeft voor snelle gevoeligheidstesten. Deze methode heeft als voordeel dat het alle resistentie mechanismen meet ten opzichte van moleculaire technieken die vaak gericht zoeken naar één mechanisme. Zo kan een groot aantal β-lactamase genen als ESBL, AmpC, KPC en NDM-1 gedetecteerd worden door middel van de micro array. Er wordt hierbij niet gekeken naar andere mechanismen die de bacterie kan bezitten. [6]In dit afstudeer project is onderzoek gedaan naar of het mogelijk is om middels bacterial cell count monitoring d.m.v. de Sysmex UF-1000i een betrouwbare en snelle gevoeligheidsbepaling uit te voeren op positieve bloed kweken.

(8)

8

2. Theoretische achtergrond

In de theoretische achtergrond worden twee automatische systemen beschreven die gebruikt zijn tijdens het onderzoek; de BacT/ALERT 3D Dual-T en de Sysmex UF-1000i

flowcytometer. Er wordt uitleg gegeven over bloed in het algemeen, het ziektebeeld sepsis, welke pathogenen hierbij betrokken zijn, welke toxinen uitgescheiden kunnen worden door bacteriën en de situatie in Nederland betreft sepsis. Ook wordt er omschreven wat

empirische antibiotica therapie is waarbij twee groepen antibiotica bij sepsis belangrijk zijn; cefalosporines en aminoglycosides. Tenslotte wordt er uitgelegd welke twee antibiotica gebruikt zijn voor het onderzoek, wat de resistentiemechanismen bij deze antibiotica zijn en wat de traditionele methode is bij een gevoeligheidsbepaling van positieve bloedkweken.

2.1 BacT/ALERT 3D Dual-T

De BacT/ALERT 3D Dual-T is een volautomatisch microbieël detectie systeem. De positieve bloedkweken die gebruikt zijn voor het ‘Bloed Kweek Antimicrobial Susceptibility Testing– Bacterial Cell Count Monitoring’ ( BK AST-BCCM ) onderzoek zijn gebruikt nadat de BacT/ALERT een positieve melding gaf. Aërobe, anaërobe, facultatief anaërobe micro-organismen en gisten die aanwezig zijn in bloed kweken kunnen gedetecteerd worden. In de BacT/ALERT gaan de speciale BacT/ALERT bloedkweek flesjes waar voor volwassenen 40 mL en voor kinderen 20 mL tryptic soy broth inzit. Dit is een bouillon die de groei van micro-organismen in het bloed stimuleert. Van een volwassen persoon wordt er tussen de 20-30 mL bloed afgenomen en verdeeld over twee tot vier flessen en bij kinderen wordt 5mL bloed afgenomen en in één bloedkweek fles gedaan. In het systeem is een temperatuur van 35°C aanwezig waardoor mogelijk aanwezige micro-organismen kunnen groeien. Door de groei van micro-organismen komt er CO2 vrij wat ervoor zorgt dat de bodem van het flesje verkleurt van groen bruin naar geel. Een constante controle waarschuwt de gebruiker onmiddellijk als er een positief monster aanwezig is. Om de 10 minuten wordt het gereflecteerde licht

gemeten, bij een positief resultaat komt er een melding.[12]

2.2 Sysmex Uf-1000i flowcytometer

De Sysmex UF-1000i serie is een geavanceerde flowcytometer die o.a.gebruikt wordt om urine kweken te screenen op aanwezige deeltjes, dit kunnen cellen maar ook bacteriën zijn. Bij flowcytometrie worden de fysische kenmerken van deeltjes eerst gemeten met behulp van een laser en vervolgens geanalyseerd.

Het fluidics systeem zorgt ervoor dat de deeltjes uit het monster willekeurig verdeeld worden in een driedimensionale ruimte. In deze ruimte worden de deeltjes gemeten in een enkele stroom die voorbij de laser komt. Het fluidics systeem heeft een centrale kern waar het monster doorheen stroomt en een omhulsel waar sneller stromende vloeistof in stroomt. De snel stromende vloeistof in het omhulsel verandert de snelheid van het monster in de kern waardoor de deeltjes sneller voortbewegen. Bij optimale omstandigheden wordt het monster niet met de buitenste vloeistof gemengd. Weerkaatsing van de laser vindt plaats als een deeltje de invallende laser buigt. Hierdoor ontstaat er een scatter patroon waarbij

verschillende eigenschappen van de cel worden waargenomen. De forward scatter meet de lengte en de grootte van de deeltjes, de side scatter meet de complexiteit en interne

structuur van de deeltjes. Tijdens dit proces worden ook de conductiviteit (geleidbaarheid) en het volume van de deeltjes gemeten. Optische filters zorgen ervoor dat de weerkaatste lichtstralen door detectoren worden gemeten. Door de verschillende scatter patronen die de UF-1000i meet, kan er een plot worden gemaakt. Dit wordt weergegeven in een

kwantitatieve analyse van verschillende bestanddelen. In figuur 2 is een plot van de Sysmex UF-1000i te zien. Kwantitatieve resultaten worden verwerkt in een tabel en in een grafiek, de plot. In het BK AST-BCCM onderzoek is het aantal bacteriën het belangrijkste, die worden weergegeven als een paars vlak. Resultaten kunnen behaald worden in ongeveer één minuut per monster.[7][8]

(9)

9 Tijdens het BK AST-BCCM onderzoek wordt er gekeken naar het aantal bacteriën dat

aanwezig is in het bloed en de gevoeligheid voor antibiotica. Als de bacteriën van de positieve bloedkweek aan de antibiotica verdunningsreeks worden toegevoegd en vervolgens geïncubeerd worden, wordt er op verschillende tijdstippen gemeten. Als de bacterie ongevoelig is voor een bepaald antibioticum zal er groei waargenomen worden wat gemeten kan worden als toename van het aantal bacteriën door de UF-1000i. Als de

bacterie gevoelig is voor het antibioticum wordt deze geremd en/of gedood. Dit kan gemeten worden door de UF-1000i door het gelijk blijven- of een afname in het aantal bacteriën.

2.3 Bloed

Door het lichaam circuleert het bloed in een gesloten geheel van hart en bloedvaten, het cardiovasculaire stelsel. De hoofdfunctie is het transport van voedingsstoffen en zuurstof naar alle weefsels in het lichaam en de afvoer van kooldioxide en andere afvalproducten uit weefsels. Andere functies zijn o.a. het regelen van de lichaamstemperatuur, het evenwicht van verschillende essentiële mineralen en vloeistoffen handhaven, chemische

boodschappers als hormonen transporteren en het lichaam beschermen tegen micro-organismen en andere vreemde stoffen. Bloed bestaat voor 55% uit bloedplasma, dit is water met opgeloste eiwitten en zouten. Plasma dient als een reservoir om water aan

weefsels af te geven bij een tekort of op te nemen bij teveel aan water in weefsels. Ook zorgt het plasma voor het behouden van de vorm van bloedvaten en het reguleren van de

bloeddruk en bloedsomloop. De belangrijkste eiwitten in het plasma zijn albumine, immunoglobulinen en stollingsfactoren. Albumine zorgt ervoor dat het plasma in de

bloedvaten blijft en nietin lichaamsweefsels stroomt en het bindt aan hormonen en andere stoffen. Immunoglobulinen zijn antistoffen die het lichaam beschermen tegen bacteriën, virussen en schimmels. Stollingsfactoren zijn nodig om bloedingen te stoppen. 45% van het bloed bestaat uit rode bloedcellen die hemoglobine bevatten. Hemoglobine is een eiwit wat ervoor zorgt dat het bloed rood kleurt en zorgt voor zuurstof transport. 1% van het bloed bestaat uit witte bloedcellen en bloedplaatjes. Witte bloedcellen beschermen het lichaam tegen infecties veroorzaakt door lichaamsvreemde stoffen of micro-organismen. Er zijn verschillende typen als lymfocyten, granulocyten en monocyten met allemaal een eigen functie. Sommige witte bloedcellen stromen vrij door de bloedomloop terwijl andere tegen de bloedwand kleven of door lichaamsweefsels dringen. Bloedplaatjes klonteren samen op plaatsen waar het bloedvat beschadigd is en helpen zo bij het stollingsproces van het bloed.[18]

(10)

10

2.4 Sepsis

Bloed is normaliter steriel, door verzwakte capillaire vaatwanden en plaatselijk geopende vaten kunnen micro-organismen het bloedvatenstelsel binnendringen. Als dit bacteriën betreft, wordt dit bacteriëmie genoemd. Sepsis is een klinisch syndroom dat gekenmerkt wordt door de gehele ontstekingsreactie die in gang wordt gezet door het lichaam op een infectie in het bloed. Het is een zeer ernstige aandoening waarbij de patiënt grote kans heeft om in korte tijd te overlijden. In het verleden was er geen duidelijke definitie van een sepsis. In 1991 hebben het American College of Chest Physicians (ACCP) en de Society of Critical Care Medicine (SCCM) besloten om praktische en conceptuele definities te formuleren. Hierbij werd het begrip SIRS geïntroduceerd wat staat voor systemic inflammatory response syndrome. Er is sprake van SIRS als er aan meer dan twee van de volgende criteria wordt voldaan: temperatuur is >38°C of <36°C, hartslag hoger dan 90 per minuut,

ademhalingsfrequentie hoger dan 20 per minuut, meer dan 12.000 of minder dan 4.000 witte bloedcellen per kubieke mm of meer dan 10% staafkernige witte bloedcellen. Sepsis wordt omschreven als de combinatie van SIRS en een klinisch vastgestelde infectie. De eerste symptomen van een sepsis zijn hoge koorts en koude rillingen, de ademhaling en

hartkloppingen zijn versneld en het bewustzijn daalt. [10][28] Enzymen en toxinen die door de bacteriën als stofwisselingsproducten worden uitgescheiden in het bloed prikkelen het immuunsysteem waarna er pro-inflammatoire mediatoren worden uitgescheiden als

cytokinen en interleukinen. Door de aanwezigheid van het grote aantal bacteriën en de pro-en anti-inflammatoire mediatorpro-en in het bloed wordpro-en bloedvatpro-en verwijd, lekkpro-en vloeistoffpro-en naar weefsels en vinden er stollingsafwijkingen plaats. Zuurstof en bloed kunnen worden onttrokken uit weefsels door het hele lichaam. Dit leidt mogelijk tot cel beschadiging en een levensbedreigende situatie door de slechte doorbloeding van belangrijke organen als nieren, lever, longen en het centraal zenuwstelsel. [4][11] Een severe sepsis is een sepsis gepaard met dalende bloedstroom door een orgaan, orgaanfalen of lage bloeddruk. Tijdens een septische shock houdt de lage bloeddruk aan ondanks dat er adequaat vocht wordt toegediend.[20]

2.4.1 Pathogenen sepsis

Sepsis is grofweg in twee vormen te onderscheiden: sepsis veroorzaakt door pathogene micro-organismen bij een voorheen gezond persoon en sepsis veroorzaakt door

opportunistische micro-organismen als complicatie van ziekten, behandelingen en trauma’s. In ontwikkelde landen als Nederland vindt in de meeste gevallen sepsis plaats door

opportunistische micro-organismen.[10] Een community-acquired sepsis is een sepsis die is ontstaan buiten het ziekenhuis of andere zorginstellingen behalve bij patiënten die in de afgelopen 30-90 dagen zijn opgenomen in het ziekenhuis, in verpleeghuizen wonen of voor langere tijd intravasculair behandeld worden. Een nosocomiale sepsis is ontstaan tijdens een verblijf in het ziekenhuis of andere zorginstelling. Bij een community acquired sepsis zijn zowel Gram positieve-(stafylokokken en streptokokken) als Gram negatieve bacteriën (vooral E. coli) van belang. Sepsis veroorzaakt door de gebruikelijk minder gevoelige P. aeruginosa en Enterobacter species is minder waarschijnlijk. Bij een nosocomiale sepsis of een sepsis na een recente antibioticabehandeling is de kans dat deze door Klebsiella species is veroorzaakt groter dan bij een community-acquired sepsis. Bij een sepsis die ontstaan is tijdens een verblijf op de intensive care afdeling moet er rekening gehouden worden met multi resistente ziekenhuis pathogenen. Patiënten die voor langere tijd een intravasculaire katheter hebben of enige tijd behandeld zijn met breedspectrum antibiotica, hebben een toegenomen kans op een sepsis die veroorzaakt is door Candida species.[15] In 2008 heeft NethMap gegevens verzameld van 3872 bloedkweken van patiënten met een infectie aan de bloedbaan van zowel nosocomiale- als community acquired. De

oorspronkelijke infectiehaarden van de infectie zijn niet gespecificeerd. De meest

(11)

11 (23%), S. aureus (12%), S. pneumoniae (9%), Klebsiella species (6%) en Enterococcus species (6%), zie tabel 1 voor alle verwekkers van de bloedbaan infecties. De klinische significantie van de CNS uit de bloed isolaten is niet vermeld en hierdoor ook onduidelijk.[20] Tabel 1Etiologie van bloedbaan infectie[20]

* Geen data beschikbaar.

Patiënten van niet-geselecteerde ziekenhuisafdelingen in 2008. Infectiehaard niet meegenomen en geen onderscheid gemaakt tussen community-acquired en nosocomiaal.[20]

2.4.2. Bacteriële toxinen

Er zijn steeds meer aanwijzingen dat microbiële virulentie en het aantal bacteriën bij een bacteriëmie bijdragen aan de respons van de gastheer en het ontwikkelen van sepsis. Micro-organismen die het bloedstelsel binnendringen moeten zowel het aangeboren- als het verworven immuunsysteem doorbreken om zich succesvol te kunnen verspreiden en zo een infectie veroorzaken. Een groot deel van de schade die ontstaat tijdens een sepsis is de oorzaak van microbiële toxinen en de respons van de gastheer hierop. Er zijn veel

extracellulaire enzymen en microbiële mediatoren die bijdragen tot weefselschade tijdens een sepsis. Er bestaan drie functionele klassen van toxinen. Type 1 toxinen leiden tot schade aan de gastheer zonder de gastheercellen binnen te dringen. Het toxic shock

(12)

12 syndroom veroorzaakt door S. aureus die superantigenen produceert is hier een voorbeeld van. De ongewone type 1 toxinen staan ook wel bekend als superantigeen omdat deze CD4+ T-cellen activeren in hoeveelheden die wel 5 keer hoger zijn dan bij de activatie van CD4+ T-cellen door gewone antigenen. De superantigenen binden direct aan het major

histocompatibility complex (MHC) klasse 2 moleculen die een belangrijke rol spelen bij het herkennen van ‘eigen’ en ‘niet-eigen’ componenten in het lichaam. De superatigenen maken hierdoor een directe cross link met de T-cellen. Hoge concentraties van interleukines en monokines worden als gevolg geproduceerd en veroorzaken het toxisch shock syndroom, zie afbeelding 3.

Figuur 3 binding superantigeen aan MHC-II-molecuul en T-cel receptor[22]

Type 2 toxinen zijn directe toxinen op het membraan van bacteriën die schade brengen aan het celmembraan van de gastheer en ervoor zorgen dat de pathogenen makkelijker kunnen binnendringen en zo de cellulaire reactie verstoren. Deze groep omvat lipopolysaccharide, hemolysine en fosfolipase. Lipopolysaccharide is het belangrijkste component op het buitenste membraan van Gram negatieve bacteriën en essentieel voor de structurele integriteit (vorm) van de cel. Het is een erg belangrijk bacteriëel toxine bij de pathogenese van sepsis. Bij de kleinste hoeveelheden is dit endotoxine al schadelijk voor de gastheer ondanks dat het geen intrinsieke toxische eigenschappen van zichzelf heeft. Hemolysine beschadigt het membraan van rode bloedcellen waardoor deze gelyseerd wordt. Fosfolipase is een van de weinige aanwezige enzymen op het buitenste membraan van Gram negatieve bacteriën en is betrokken bij verstoring van membraan processen tijdens invasie bij de gastheer. Fosfolipase zorgt ervoor dat fosfolipiden gehydrolyseerd worden tot vetzuren en andere lipofiele stoffen. Type 3 toxinen zijn intracellulaire toxinen die bestaan uit een A en B component. De A subunit is verantwoordelijk voor de enzymatische activiteit van het toxine. De B subunit bindt aan specifieke receptoren op het membraan van de gastheercel en transporteert zo het enzym door het membraan. Veel voorkomende pathogenen als S. aureus, E. coli en P. aeruginosa scheiden deze enzymen uit tijdens de invasieve fase. De A/B toxinen werken samen om de cellulaire afweer en barrières te doorbreken en zich zo te verspreiden binnen de gastheer.[21][29]

(13)

13

2.4.3 Situatie in Nederland

In Nederland overlijden jaarlijks ongeveer 3500 mensen aan een sepsis. [5] M.A.W. Hermans et al hebben een cohort study uitgevoerd naar patiënten van het Maastricht Universitair Medisch Centrum met een bloedbaan infectie. Deze studie betrof 331 patiënten waarvan 66,2% een sepsis had, 29,9% een ernstige sepsis en 3,9% had een septische shock. De mortaliteit bij sepsis was 3,7%, bij ernstige sepsis 22,2% en bij een septische shock 61,5%.[26] Sterfte als gevolg van sepsis als primaire doorsoorzaak is in de periode 1980 tot 2000 meer dan verdrievoudigd. Deze forse stijging was vooral zichtbaar onder ouderen. Door demografische ontwikkelingen als dubbele vergrijzing en het steeds ouder worden van mensen, is de verwachting dat het absoluut aantal ziekenhuisopnamen met sepsis als hoofd- of nevendiagnose tussen 2000 en 2020 met 34,9% zal stijgen.[10]

Specifieke kostengegevens van 100 patiënten in een algemeen ziekenhuis lieten zien dat de dagelijkse behandelkosten €1236,- waren, dat de gemiddelde verblijfsduur van de sepsis patiënten 15,3 dagen bedroeg en de totale behandelkosten €19.509,- per patiënt waren. Als de septische patiënt nierinsufficiëntie of septische shock ontwikkelde werden de

behandelkosten aanzienlijk hoger. Voor de Nederlandse gezondheidszorg is dit een totale kostenpost van €168,6 miljoen per jaar.[28]

2.5 Empirisch antibiotica therapie

Patiënten met een sepsis zijn acuut en ergnstig ziek en worden opgenomen in het

ziekenhuis en behandeld. Patiënten met een septische shock zijn in acuut levensgevaar en moeten behandeld worden op een intensive care afdeling. Tijdens de acute fase van een sepsis is vaak niet bekend wat de infectieuze bron is en/of welke micro-organisme(n) aanwezig zijn in het bloed. Het is vaak noodzakelijk om besluiten te maken over de

antibiotica behandeling vóór dat dit bekend is. Bij patiënten met een sepsis wordt empirische antibiotica therapie gestart. Dit is het kiezen van een antibioticum dat op proefondervindelijke ervaring is gebaseerd en met behulp van klinische overwegingen wordt ingesteld. Bij een sepsis wordt er behandeld met breed spectrum antibiotica. Bij verschillende patiënten met een sepsis kan empirische therapie levens reddend zijn.[13] Vanaf het moment dat er meer informatie beschikbaar is over de infectie, wordt er in veel gevallen overgeschakeld naar een meer gerichte therapie, vaak een monotherapie. Smal spectrum monotherapie is vanuit ecologisch punt gezien beter ten opzichte van de normale flora die de mens koloniseert en beschermt. Als er gestart wordt met een breedspectrum antibioticum en deze wordt

aangehouden, is de kans groter op overgroei door gisten. Ook kan aminoglycoside die initieel gestart is al snel afgebouwd worden in concentratie zodra de meest acute fase voorbij is.[14] Doordat sepsis één van de ernstigste ziektebeelden is in de geneeskunde, is initiële antibiotica therapie bij dit ziektebeeld gerechtvaardigd. Er wordt rekening gehouden met alle te verwachte verwekkers. Het is belangrijk dat er zo snel mogelijk gestart wordt met

antibiotica toedienen nadat er tenminste twee bloedkweken zijn afgenomen. Doordat de biologische beschikbaarheid van diverse orale antibiotica als β-lactamantibiotica beperkt is en de mate van resorptie van orale antibiotica vaak onduidelijk is, wordt antimicrobiële therapie bij sepsis patiënten altijd intraveneus gegeven. In veel gevallen wordt een combinatie van een β-lactamantibioticum meteen aminoglycoside gepropageerd. Dit is wegens het brede spectrum en een synergistisch effect. Ondanks dat data van in vitro- en dierproef studies de potentie van de synergistische combinatie van aminoglycoside en β-lactamantibiotica laten zien, bestaat over de urgentie van combinatietherapie bij sepsis geen overeenstemming. Monotherapie met een aminoglycoside werkt in veel gevallen niet.

Stichting Werkgroep Antibiotica Beleid (SWAB) is wel vóór het toedienen van

aminoglycosiden bij een sepsis vanwege de snelle bactericide werking en de verbreding van het spectrum. In figuur 4 is een stroomdiagram te zien voor volwassen patiënten met een sepsis waarbij de focus nog niet bekend is. De antibiotica adviezen die staan opgesteld zijn naar afnemende voorkeur gerangschikt.[15]

(14)

14 Figuur 4 Stroomdiagram opgesteld door stichting SWAB [15]

2.6 Cefalosporine

Door de grote effectiviteit en veiligheid van cefalosporinen bleken dit belangrijke middelen bij de behandeling van sepsis. Doordat deze diverse werkingsspectra hebben bij verschillende generaties, is het mogelijk om een keuze te maken aan de hand van de situtie. De

cefalosporines omvatten een groep β-lactam antibiotica die structureel en farmacologisch gerelateerd zijn aan penicillines. De structuur van deze antibiotica bestaat uit een β-lactam ring bevestigd aan een dihydrothiazoline ring. Het toevoegen of veranderen van chemische groepen zorgt voor verschillende farmacologische eigenschappen en antimicrobiële activiteit. Ook het werkingsmechanisme van cefalosporines is gelijk aan die van penicillines. In de celwand van Gram positieve bacteriën bindt het enzym transpeptidase aan D-alanine en zorgt voor de stevige crossed-linked verbindingen tussen de zuurresten in aangrenzende koolhydraatketens in de peptidoglycaanlaag. Doordat de structuur van β-lactam antibiotica veel lijkt veel op structuur van D-alanine, binden de transpeptidase enzymen aan het β-lactam antibioticum. Hierdoor is de synthese van peptidoglycaan niet meer mogelijk wat resulteert in een verzwakte, zelfafbrekende celwand. Uiteindelijk wordt de osmotische druk van de cel verhoogd waardoor de cel lyseert. Ook worden autolytische enzymen in de celwand geactiveerd. Cefalosporines zijn verdeeld in vijf generaties op basis van de

antibacteriële werking. De 1e tot en met de 4egeneratie zijn van belang bij een sepsis. De 1e generatie is vooral werkzaam tegen Gram positieve bacteriën als streptokokken en

stafylokokken, ook de β-lactamase producerende stammen. Ze zijn meestal niet of nauwelijks werkzaam tegen β-lactamase producerende Gram negatieve bacteriën. P. aeruginosa is zelfs helemaal ongevoelig voor 1egeneratie cefalosporine. De 2e generatie werkt beter tegen Gram negatieve bacteriën als Enterobacteriaceae species dan de 1e generatie. De 3e generatie werkt minder goed tegen stafylokokken dan antibiotica uit de 2e en 1e generatie. Echter werkt deze generatie wel beter tegen Gram negatieve bacteriën dan de vorige generaties. Ook is de 3e generatie ongevoelig voor β-lactamasen. Niet alle

cefalosporine passen binnen deze drie generaties en zijn daarom een uitzondering op de algemene karakterisering, sommige worden geplaatst in de 4e en 5e generatie zoals cefepime. [16][19] Voor community-acquired sepsis wordt er vaak gekozen voor 1e- en

(15)

2e-15 generatie cefalosporinen in combinatie met een aminoglycoside en bij nosocomiale sepsis wordt er gekozen voor 3e- en 4e-generatie cefalosporinen.[15]

2.6.1 Cefuroxime

In het BK AST-BCCM onderzoek wordt voor Gram negatieve staven cefuroxime getest, een 2egeneratie cefalosporine. Dit antibioticum is bactericide en heeft een breed spectrum tegen zowel Gram positieve- als Gram negatieve bacteriën. Als tegelijkertijd een aminoglycoside wordt gebruikt kan er een synergistisch effect optreden. Dit antibioticum is meegenomen tijdens het onderzoek omdat dit volgens SWAB guidelinesforantimicrobialtherapy of adult patientswith sepsis en PAMM blauw wordt voorgeschreven bij een sepsis [16][20]

2.6.2 Resistentie mechanismen cefalosporine

Resistentie tegen deze groep antibiotica kan het gevolg zijn door afbraak van het

antibioticum door lactamase enzymen of door de productie van een alternatief target. β-lactamase enzymen zijn in staat om de β-lactam ring van penicillines, cefalosporines en monobactams te hydrolyseren waardoor de ring geopend wordt. Er ontstaat penicilloïnezuur waardoor het niet meer functioneel is als een substraat voor een penicilline bindend eiwit (PBP) en nutteloos is als antibiotica. Dit enzym wordt uitgescheiden in het periplasma zodat er ingewerkt kan worden op de β-lactam antibiotica voordat deze de PBP’s kunnen bereiken in het cytoplasmamembraan. Één β-lactamase molecuul kan 103 penicilline moleculen hydrolyseren per seconde. De genen die coderen voor deze enzymen zijn aanwezig op plasmiden en op transposons waardoor verspreiding naar andere soorten bacteriën mogelijk wordt. Een transposon is een stukje DNA op een chromosoom welke van plaats kan

verwisselen. Er zijn meer dan 200 soorten β-lactamases beschreven. Cefuroxim kan

gehydrolyseerd worden door ESBL enzymen en door het chromosomaal gecodeerde AmpC enzym.[24] Bacteriën kunnen zich beschermen tegen antibiotica door een alternatief target te produceren (meestal een enzym) dat niet gevoelig is voor de inwerking voor het antibioticum terwijl het originele, gevoelige target nog steeds geproduceerd wordt. Deze bacteriën zijn door deze selectie in staat om te overleven. Het bekendste voorbeeld van dit mechanisme is waarschijnlijk het PBP2a dat geproduceerd wordt naast de ‘normale’ PBP’s die

geproduceerd worden doorMethicilline Resistente Staphylococcus aureus (MRSA). PBP2a wordt gecodeerd door het mecA gen en wordt niet geremd, hierdoor blijft de structuur van de cel behouden doordat de peptidoglycaanlaag gesynthetiseerd kan worden.[25] Sommige stammen van M. morganii, E. cloacae, en Citrobacter species vertonen resistentie tegen cefuroxime en andere cefalosporine. Pseudomonas en Campylobacter species, de meeste Serratia species en P. vulgaris zijn resistent voor de meeste 1e en 2e generatie

cefalosporine.[27]

2.7 Aminoglycoside.

Alle aminoglycosiden bestaan uit verbindingen van aminosuikers (aminohexosen) met een aminocyclitolring. De antibiotica binnen deze groep werken in op de eiwitsynthese van de bacterie. Hierbij wordt als target de ribosomen gebruikt. De ribosomen van bacteriën bestaan uit twee subunits, de 30s- en 50s- subunit. Als het antibioticum bindt aan de 30S subunit wordt het anticodon van het mRNA niet of verkeerd gelezen. Als het antibioticum bindt aan de 50S subunit ontstaat er een blokkade van de translocatie van het tRNA. Aminozuren worden hierdoor tot niet functionele eiwitten gesynthetiseerd of zelfs helemaal niet

gesynthetiseerd. Gentamicine behoort tot de aminoglycoside en verstoort de eiwitsynthese van de bacterie. [17]

2.7.1 Gentamicine

Gentamicine heeft een bactericide werking tegen zowel Gram positieve als Gram negatieve bacteriën. Gentamicine is in staat om op ribosomaal niveau de eiwitsynthese te verstoren

(16)

16 door te binden aan het 30S ribosomalesubunit wat de structuur van het RNA-ribosoom complex verstoort. Dit leidt tot een verkeerde interpretatie van het stop codon waardoor er niet wordt gestopt met het synthetiseren van eiwitten. Gentamicine wordt niet geresorbeerd in het maag-darm slijmvlies waardoor dit antibioticum alleen intraveneus wordt toegediend. Om deze reden wordt dit antibioticum alleen voorgeschreven in gevallen van ernstige infecties bij patiënten die zijn opgenomen. Het antibioticum heeft toxische eigenschappen, het is in staat het nierweefsel en de gehoorzenuw te beschadigen. Om deze reden wordt gentamicine toegediend onder een zogenaamde bloedspiegelcontrole zodat voorkomen kan worden dat de concentratie in het serum, en dus ook in de weefsels, te hoog wordt. Bij voorkeur wordt alleen de eerste drie dagen van de septische periode dit middel

voorgeschreven. Er is aangetoond dat een eenmaal daagse dosering van aminoglycosiden even effectief is maar minder nefrotoxisch dan twee- of driemaal daagse dosering.

Gentamicine wordt onder andere gebruikt bij combinatietherapie om sepsis te bestrijden door de brede, snelle en bactericide werking en door de kleine kans op resistentie, zie paragraaf 2.7.2. Dit antibioticum wordt gebruikt voor het BK AST-BCCM onderzoek.[17][20]

2.7.2 Resistentie mechanismen aminoglycosiden

Er zijn verschillende mechanismen die zorgen voor resistentie tegen aminoglycosiden . Er kan een verminderde opname plaatsvinden, de ribosomale bindingsplaats kan veranderd worden en er kunnen enzymen geproduceerd worden die zorgen voor inactivatie van het antibioticum. Verminderde opname van het antibioticum wordt meestal gezien in

Pseudomonas species en andere niet-fermenterende Gram negatieve bacteriën. Dit

resulteert in een beperkte mate van resistentie, intermediaire gevoeligheid. Het veranderen van de ribosomale bindingsplaats vindt voornamelijk plaats tegen streptomycine. Dit komt doordat streptomycine op één specifieke plaats bindt aan de 30S subunit van het ribosoom. Resistentie tegen andere aminoglycoside op deze manier is ongebruikelijk omdat deze antibiotica aan meerdere plaatsen van het ribosoom kunnen binden. Enzymatische modificatie is de meest voorkomende vorm van aminoglycoside resistentie. Enzymen die hiertoe behoren zijn N-acetyltransferasen (AAC) die acetyl-co-enzym A gebruiken als donor en de aminofuncties verstoren. O-nucleotidyltransferases (ANT) en O-phosphotransferases (APH) gebruiken ATP als donor en verstoren de hydroxyl functies. Deze enzymen zijn gecodeerd op plasmiden en transposons, uitwisseling en verspreiding kan plaats vinden binnen een groot aantal bacterie soorten. Resistentie tegen aminoglycoside door deze enzymen in Gram negatieve bacteriën worden vaak gecodeerd door meerdere genen.[23]

2.8 Traditionele methode gevoeligheid bloedkweken

Zodra de werkdag begint worden positieve bloedkweek flessen uit de BacT/ALERT gehaald en wordt er onder andere een Gram kleuring gemaakt om de morfologie van het micro-organisme te kunnen omschrijven. Van Gram negatieve staven wordt een spotje gemaakt. Hierbij wordt er met een 10 µL öse bloed uitgestreken in de vorm van een rondje op een bloedplaat die vervolgens in een CO2 stoof wordt gezet. Het doel hiervan dat de stam na een paar uur zal groeien en zo dezelfde dag een gevoeligheid en/of determinatie uitgevoerd kan worden. Na gemiddeld 5 uur is er bij Gram negatieve staven genoeg groei om de vervolgtesten uit te voeren. Na gemiddeld 8 uur is de gevoeligheid bekend door middel van de VITEK 2 BioMérieux bekend. Het opkweken van de Gram negatieve staaf en het

verkrijgen van de gevoeligheid neemt een totaal van gemiddeld 13 uur in beslag. Ook van stafylokokken wordt een spotje gemaakt. Stafylokokken groeien langzamer dan Gram negatieve staven, het duurt gemiddeld 7 uur voordat er genoeg groei is om vervolgtesten uit te voeren. Er wordt pas een gevoeligheid ingezet als er minimaal twee bloedkweken positief zijn. Bij stafylokokken is na gemiddeld 8 uur de gevoeligheid bekend. Het opkweken van stafylokokken en het verkrijgen van de gevoeligheid neemt in totaal gemiddeld 15 uur in beslag.[6]

(17)

17

3. Methode en materialen

3.1 Bacteriën en antibiotica

Voor het BK AST-BCCM project zijn positieve bloedkweken gebruikt die door middel van deBacT/ALERT 3D Dual-T positief waren bevonden en met een Gram kleuring bevestigd zijn dat er bacteriën in zaten. Er is onderzoek gedaan naar stafylokokken en Gram negatieve staven. Voor stafylokokken zijn gentamicine en oxacilline getest en voor Gram negatieve staven gentamicine en cefuroxime. Per dag werd er één positieve bloedkweek ( één stafylokok of één Gram negatieve staaf ) getest op één antibioticum in verschillende concentraties.

3.2 Aantal bacteriën per µL volgens UF-1000i

Van de positieve bloedkweek werd in de flowkast ongeveer 4 mL bloed overgebracht naar een centrifugebuis die 5 minuten werd afgedraaid bij 1000 RPM. Van de bovenstaande vloeistof werd een verdunning in MH broth gemaakt tot 1:100 voor stafylokokken en tot 1:1000 voor Gram negatieve staven. Dit is gedaan door 500 µL bovenstaande vloeistof over te brengen naar een reageerbuis met 4500 µL MH broth (1:10). Van de 1:10 verdunning is na vortexen500 µL overgebracht naar 4500 µL MH broth (1:100) enz. Vervolgens is met de UF-1000i het aantal bacteriën gemeten van de grootste verdunning zodat terug gerekend kon worden hoeveel bacteriën er per µL aanwezig waren in de positieve bloedkweek.

3.3 Uitverdelen naar concentraties en tijdreeksen

Opnieuw werd van de positieve bloedkweek in de flowkast bloed overgebracht naar een centrifugebuis om uiteindelijk het afgedraaide bloed te verdelen naar de antibiotica reeks. Aan de hand van het aantal bacteriën per µL bloed werd bepaald of er vóór het

uitverdelennaar de antibiotica reekseen verdunning gemaakt moest worden. De begin waarde (t0) van het aantal bacteriën in de antibioticareeks moest voor een betrouwbare meting met de UF-1000i minimaal 300 /µL zijn. Naar elke concentratie van de antibiotica reeks (Mueller Hinton Bouillon met antibiotica) en naar de positieve controle (Mueller Hinton Bouillon) werd 1 mL van de (verdunde) bovenstaande vloeistof van de positieve bloedkweek overgebracht. Elke antibiotica concentratie, positieve en negatieve controle werd uitverdeeld naar verschillende reageerbuizen voor de verschillende tijdreeksen. Als er werd gemeten op de tijdstippen t0, t30, t60, t90, t120 en t180 werden alle antibiotica concentraties en controles uitverdeeld over 6 reageerbuizen. Nadat de antibiotica reeks en de controles waren

uitverdeeld over de verschillende tijdsreeksen, werden de reageerbuizen in een koelbox met koelelementen gezet. Alle tijdreeksen werden in een stoof van 37°C ± 1°C gezet, t0 werd meteen gemeten met de UF-1000i. t30 werd na 30 minuten uit de stoof gehaald, gevortexed en gemeten met de UF-1000i. t60 werd na 60 minuten uit de stoof gehaald, gevortexed en gemeten met de UF-1000i enz.

3.4 Data analyse en interpretatie van MIC waarden

Van alle positieve bloedkweken is de gevoeligheid bepaald door middel van drie gouden standaarden, de referentiemethoden (REF);VITEK2Biomérieux, e-test en bouillon macro dilutie. MIC waarden verkregen met de bovenstaande methoden zijningedeeld volgens de breekpunten van EUCAST als gevoelig (S), intermediair (I) of resistent (R), zie tabel 2.

(18)

18 Tabel 2 interpretatie tabel MIC waarden volgens EUCAST

Antibiotica Antibiotica concentratie in mcg/mL

S I R Enterobacteriaceae Cefuroxime ≤ 8 >8 Gentamicine ≤ 2 4 >4 P. aeruginosa Cefuroxime -1 -1 Gentamicine ≤ 4 > 4 Stafylokokken Gentamicine ≤ 1 > 1 CNS Oxacilline ≤ 0,25 >0,25 S. aureus Oxacilline ≤2 > 2 1 : intrinsiek resistent

MIC waarden verkregen met de nieuwe methode BK AST-BCCM (TEST) zijn vergeleken met REF.Om de metingen van een bloedkweek te kunnen interpreteren moet er een cut off opgesteld worden zodat alle grafieken op dezelfde manier worden afgelezen. Er zijn

verschillende cut off’s opgesteld om te kijken bij welke de grootste match is met de referentie methoden, zie figuur 5. Bij de drie opgestelde cut off’s is gekeken of de precieze MIC

bepaling van TEST overeen kwam met REF en of de SIR interpretatie volgens TEST overeenkwam met REF.

Definitie cut off:

A. Binnen één tijdsreeks is een meting lager t.o.v. de positieve controle

B. Binnen één tijdsreeks is een meting lager dan de concentratie van één dilutie lager C. Binnen één concentratie is er bij het volgende tijdsstipmaximaal 10% groei of afname.

Figuur 5 Verschillende cut off's

Bij elke gouden standaard is gekeken wat de optimale cut off is. Als voorbeeld is er met cut off A bij elk monster bij t30 gekeken bij welke concentratie er voor het eerste 10%, 20%, 30% etcreductie was t.o.v. de PC. Vervolgens is er gekeken wanneer er bij t60 voor het eerst 10%, 20%, 30% etcreductie was t.o.v. de PC enz. Door alle correcte matches op te tellen ontstaat er uiteindelijk een optimale cut off bij elke gouden standaard. Bijvoorbeeld; cut off A, 70% reductie t.o.v. de positieve controle.

Er zijn standaard criteria gebruikt om de BK AST-BCCM methode te vergelijken met de referentie methoden. Er is gewerkt volgens ‘Guidance for Industryand FDA, Class II Special Controls Guidance Document: Antimicrobial Susceptibility Test (AST) Systems.[33]’ In tabel 3 en 4 is te zien met welke standaard criteria er is gewerkt. De 2 belangrijkste criteria waar naar is gekeken zijn de essential agreement en de categorial agreement. De essential agreement wordt gebruikt om de MIC te bepalen en de categorial agreement wordt gebruikt

(19)

19 om S-I-R te interpreteren. MIC waarden die buiten deessential agreement vallen en

verkeerde S-I-R interpretaties bij de categorial agreement zijn fouten, of terwijl discrepanties. Bij de categorial agreement zijn de discrepanties te verdelen in minor-, major- en very major errors.

Essential agreement ( MIC bepaling )

Tabel 3Essential agreement en discrepantievolgens U.S. Food and Drug Administration[33]

Definitie Aanvaardbaar (%)

Essential agreement (EA)

De MIC waarde volgens TEST is gelijk aan of scheelt ±1

verdunning met REF.

Gebruikt voor de MIC bepaling

≥ 90

Discrepancy De MIC waarde volgens TEST wijkt ±2 verdunningen met REF

-

Categorial agreement ( S-I-R interpretatie )

Tabel 4Categorial agreement en verschillende discrepanties volgens U.S. Food and Drug Administration[33]

Definitie

_{Aanvaardbaar (%)}

Categorial agreement (CA)

De interpretatie van de MIC waarde volgens TEST is gelijk aan REF. Gebruikt voor de S-I-R interpretatie

≥ 90

Discrepancy De interpretatie van de MIC waarde volgens TEST is anders dan REF. Deze discrepanties zijn te verdelen in minor-, marjor- en very major errors.

-

Minor error REF is R of S en TEST is I Of

REF is I en TEST is S of R. minor discrepanties / totaal aantal organismen getest X 100%

≤ 10

Major error REF is S en TEST is R.

Major discrepanties / totaal aantal gevoelige organismen volgens REF X 100%

≤ 3

Very major error REF is R en TEST is S.

Very major discrepanties / totaal aantal resistente organismen volgens REF X 100%

(20)

20

4. Resultaten

Er zijn 9 stafylokokken ( 5CNS, 4 S. aureus ) en 51 Gram negatieve staven( 41 E. coli, 2 K. oxytoca, 2 K. pneumoniae, 2 P. aeruginosa, 2 P. mirabilis, 1 C. murliniae, 1 E. cloacae) geïsoleerd uit 59 positieve bloedkweken. Uit één positieve bloedkweek zijn twee soorten Gram negatieve staven geïsoleerd waarbij de hoogste MIC waarde is meegenomen. Stafylokokken gaven veel onbetrouwbare resultaten tijdens het meten met de UF-1000i en zijn daarom niet verder gemeten en meegenomen in het onderzoek.

In hoofdstuk 4.1 wordt een voorbeeld meting van één positieve bloedkweek uitgewerkt die ook mee is genomen tijdens het onderzoek, in hoofdstuk 4.2 wordt de BK AST-BCCM vergeleken met de macro dilutie als gouden standaard, in hoofdstuk 4.3 wordt de BK BCCM vergeleken met de VITEK als gouden standaard, in hoofdstuk 4.4 wordt de BK AST-BCCM vergeleken met de e-test als gouden standaard, in hoofdstuk 4.5 worden de meest optimale cut off waarden voor essential- en categorial agreement besproken met de

bijbehorende gouden standaard en in hoofdstuk 5.6 wordt de klassieke methode met de BK AST-BCCM methode vergeleken.

(21)

21

4.1 Meting positieve bloedkweek

Figuur 6, 7 en 8 laten de meting van een positeve bloedkweek met E. coli zien, waarbij de gevoeligheid getest is voor cefuroxime. De macro dilutie gaf een MIC van 8, VITEK gaf MIC 4 en de e-test gaf MIC 3.

In figuur 6 is te zien hoeveel bacteriën aanwezig waren bij alle concentraties cefuroxime, de positieve (PC) en de negatieve controle (NC) op t0. Het meest optimale zou zijn dat er op t0 bij elke concentratie precies evenveel bacteriën aanwezig zijn.

Figuur 6Positieve bloedkweek met E.coligemeten met de Sysmex UF-1000i , gevoeligheid gemeten voor cefuroxime. Aantal bacteriën/µL op t0.

In figuur 7 is te zien dat het aantal bacteriën bij alle concentraties cefuroxime op t30

ongeveer gelijk is. Bij t60 is het aantal bacteriën bij [0,25] en [0,5] cefuroxime en PC net iets hoger dan de concentraties [1] t/m [16]. Ook is te zien dat het aantal bacteriën bij [0,25], [0,5] en PC op t60 t.o.v. t30 meer gegroeid zijn dan bij de overige concentraties.

Figuur 7 Positieve bloedkweek met E.coligemeten met de Sysmex UF-1000i, gevoeligheid gemeten voor cefuroxime. Aantal bacteriën/µL op t0, t30 en t60.

0 50 100 150 200 250 300 0,25 0,5 1 2 4 8 16 PC NC

B

a

cte

ri

ë

n

/µ

L

Cefuroxime concentratie in mcg/mL

E. coli, cefuroxime

MD: 8

Vitek: 4

E-test: 3

t0

0 500 1000 1500 2000 2500 0,25 0,5 1 2 4 8 16 PC NC

B

a

cte

ri

ë

n

/µ

L

Cefuroxime concentratie in mcg/mL

E. coli, cefuroxime

MD: 8

Vitek: 4

E-test: 3

t0

t30

t60

(22)

22 In figuur 8 is te zien dat op t120 vanaf [1] het aantal bacteriën lager wordt. Bij [2] zijn de bacteriën nog wel in staat om te groeien, maar niet zo snel als bij [0,25], [0,5] en [1]. De bacteriën worden geremd in groei. Bij [4] is te zien dat het aantal bacteriën op t120 lager is dan op t90, de bacteriën zijn niet in staat om te groeien.

Figuur 8 Positieve bloedkweek met E.coligemeten met de Sysmex UF-1000i, gevoeligheid gemeten voor cefuroxime. Aantal bacteriën/µL op t0, t30, t60, t90 en t120.

0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000 0,25 0,5 1 2 4 8 16 PC NC

B

a

cte

ri

ë

n

/µ

L

Cefuroxime

concentratie

in mcg/mL

E. coli, cefuroxime

MD: 8

Vitek: 4

E-test: 3

t0

t30

t60

t90

t120

(23)

23 In hoofdstuk 4.2, 4.3 en 4.4 worden de 50 positieve bloedkweken met Gram negatieve staven vergeleken met de drie gouden standaarden als referentie methoden. Hierbij is gekeken naar de essential agreement en categorial agreement.

In figuur 9, 11 en 13 is te zien wat de optimale cut off waarden zijn bij de verschillende definities A, B en C om een MIC bepaling uit te voeren. Hieruit komt een percentage correct bepaalde MIC waarden volgens de BK AST-BCCM methode, essential agreement.

In figuur 10, 12 en 14 is te zien wat de optimale cut off waarden zijn bij de verschillende definities A, B en C om S-I-R te interpreteren. Met deze cut off waarden is de categorial agreement berekend met daarbij de discrepanties onderverdeeld in minor-, major- en very major errors.

(24)

24

4.2.Macro dilutie

Van 50 positieve bloedkweken is de MIC bepaald met de macro dilutie. Deze methode gaf 36 gevoelige-, 1 intermediaire- en 13 resistente Gram negatieve staven.

4.2.1Essential agreement (MIC bepaling)

In figuur 9 is te zien dat de essential agreementmet de macro dilutie als referentie methode het hoogst is bij cut off A met 80 % waarbij er na 120 minuten ten minste 80% reductie moet zijn t.o.v. de positieve controle.

Figuur 9 Optimale cut off en essential agreement en van BK AST-BCCM methode met de macro dilutie als referentiemethode

Cut off A Cut off B Cut off C t120 -80% t90 -30% t90 < 10% groei Reeks1 80% 54% 78% 0% 20% 40% 60% 80% 100% E ssent ial agreem ent

Essential agreement met macro dilution

als referentie

(25)

25

4.2.2Categorial agreement ( S-I-R interpretatie )

In figuur 10 is te zien dat de categorial agreement met de macro dilutie als referentie methode het hoogst is bij cut off A met 86 % waarbij er na 120 minuten ten minste 70% reductie moet zijn t.o.v. de positieve controle. Het aantal minor errors is hierbij 2% en het aantal very major errors is hierbij 46%.

Figuur 10 Optimale cut off en categorial agreement met discrepanties van BK AST-BCCM methode met de macro dilutie als referentiemethode

Cut off A Cut off B Cut off C t120 -70% t90 -20% t120 < 10%

groei

Categorial agreement 86% 80% 84%

Minor error 2% 4% 4%

Major error 0% 0% 0%

Very major error 46% 62% 54%

0% 20% 40% 60% 80% 100% Cate go ri al ag ree m en t

Categorial agreement met macro dilution

als referentie

(26)

26

4.3 VITEK

Van 50 positieve bloedkweken is een VITEK ingezet waarvan er 49 resultaat gaven. Er was een P. aeruginosa waarvan de gevoeligheid is getest van cefuroxime. Deze wordt niet uitgevoerd door de VITEK omdat P. aeruginosa intrinsiek resistent is voor cefuroxime. Deze methode gaf 41 gevoelige- en 8 resistente Gram negatieve staven.

4.3.1Essential agreement (MIC bepaling)

In figuur 11 is te zien dat de essential agreement met de VITEK als referentie methode het hoogst is bij cut off C met 98 % waarbij er na 120 minuten maximaal 10% groei mag zijn binnen één concentratie.

Figuur 11 Optimale cut off en essential agreement en van BK AST-BCCM methode met de VITEK als referentiemethode

Essential agreement met VITEK als

referentie

(27)

27

4.3.2Categorial agreement ( S-I-R interpretatie )

In figuur 12 is te zien dat de categorial agreement met de VITEK als referentie methode het hoogst is bij cut off A met 92 % waarbij er na 120 minuten ten minste 70% reductie moet zijn t.o.v. de positieve controle. Het aantal major errors is hierbij 3% en het aantal very major errors is hierbij 38%.

Figuur 12 Optimale cut off en categorial agreement met discrepanties van BK AST-BCCM met de VITEK als referentiemethode

groei

Categorial agreement met VITEK als

referentie

(28)

28

4.4 E-test

Van 50 positieve bloedkweken is de MIC bepaald met de e-test. Deze methode gaf 42 gevoelige- en 8 resistente Gram negatieve staven.

4.4.1Essential agreement (MIC bepaling)

In figuur 13 is te zien dat de essential agreementmet de e-test als referentie methode het hoogst is bij cut off A en B met 96 %. Er moet bij cut off A na 120 minuten ten minste 50 % reductie zijn t.o.v. de PC en bij cut off B moet er na 120 minuten ten minste 40% reductie zijn t.o.v. de concentratie één dilutie lager.

Figuur 13 Optimale cut off en essential agreement en van BK AST-BCCM methode met de e-test als referentiemethode

Essential agreement met e-test als

referentie

(29)

29

4.4.2Categorial agreement ( S-I-R interpretatie )

In figuur 14 is te zien dat de categorial agreement met de e-test als referentie methode het hoogst is bij cut off C met 96 % waarbij er na 120 minuten maximaal 10% groei mag zijn binnen één concentratie. Het aantal very major errors hierbij is25%.

Figuur 14 Optimale cut off en categorial agreement met discrepanties van BK AST-BCCM methode met de e-test als referentiemethode

groei

Categorial agreement met e-test als

referentie

(30)

30

4.5 Optimale cut off voor essential agreement en categorial agreement

Essential agreement: definitie C, t120 ≤ 10% groei, VITEK

Binnen één concentratie bij het volgende tijdsstip is er maximaal 10% groei of afname bij t120 vergeleken met de VITEK.

Essential agreement: 98%

Volgens U.S. Food and Drug Administration aanvaardbaar. Essential agreement is hoger dan 90%.[33]

Categorial agreement: definitie C, t120 ≤ 10% groei, e-test

Binnen één concentratie bij het volgende tijdsstip is er maximaal 10% groei of afname bij t120 vergeleken met de e-test.

Categorial agreement: 96%. Minor error: 0%, major error: 0% en very major error: 25% Volgens U.S. Food and Drug Administration niet aanvaardbaar. Het aantal very major errors is hoger dan 1,5% [33]

(31)

31

4.6 Klassieke methode VS. BK AST-BCCM methode essential agreement

Voor de essential agreement van positieve bloedkweken met Gram negatieve staven met de BK AST-BCCM methode is aanvaardbaar volgens U.S. Food and Drug Administration. [33] In tabel 14 staat weergegeven hoeveel tijd de klassieke methode en de BK AST-BCCM methode in beslag nemen voor de essential agreement en wat de reductie in tijd tussen deze twee methoden.

Tabel 5 Vergelijking van time-to-result voor de MIC bepaling tussen VITEK en BK AST-BCCM

Stam Aantal stammen Gemiddelde tijd van groei bacterie ( h:min ) VITEK gemiddelde tijd ( h:min ) Totale tijd nodig voor groei en gevoeligheid VITEK ( h:min ) BK AST-BCCM methode ( h:min ) Reductie in tijd (%) E. coli 41 5:00 8:20 13:20 2:00 -85 K. pneumonia e 2 5:00 8:45 13:45 2:00 -85 K. oxytoca 2 5:00 8:53 13:53 2:00 -86 P. mirabilis 2 5:00 10:00 15:00 2:00 -87 P. aeruginosa 2 5:00 12:381 17:38 2:00 -89 E. cloacae 1 5:00 9:15 14:15 2:00 -86 C. murliniae 1 5:00 13:15 18:15 2:00 -89

1_{: P. aeruginosa intrinsiek resistent voor cefuroxime. MIC cefuroxime hierdoor niet} beschikbaar ondanks dat er wel is gemeten door de VITEK.

(32)

32

5. Conclusie

De BK AST-BCCM methode heeft potentie als snelle methode voor de gevoeligheidsbepaling van positieve bloedkweken maar is niet betrouwbaar.

Essential agreement van Gram negatieve staven uit positieve bloedkweken d.m.v. BK AST-BCCM mag volgens standard performance criteria geaccepteerd worden.[33] Voor de essential agreement van Gram negatieve staven uit positieve bloedkweken

gaf cut off C het beste resultaat met VITEK als referentie methode. Er wordt afgelezen bij t120 waarbij binnen één concentratie bij het volgende tijdsstip er maximaal 10% groei is of afname in het aantal bacteriën.

Essential agreement van Gram negatieve staven uit positieve bloedkweken met de BK AST-BCCM methode vergeleken met de klassieke methode gaf een reductie tussen de 85-89% in tijd

Categorial agreement van Gram negatieve staven uit positieve bloedkweken d.m.v. BK AST-BCCM mag volgens standard performance criteria niet geaccepteerd worden.[33]

Voor de categorial agreement van Gram negatieve stavenuit positieve bloedkweken gaf cut off C het beste resultaat met de e-test als referentie methode. Er wordt afgelezen bij t120 waarbij binnen één concentratie bij het volgende tijdsstip er maximaal 10% groei is of afname in het aantal bacteriën.

De BK AST-BCCM methode blijkt niet in staat te zijn om een correcte categorial agreement uit te voeren bij bacteriën als Citrobacter- en Enterobacterspp, zie discussie.

VITEK en de e-test als gouden standaarden gaven het beste resultaat als referentie methoden.

Het is niet gelukt om stafylokokken betrouwbaar volgens BK AST-BCCM te meten. Stafylokokkken liggen in klusters waardoor de UF-1000i deze in veel gevallen verkeerd classificeert als rode bloedcellen, gisten en/of spermacellen.

(33)

33

6. Discussie

Voordat het onderzoek gestart werd, is gesteld om stafylokokken en Gram negatieve staven uit positieve bloedkweken te meten. Met de stafylokokken zijn verschillende problemen opgetreden. In totaal zijn er 9 stafylokokken gemeten waarvan 5 CNS en 4S. aureus. Bij 5 stafylokokken (4 CNS, 1 S, aureus) waren er problemen met de positieve controle. Deze groeide niet, nauwelijks of pas na minstens 120 minuten. Verwacht werd dat de positieve controle goed zou groeien omdat de stafylokokken uit de bloedkweek in de exponentiële fase zitten, in een rijk medium én bij een optimale temperatuur van 37°C geïncubeerd worden. Het kan lijken dat de stafylokokken gevoelig zijn voor het antibioticum waar op getest wordt terwijl dit niet zo hoeft te zijn omdat de positieve controle niet groeit, hierdoor zijn de andere metingen bij de bloedkweek minder betrouwbaar.

Nadat bloedkweken verdeeld waren over de antibiotica- en tijdsreeksen, werden de monsters meteen in een koelbox op koelelementen gezet. Deze stap is na vier gemeten stafylokokken weggelaten bij deze groep. Christof von Eiff et al [30] laat zien dat coagulase negatieve stafylokokken moeilijke groeiers zijn. Er werd gedacht dat door de monsters op ijs te zetten, de stafylokokken een te grote klap zouden krijgen en zo moeite hadden om te profileren. Echter, bij de 5 stafylokokken die na deze stap werden gemeten, zijn bij 2 CNS nog steeds problemen ondervonden met de positieve controle.

Naast problemen met de positieve controle bij stafylokokken zijn er nog andere problemen opgetreden. Bij 8 van de 9 stafylokokken (5 CNS, 3 S. aureus) zijn de resultaten

onbetrouwbaar omdat er gisten, abnormale rode bloedcellen en sperma cellen zijn gemeten. Bij 7 stafylokokken zijn er gisten gemeten door de UF-1000i, het is onwaarschijnlijk dat deze daadwerkelijk in de bloedkweek zaten. De gisten zijn niet gezien in het Gram preparaat, zijn niet gekweekt tijdens het onderzoek en zijn ook niet door de analisten op het bacteriologisch lab gekweekt die met de bloedkweken gewerkt hebben. De gemiddelde grootte van één losliggende kok is 0,5 – 1 µm, doordat stafylokokken in groepjes liggen kan de totale grootte van één trosje variëren tussen de 1 en 8 µm. De grootte van een gist is gemiddeld 5-10 µm. Één stafylokok kan net zo groot zijn als één gist cel. Het kan zijn dat stafylokokken zijn gemeten als één grote cel door de UF-1000i en hierdoor zijn geclassificeerd als gisten.[31] Niet alleen de grootte van de stafylokokken lijken op die van gisten, ook de celwand van beide micro-organismen is Gram positief. De UF-1000i kan de celwand van de stafylokokken mogelijk in combinatie met de grootte van de cellen, niet/moeilijk onderscheiden van gisten. Bij 6 stafylokokken werden er abnormale rode bloedcellen gemeten. Zo was bij een S. epidermidis bij t0 [0,125] gentamicine het aantal abnormale RBC 22,7 /µL en bij dezelfde concentratie maar bij t180 het aantal abnormale rode bloedcellen (RBC) 700,4/µL. Deze twee monsters zijn uitverdeeld vanuit één flesje MH bouillon met antibiotica en bacteriën. Er kan variatie zitten in het aantal RBC/µL, maar een verschil van 677,7 /µL is onwaarschijnlijk. Een rode bloedcel heeft een gemiddelde grootte van 7-8 µm. Mogelijk is hier dezelfde verklaring als bij de gisten die zijn gemeten. Normaal gesproken liggen rode bloedcellen tegen de Y-as in het plot. Bij alle 6 de stafylokokken waar abnormale RBC gemeten zijn, lag een gedeelte van de RBC tegen het spectrum van de bacteriën. De gemeten waarden zijn hierdoor onbetrouwbaar omdat het gedeelte RBC dat tegen het spectrum van bacteriën ligt ook bacteriën kunnen zijn die geclassificeerd zijn als RBC.[32]

Bij 2 stafylokokken zijn spermacellen gemeten. Het is onwaarschijnlijk dat er spermacellen in een bloedkweek aanwezig zijn. Dit is niet gezien met de Gram kleuring van de positieve bloedkweek en ook niet bij de Gram kleuring die direct van het gemeten monster is gemaakt nadat de UF-1000i spermacellen had gemeten.

(34)

34 De kop van een spermacel is 4,5 µm lang en 2,5 µm breed. Waarschijnlijk is de oorzaak van het meten van de spermacellen hetzelfde als bij de abnormale rode bloedcellen en bij degisten.

Er zijn verschillende testen uitgevoerd om te proberen de stafylokokken meer ‘uit elkaar te halen.’ Vóórdat een monster werd gemeten met de UF-1000i werd er kort gevortexed op 700 RPM. Een monster uit een willekeurige tijdsreeks is in duplo meegenomen waarbij het ene monster op de gebruikelijke manier kort gevortexed en gemeten werd en waarbij de duplo 60 seconden bij 700 RPM gevortexed en gemeten werd. Als het langer vortexen effect heeft op het ‘los maken’ van de stafylokokken werd er verwacht dat er meer bacteriën/µL gemeten zouden worden. Dit was echter niet het geval, de aantallen bleven navenant gelijk. Met een S. aureus stam geïsoleerd uit een positieve bloedkweek die onbetrouwbare resultaten gaf tijdens het meten met de UF-1000i zijn testjes uitgevoerd met saponine en ureum. Saponine is een zeepstofdie een oppervlaktespanning verlagende werking heeft en in staat is om de permeabiliteit van de celmembranen te verhogen zonder de cel kapot te maken. Ureum is een product dat wordt gevormd in de lever bij de afbraak van eiwitten en effect heeft op de permeabiliteit van membranen. [35] In een buis met MH bouillon met 5% saponine en in een ureum buis zijn enkele kolonies van S. aureus gesuspendeerd en twee uur in een stoof van 36°C gezet. Vervolgens werden hier Gram preparaat van gemaakt en werden vergeleken met dezelfde S. aureus stam die van de bloedplaat kwam. De S. aureus van de bloedplaat bestond alleen maar uit trosjes van tenminste 15 kokken. De S. aureus uit de saponine en uit ureum bestonden uit erg kleine trosjes van maximaal 8 kokken. Naast deze kleine trosjes lagen er erg veel losse kokken in het preparaat. De UF-1000i wordt in de routine wordt gebruikt om urines te meten. Bekend is dat ureum geen negatief effect heeft op de flowcytometer, er is geen ureum van de onderzoeken op stafylokokken gemeten met de UF-1000i. Om te kijken of saponine effect heeft op de UF-1000i is er een buis met MH bouillon met 0,5% saponine gemeten. Verwacht werd dat er in het MH bouillon geen bacteriën en andere cellen aanwezig waren en de UF-1000i bij alle te meten cellen 0/µL geeft. In plaats hiervan gaf de UF-1000i overal strepen als resultaat en bleef het langer spoelen dan normaal. Mogelijk heeft saponine een negatief effect op de UF-1000i.

Aan elke antibiotica concentratie en aan de positieve controle zijn bacteriën van de positieve bloedkweek toegevoegd. Tijdens het uitverdelen van het verdunde, afgedraaide bloed naar de verschillende concentraties ontstaat er vaak al een verschil in het aantal bacteriën / µL. Dit is het gevolg van bijvoorbeeld niet goed vortexen of bij de ene concentratie net iets meer of minder volume toe voegen dan bij een andere concentratie. Hierdoor was op tijdstip 0 het aantal bacteriën / µL niet overal hetzelfde.

Ook moest er tijdens het uitverdelen naar de antibiotica reeks rekening gehouden worden met de exponentiële fase van de bacteriën. Uit het meten van de beginwaarde van de

bloedkweek kan komen dat er 1:1000 verdund moet worden om ongeveer 300 bacteriën / µL te krijgen . Tussen de beginwaarde meten en de ‘echte’ reeks meten kan een tijdsverschil zitten van 60 minuten waarin de bacteriën in staat zijn om zich te vermenigvuldigen. Als er dan 1:1000 verdund is en de echte reeks wordt gemeten, kunnen de bacteriën bij t0 ipv 300 al 1200 bacteriën / µL zijn. Dit was vooral te merken bij Gram negatieve staven.

Één reeks (bijvoorbeeld t30 of t90) bestaat uit ongeveer 9 monsters. Tussen het meten van het eerste- en het laatste monster uit dezelfde tijdsreeks is een tijdsverschil van minimaal 10 minuten aanwezig. Zodra een te meten reeks uit de stoof gehaald werd, werd deze in een koelbox met koel elementen gezet. De intentie hiervan was de monsters koel te houden en zo doorgroei zo veel mogelijk te beperken. Maar omdat de monsters uit een stoof van 37°C kwamen, waren de monsters niet meteen koel. Hierdoor is er een mogelijkheid dat er doorgroei heeft plaatsgevonden.