De extracellulaire matrix (ECM) is een complex en zeer gestructureerd netwerk dat met name bestaat uit vezelachtige eiwitten. De ECM omringt de cellen in alle meercellige organismen en biedt ondersteuning aan deze cellen. De matrix vervult echter ook andere functies, zoals het mogelijk maken van celmigratie, celdeling en de onderlinge communicatie tussen cellen. Veel ziekteprocessen worden gekenmerkt door de afbraak of opbouw van weefsel, wat gepaard gaat met grote veranderingen in de ECM. Bekende voorbeelden van dergelijke processen zijn aderverkalking, angiogenese en de uitzaaiing van tumoren. Om deze ziekteprocessen beter te kunnen begrijpen is het belangrijk om de verschillende bestanddelen van de ECM te kunnen visualiseren. Bovendien stelt de visualisatie van de matrix ons in staat om in laboratoria gekweekte weefselconstructen te vergelijken met lichaamseigen weefsels. Doel van het onderzoek dat in dit proefschrift beschreven wordt is de ontwikkeling van detectiemoleculen voor visualisatie van de verschillende structurele bestanddelen van de ECM. Ook is er onderzoek gedaan naar detectiemoleculen die niet alleen binden aan specifieke componenten van de ECM, maar tevens geactiveerd dienen te worden door specifieke enzymen die verantwoordelijk zijn voor de afbraak van de ECM.
Hoofdstuk 1 geeft een overzicht van de structuur en functies van de ECM, de veranderingen in de ECM die optreden bij ziekteprocessen en reeds bekende benaderingen om deze veranderingen in weefselstructuur zichtbaar te kunnen maken. Een aantal van de detectiemoleculen die in dit proefschrift beschreven worden zijn multivalente moleculen en daarom wordt het principe van multivalentie uitgelegd en een aantal voorbeelden van multivalente liganden bediscussieerd. Collageen is het belangrijkste bestanddeel van de ECM en een groot deel van het onderzoek was dan ook gericht op de visualisatie van collageen met behulp van het collageen bindende eiwit CNA35. Zowel de structuur van collageen als CNA35 wordt besproken, evenals eerder onderzoek naar collageenvisualisatie. Tenslotte wordt er aandacht geschonken aan de ontwikkeling van detectiemoleculen die protease-activiteit zichtbaar kunnen maken.
Onlangs is binnen onze groep een methode ontwikkeld om detectiemoleculen te maken met een hoge affiniteit voor specifieke ECM eiwitten. Grote bibliotheken bestaande uit bacteriele virussen (fagen) met elke vijf identieke peptides op de kop werden gescreend om peptides te vinden die specifiek binden aan collageen type I of V. Vervolgens werd de structuur van de kop van de faag nagemaakt door vijf van de collageenbindende peptides aan een vertakt molecuul te koppelen. Deze pentavalente structuren bleken vele malen sterker aan
collageen te binden dan de monovalente peptides zelf. Het onderzoek beschreven in hoofdstuk 2 richtte zich op het testen van deze strategie om te zien of deze algemeen toepasbaar is voor het ontwikkelen van specifieke detectiemoleculen voor verschillende andere ECM eiwitten. Faag-screenings werden uitgevoerd om peptide-sequenties te vinden die specifiek binden aan elastine, fibronectine, collageen type III, collageen type IV of fibrinogeen. Deze screenings resulteerden in de ontdekking van een specifiek fibronectine-bindend peptide met de sequentie GETRAPL en specifieke fibrinogeen-bindende peptides die allemaal de aminozuursequentie GPRP bevatten. Er werden echter geen substraat-bindende peptides gevonden voor elastine, collageen type III en collageen type V. Hieruit kan geconcludeerd worden dat de faag-screenings zeker niet voor alle ECM eiwitten tot de ontdekking van substraat-bindende peptides leiden. De koppeling van vijf identieke geselecteerde peptides aan een vertakt molecuul leidde wel in beide gevallen tot een significant toegenomen affiniteit in vergelijking met het monovalente peptide, voor zowel het fibronectine- als fibrinogeen-bindend peptide. Men zou daaruit kunnen afleiden dat efficiënte multivalente interacties misschien zelfs vereist zijn om een substraat-bindend peptide te kunnen selecteren met behulp van screening van deze faag-bibliotheken. Het fibronectine-bindende pentameer werd gebruikt voor kleuring van humaan nierweefsel om te zien of specifieke fibronectine-structuren zichtbaar gemaakt konden worden. Helaas leek de affiniteit van het detectiemolecuul toch te laag te zijn om specifiek de aanwezige fibronectine te visualiseren, omdat achtergrondbinding aan de epitheelcellen zichtbaar was. Dit experiment laat zien dat de toepasbaarheid van elk multivalent construct dat voortgekomen is uit faag-screenings getest moet worden op weefsels om te zien of zowel de affiniteit als specificiteit voldoende is om de gewenste structuren te kunnen visualiseren.
Het onderzoek naar de multivalente peptide constructen illustreert duidelijk dat de combinatie van meerdere zwakke interacties in één detectiemolecuul tot een veel sterkere binding kan leiden. In hoofdstuk 3 wordt beschreven hoe dit concept is toegepast op eiwitten door meerdere CNA35 eiwitten te combineren in een multivalent molecuul. Koppeling van CNA35 eiwitten aan zowel divalente als tetravalente dendritische structuren door middel van natieve chemische ligatie resulteerde in goed gedefineerde eiwit-dendrimeren. Daarnaast werden ook varianten gemaakt op basis van een zwak bindende CNA35 mutant, CNA35(Y175K). Bindingsstudies werden uitgevoerd met oppervlaktes waarop collageen geïmmobiliseerd was, maar ook met oppervlaktes met een kleine, synthetische collageen-replica. Verschillende hoeveelheden van deze collageen-replica konden op de oppervlaktes geimmobiliseerd worden, waardoor het effect van de substraat-dichtheid op de binding onderzocht kon worden. CNA35-dendrimeren bleken na binding veel minder snel los te laten. Het tetravalente CNA35(Y175K)-dendrimeer liet een indrukwekkende toename in affiniteit
voor collageen zien. Het onderzoek wees uit dat het herstellen van de collageen-bindingscapaciteit tenminste drie gelijktijdige interacties vereist.
Het combineren van meerdere substraat-bindende elementen in een molecuul is dus een effectieve manier om bestanddelen van de ECM te kunnen binden met een hoge affiniteit. Maar in plaats van het zichtbaar maken van de structurele veranderingen in het weefsel zou ook de visualisatie van de enzymatische activiteit die hieraan ten grondslag ligt veel informatie kunnen opleveren. Matrix metalloproteinases (MMP’s) zijn enzymen die collageen kunnen afbreken en de concentratie van deze MMP’s is vaak verhoogd in ziek weefsel. Hoofdstuk 4 richt zich op de ontwikkeling van een MMP-activeerbaar collageen-bindend detectiemolecuul gebaseerd op het collageen-bindend eiwit CNA35. Binding van CNA35 aan volwassen collageenstructuren werd verhinderd door een circulaire variant van het eiwit te maken, waardoor CNA35 niet meer aan de collageenstructuren kan binden. De aanwezigheid van een MMP-herkenningssequentie in het circulaire CNA35 maakt opening van de ringstructuur mogelijk door actieve MMPs. Bindingsexperimenten met zowel collageen-oppervlaktes op een chip als collageenrijke weefsels toonden een significant verminderde binding van circulair CNA35 aan natief collageen aan. Evaluatie van de binding van circulair CNA35 aan een oppervlak waarop een kleine, synthetische collageen-replica geïmmobiliseerd was toonde aan dat de affiniteit van circulair CNA35 voor de collageen-replica vergelijkbaar is met de affiniteit van wild type CNA35 voor de collageen-replica. Dit experiment bewijst dat de sterk verminderde affiniteit van circulair CNA35 voor collageen te wijten is aan de gelimiteerde bewegingsvrijheid van het molecuul als gevolg van de circulair structuur, en niet aan een verkeerde eiwitvouwing. De aanwezigheid van MMP-1 resulteerde in het openen van de circulaire structuur, waardoor de collageen-bindingsaffiniteit hersteld werd.
De synthese van een circulaire variant van CNA35 als strategie voor de ontwikkeling van een MMP-activeerbaar collageen-bindend detectiemolecuul was gebaseerd op het specifieke bindingsmechanisme van CNA35. In hoofdstuk 5 wordt een meer algemeen principe geïntroduceerd waarbij het substraat-bindende gedeelte van het molecuul via een intramoleculaire interactie wordt geblokkeerd. Een kleine, synthetische collageen-replica werd gekoppeld aan CNA35 via een MMP-herkenningssequentie. CNA35 werd daartoe gesynthetiseerd met een C-terminale thioester groep en vervolgens gekoppeld aan een trivalente dendritische structuur door middel van natieve chemische ligatie. De drie amino-oxy-eindgroepen van de dendrimeer werden gefunctionaliseerd met (GPO)5 peptides door middel van oxime ligatie, waardoor de karakteristieke secundaire structuur van een collageenmolecuul gevormd kon worden. Een vijfvoudige toename van de affiniteit voor collageen werd geconstateerd na activatie van deze variant van CNA35 door MMP-1. De
activatie van deze sensor kon ook ex vivo gevisualiseerd worden in het hartvliesweefsel van een varken waarbij wild type CNA35 als referentie gebruikt werd.