2. OBJECTIEVEN
3.4. PROTOCOLS
3.4.3. Celculturen
3.4.4.4. Blocking en incubatie met antilichaam
Na de transfer volgt de blocking van het membraan, hiervoor wordt 5mL PBS en 5mL blockingbuffer bijeengebracht in een bakje. Vervolgens wordt het membraan uit de gelhouder cassette gehaald m.b.v. een pincet
31 en wordt dit in het bakje gebracht met de gelkant naar boven. Dit wordt gedurende 1u op de shaker geplaatst. In de tussentijd worden de antilichaamoplossingen gemaakt. Het androgeenreceptor primair antilichaam en het secundair antilichaam worden respectievelijk 1/1000 en 1/15000 verdund in 1:1 PBS en blockingbuffer. PBS wordt gemaakt door één zakje PBS poeder op te lossen in ultrapuur water en dit aan te lengen tot 1L. Het secundair antilichaam wordt vervolgens in aluminium folie gewikkeld om te beschermen tegen het licht. Na 1u wordt de PBS-blocking vloeistof weggegoten en wordt vervolgens het primair antilichaam toegevoegd. Dit bakje wordt geïncubeerd bij 4°C gedurende de nacht.
De volgende dag wordt de antilichaamoplossing verwijderd en wordt het membraan vervolgens drie maal gewassen gedurende 5 min op de shaker m.b.v. PBS + 0.05% tween 80 en eenmaal met enkel PBS.
Het secundair antilichaam wordt vervolgens aan het membraan toegevoegd. Dit wordt in aluminium folie gewikkeld en gedurende 1u op de shaker geplaatst. Nadien wordt het membraan terug gewassen met drie maal PBS + 0.05% tween gedurende 5 min op de shaker en eenmaal met enkel PBS. Dit laatste wordt niet verwijderd zodat het membraan niet droog wordt. Finaal wordt het membraan geanalyseerd m.b.v. de Licor Odyssey Infrared Imager (Westburg, Leusden, Nederland).
Het praktisch werk dat gerealiseerd wordt in deze masterproef bestaat erin om deze methode te optimaliseren. Hiervoor worden een aantal parameters onderzocht. Zo wordt het volume getest waarmee de proteïneladder wordt geladen en wordt het gebruikte secundaire antilichaam getest op aspecifieke binding. Ook wordt de werking van het androgeenreceptor primair antilichaam onderzocht. De invloed van het volume aan proteïneladder wordt getest samen met de aspecifieke binding door parallel aan elkaar twee membranen te blotten. Hierbij wordt één geïncubeerd volgens het protocol en de andere enkel met het secundair antilichaam geïncubeerd. Beide blots worden geladen met de LNCaP 77 cellijn en 5µL i.p.v. 8µL proteïneladder. Het primair antilichaam wordt getest door de gebruikte methode te evalueren. Hiervoor wordt hetzelfde membraan in twee helften opgesplitst waarbij de ene helft geïncubeerd wordt met het primair antilichaam voor β-actine en de andere helft geïncubeerd wordt met het primair antilichaam voor de androgeenreceptor.
3.4.5. Celtest
Als voorbereiding op de expressie en internalisatie celtest worden de cellijnen een dag voordien uitgeplaat in respectievelijk twee gecoate 24-well platen en vier gecoate 6-well platen. Voor expressie wordt er per cellijn drie maal 400 000 cellen uitgeplaat (Figuur 3.3) die m.b.v. de Bürker telkamer geteld worden. Hiervoor wordt er 50µL van de desbetreffende celsuspensie genomen en wordt dit ½ verdund met trypaan blauw.
32
Vervolgens worden de witte cellen geteld in drie grote vierkanten in de telkamer die telkens opgedeeld zijn in vier maal vier vierkantjes. Met dit bekomen aantal wordt a.d.h.v. formule 3.2 berekend hoeveel cellen er per milliliter aanwezig zijn waaruit een celsuspensie van 400 000 cellen/mL wordt gemaakt. Hiervan wordt in drievoud 1mL van iedere cellijn in beide well platen gepipetteerd (Figuur 3.3). Voor internalisatie wordt er van de celsuspensie die de standaard LNCaP cellijn bevat, 2mL gepipetteerd in de vier 6-well platen. Deze vier platen worden telkens in twee helften verdeeld zodat de ene helft geïncubeerd kan worden met [18F]AlF-PSMA-11 en de
andere helft met [18F]AlF-PSMA-11 + 2-PMPA (Figuur 3.3). Zowel de expressie platen als de internalisatie platen
worden gedurende 24u in de incubator geplaatst op 37°C. Op dezelfde dag van het uitplaten worden de HEPES+- oplossing en PBS + 1% BSA-oplossing gemaakt (Tabel 3.3).
𝑥 × 2 × 10 000 = 𝑦
Formule 3.2: Formule voor de berekening van het aantal cellen per milliliter medium waarin x = het gemiddelde van het aantal getelde cellen per milliliter onder de microscoop en y = het aantal cellen per milliliter medium.
Tabel 3.3: Samenstelling voor 400mL HEPES+-oplossing en PBS + 1% BSA-oplossing.
Component Concentratie (mM) Voor 400mL HEPES+ (mg)
(mg(mg) PBS + 1% BSA NaCl 100 2337,6 / KCl 2 59,6 / MgCl2 1 38,1 / CaCl2 1 44,4 / HEPES 10 953,2 / TRIS 5 242,3 / Glucose 1g/L 400,0 / BSA 1g/L 400,0 500,0mg PBS / / 50mL
Figuur 3.3: Voorstelling van de 24-well en 6-well plaatdesign voor expressie en internalisatie respectievelijk (115,116). LNCaP 13 C4-2 LNCaP 58 LNCaP 40+11 LNCaP 79 PC 3 LNCaP 60+11 LNCaP 13 LNCaP 13
33 De dag erna wordt via bovenstaande methode gesynthetiseerd (zie 3.4.1. Synthese van [18F]AlF-PSMA-
11). De HEPES+-oplossing wordt in het warmwaterbad gezet, PBS en PBS + 1% BSA worden op ijs geplaatst. Daarna wordt de celtest voor expressie en internalisatie samen uitgevoerd door het medium in de wellen te aspireren en vervolgens de cellen twee maal te wassen met respectievelijk 1mL en 2mL HEPES+. Tussenin de wasstappen wordt er geaspireerd. Vervolgens worden de platen geïncubeerd met [18F]AlF-PSMA-11 of [18F]AlF-PSMA-11 + 2-
PMPA. Bij de expressie platen wordt één van de twee platen geïncubeerd met 250µL [18F]AlF-PSMA-11 en de
andere met 250µL [18F]AlF-PSMA-11 + 2-PMPA. Deze beide platen worden gedurende één uur in de incubator
geplaatst op 37°C. Voor internalisatie worden de bovenste drie welletjes van iedere plaat geïncubeerd met 500µL [18F]AlF-PSMA-11 en de onderste drie met 500µL [18F]AlF-PSMA-11 + 2-PMPA (Figuur 3.3). Drie van de vier
platen worden gedurende 30 min, 1u en 3u in de incubator geplaatst bij 37°C. De vierde plaat wordt gedurende 1u bij 4°C bewaard. (115,116)(117)
Om de incubatie te beëindigen zijn de eerste stappen gelijkaardig voor expressie en internalisatie. Hiervoor wordt de plaat op ijs gezet en op hetzelfde moment wordt er respectievelijk 1mL en 2mL ijskoud PBS + 1 % BSA aan de wellen toegevoegd. Daarna wordt alles terug geaspireerd en wordt er respectievelijk 2mL en 4mL ijskoud PBS toegevoegd aan alle wellen en wordt dit vervolgens geaspireerd. Bij de expressie platen wordt er 250µL 0,1M NaOH aan de wellen toegevoegd om vervolgens op de shaker te plaatsen gedurende 10 min. Daarna wordt er hiervan 150µL gepipetteerd in het overeenkomstig cobrabuisje. Bij de internalisatie platen wordt er vervolgens 1mL glycine-HCl (0,1M; pH 2,8) toegevoegd gedurende 5 min. Daarna wordt het geheel van iedere well gepipetteerd in het overeenkomstige cobrabuisje. De wellen worden gespoeld met 1mL PBS en deze wasfractie wordt toegevoegd aan de glycine-oplossing in hetzelfde overeenkomstig cobrabuisje. Vervolgens wordt er 500µL 0,1M NaOH toegevoegd aan de wellen en wordt dit gedurende 10 min op de shaker gezet. Daarna wordt hiervan 150µL gepipetteerd in het overeenkomstige cobrabuisje. Vervolgens wordt er nog van de standaardoplossingen [18F]AlF-PSMA-11 en [18F]AlF-PSMA-11 + 2-PMPA driemaal 150µL gepipetteerd in een
cobrabuisje.
Zowel van iedere well van alle platen als van de BCA standaardreeks wordt er 25µL gepipetteerd in een 96-well plaat en wordt een BCA test uitgevoerd(3.4.2. BCA proteïne assay). Finaal wordt van alle stalen de radioactiviteit gemeten m.b.v. Cobra.
3.4.6. Inoculatie in muizen
Vooraleer de inoculatie van de muizen met LNCaP cellen kan gebeuren, worden deze cellen geïsoleerd uit de falcons. Dit gebeurt terug via bovenvermelde methode (zie 3.4.3. Celculturen) waarbij de cellen ook geteld
34
worden d.m.v. de Bürker telkamer (zie 3.4.5. Celtest). Een verschil hierbij is dat de gecentrifugeerde cellen zullen aangelengd worden in medium zonder FBS. Vooraleer de gecentrifugeerde cellen worden aangelengd in het berekende volume FBS vrij medium, worden ze twee maal gespoeld met dit medium. Dit wordt uitgevoerd door een hoeveelheid FBS vrij medium te nemen om de cellen hierin te suspenderen en dit vervolgens gedurende 5 min te centrifugeren. Na de laatste centrifugeerstap wordt een LNCaP celsuspensie gemaakt van 5 miljoen cellen/100µL FBS vrij medium. Vervolgens worden 10 muizen geïnoculeerd m.b.v. een insulinespuit die 100µL LNCaP cellen en 100µL Matrigel matrix bevat.
35
4. RESULTATEN
4.1. WESTERN BLOT
De eerste western blot werd uitgevoerd volgens bovenstaand protocol (3.4.4. Western blot). Er waren hierbij geen duidelijke banden te zien bij LNCa¨P 11 en 77 cellen (Figuur 4.1). De proteïneladder daarentegen vertoonde afzonderlijke banden maar deze verspreidden zich over het volledige membraan.
Een volgend experiment werd uitgevoerd waarbij er twee western blots parallel naast elkaar werden uitgevoerd met dezelfde stalen. Hierbij werden beide blots uitgevoerd met 5µL i.p.v. 8µL proteïneladder zoals in het origineel protocol beschreven staat. Er werd echter nog een verschil ingevoerd tussen beide blots. Zowerd één membraan geïncubeerd volgens het protocol en één membraan werd geïncubeerd met enkel het secundair antilichaam (Figuur 4.2). Bij A (Figuur 4.2) was de proteïneladder uitgelopen en waren er terug banden te zien verspreid over heel de blot. Bij B (Figuur 4.2) was de proteïneladder minder uitgelopen maar was er nog steeds veel achtergrondsignaal te zien op de blot. Indien de banden van de proteïneladder werden vergeleken met
A
Figuur 4.2: Resultaat van een western blot om het antilichaam te testen met A= het membraan dat geïncubeerd werd volgens het protocol en B = het membraan dat enkel geïncubeerd werd met het secundair antilichaam.
B
Figuur 4.1: Schematische voorstelling van de gevulde welletjes (links) en het resultaat van de analyse van het membraan via de western blot methode (rechts).
36
elkaar kon geen verschil opgemerkt worden. In vergelijking met de vorige western blot (Figuur 4.1) was de scheiding van de proteïneladder naar afzonderlijke banden op beide blots minder goed gebeurd.
Bij een volgende uitvoering van de western blot werd één membraan in twee verdeeld zodat de ene helft geïncubeerd werd met het primair antilichaam voor β-actine en de andere helft met het primair antilichaam voor de androgeenreceptor (Figuur 4.3). Hierbij werden er bij het primair antilichaam voor β-actine twee banden verkregen parallel aan de gevulde laantjes (A). De band die verkregen werd bij 30µL C4-2 cellen had een hogere intensiteit dan deze verkregen bij 15µL C4-2 cellen. Bij het membraan met het primair antilichaam voor de androgeenreceptor (B) kon niks opgemaakt worden doordat de blot overbelicht was.
4.2. CELTEST
4.2.1. Expressie
Bij de celtest uitgevoerd met automatisch gesynthetiseerd [18F]AlF-PSMA-11, zijn de resultaten
weergegeven van één celtest (Tabel 4.1). Op figuur 8.1 (zie 8. Appendix) is het gemiddelde te zien van drie celtesten, maar deze resultaten werden niet gebruikt in de analyse doordat er tijdens twee van die celtesten veel cellen zijn losgekomen in de wellen door de wasstappen. Bij deze ene celtest kon opgemerkt worden dat er geen eenduidige daling of stijging was in functie van de LNCaP celsplitsingen doordat LNCaP 79–83 cellen terug een verhoogde opname vertoonden t.o.v. LNCaP 58-63 cellen (Tabel 4.1). Er was een specifieke opname van 439,0% opname van [18F]AlF-PSMA-11/mg eiwit bij LNCaP 40+11 cellen. Dit zijn cellen die deels opgegroeid werden
in androgeenvrij medium en vertoonden met deze opname een sprong t.o.v. degene die in compleet medium zijn opgegroeid. De LNCaP 60+11 cellen die eveneens deels opgegroeid werden in androgeenvrij medium, vertoonden Figuur 4.3: Schematische voorstelling van de gevulde welletjes (links) en het resultaat van de analyse van het membraan via de western blot methode (rechts). Resultaat A is het membraan geïncubeerd met het β-actine primair antilichaam en resultaat B is het membraan geïncubeerd met het androgeenreceptor primair antilichaam.
B A
37 t.o.v. LNCaP 40+11 een hogere specifieke opname met 491,7% opname van [18F]AlF-PSMA-11/mg eiwit. PC3 die
dient als negatieve controle, vertoonde een verwaarloosbare specifieke opname (Tabel 4.1).
Tabel 4.1: Overzicht van de waarden van de specifieke opname van [18F]AlF-PSMA-11 bij automatische synthese
en manuele synthese tonen de expressie van PSMA in functie van verschillende cellijnen.
Indien [18F]AlF-PSMA-11 manueel werd gesynthetiseerd, was een gering verschil op te merken in
specifieke opname van [18F]AlF-PSMA-11 in functie van LNCaP celsplitsingen in compleet medium (Tabel 4.1). Bij
een statistische analyse tussen de LNCaP 13-17, LNCaP 58-63, LNCaP 79-83 en C4-2 a.d.h.v. de Kruskal Walis test, werden volgende nulhypothese (H0) en alternatieve (Ha) hypotheses onderzocht. Bij de Ho werd gesteld dat de
gemiddelde opname van [18F]AlF-PSMA-11 van de vier groepen gelijk was, bij de H
a daarentegen werd gesteld dat
de gemiddelde opname van de vier groepen verschillend was. Hierbij werd 0,516 als P-waarde bekomen waardoor de H0 niet kon verworpen worden en bijgevolg kon gesteld worden dat er geen significant verschil was
in opname tussen de groepen (Figuur 8.2 zie 8. Appendix). Bij LNCaP 40+11 was een grotere specifieke opname te zien van [18F]AlF-PSMA-11. Dit verschil in gemiddelde werd statistisch vergeleken met dat van de standaard
LNCaP cellijn (LNCaP 13-17) a.d.h.v. de Mann Whitney U test. Hierbij werd de H0 en Ha gelijkgesteld aan dat de
gemiddelde specifieke opname respectievelijk gelijk of verschillend was. Doordat uit deze resultaten een P- waarde werd bekomen van 0,10, kon ook hier de H0 niet verworpen worden en kon bijgevolg gesteld worden dat
er geen significant verschil in opname was tussen de groepen (Figuur 8.3 zie 8. Appendix). De specieke opname bij LNCaP 60+11 vertoonde daarentegen ook een stijging t.o.v. de standaard LNCaP cellijn maar deze was minder uitgesproken dan bij LNCaP 40+11-12. Ook dient er opgemerkt te worden dat de algemene specifieke opname
Expressie Specifieke opname [18F]AlF-PSMA-11 (% opname/mg eiwit)
cellijn Automatische synthese Manuele synthese (± SD)
LNCaP 13-17 261,5 9,0 ± 2,1 LNCaP 58-63 214,1 6,8 ± 2,1 LNCaP 79-83 275,1 8,7 ± 1,9 C4-2 302,5 8,3 ± 2,6 LNCaP 40+11-12 439,0 24,0 ± 7,8 LNCaP 60+11 491,7 12,4 PC3 1,8 0,1 ± 0,1
38
van [18F]AlF-PSMA-11 aanzienlijk lager was indien deze manueel gesynthetiseerd werd i.p.v. via automatische
synthese (Figuur 4.4). PC3 vertoonde ook in deze celtest een verwaarloosbaar specifieke opname (Tabel 4.1).
4.2.2. Internalisatie
Bij de automatische synthese van [18F]AlF-PSMA-11 was te zien dat zowel de binding aan de PSMA-
receptor als de internalisatie steeg naarmate de cellen één uur geïncubeerd waren (Tabel 4.2). De binding van [18F]AlF-PSMA-11 aan de PSMA-receptor was maximaal bij 1u om vervolgens te dalen, terwijl de internalisatie van
[18F]AlF-PSMA-11 bleef toenemen gedurende de 3u. De specifieke opname van de tracer bij internalisatie was
aanvankelijk lager dan dat van de binding aan de PSMA-receptor maar evolueerde dan naar een hogere opname bij de latere tijdsstippen. Het resultaat van de specifieke opname bij 1u, 4°C was ongeveer gelijk voor de binding van de tracer aan de PSMA-receptor maar dit was niet het geval voor de internalisatie. Deze lag aanzienlijk lager dan bij het overeenkomstig punt bij 37°C (Figuur 4.5). De internalisatie resultaten bekomen door manuale synthese van [18F]AlF-PSMA-11 worden hier niet besproken (Figuur 8.4 zie 8. Appendix).
Figuur 4.4: Vergelijking van de specifieke opname van [18F]AlF-PSMA-11 tussen [18F]AlF-PSMA-11 manueel en
39 Tabel 4.2: Overzicht van de waarden van de specifieke opname van automatisch gesynthetiseerd [18F]AlF-PSMA-
11 in functie van de verschillende cellijnen bij de internalisatie celtest.
Internalisatie Specifieke opname [18F]AlF-PSMA-11 (% opname/mg eiwit) ± SD
Tijd en temperatuur Binding aan PSMA-receptor Internalisatie
O,5u; 37°C 133,1 ± 51,1 98,3 ± 42,7
1u; 37°C 205,0 ± 118,3 227,7 ± 160,4
1u; 4°C 197,7 ± 155,8 37,2 ± 22,6
3u, 37°C 135,7 ± 58,2 262,3 ± 56,6
Figuur 4.5: Resultaat van de gemiddelde binding en internalisatie van automatische gesynthetiseerd [18F]AlF-PSMA-11
40
5. DISCUSSIE
5.1. WESTERN BLOT
De eerst uitgevoerde western blot gaf geen goed resultaat doordat de proteïneladder deels was uitgelopen (Figuur 4.1). Hierdoor zijn in de andere lanen ook aspecifieke banden gedetecteerd parallel aan deze van de proteïneladder terwijl niet iedere laan gevuld was met een staal. Dit zorgde ervoor dat eventuele detectie van de androgeenreceptor onmogelijk was. Ook was er bij de banden in de geladen laantjes geen opvallend intensiteitsverschil te zien waardoor er kon gezegd worden dat er geen detectie was van de androgeenreceptor. Nadien werd de invloed getest van het volume waarmee de proteïneladder geladen werd. Hiervoor werden twee western blots die parallel naast elkaar werden uitgevoerd, beide geladen met 5µL proteïneladder i.p.v. 8µL (Figuur 4.2). Samen met deze aanpassing werd ook het secundair antilichaam getest op aspecifieke binding. Hiervoor werd na de transfer en blocking, het ene membraan geïncubeerd met enkel het secundair antilichaam en dit zal dienen als negatieve controle terwijl de andere eerst geïncubeerd werd met het primair antilichaam en vervolgens met het secundair antilichaam. Bij het resultaat van deze twee western blots was de proteïneladder bij A terug uitgelopen wat bij B niet het geval was (Figuur 4.2). Dit was vermoedelijk te wijten aan de manier waarop het laantje geladen werd. Desondanks dat de proteïneladder minder uitgelopen was bij B (Figuur 4.2) en er niet geïncubeerd werd met het primaire antilichaam, was er toch veel binding van het secundair antilichaam op het membraan (Figuur 4.2). Deze aspecifieke binding kon veroorzaakt zijn door onvoldoende blocking. Om deze parameter te optimaliseren werd deze blockingbuffer voortaan gefilterd m.b.v. 0,22µm membraan filter, vooraleer deze werd gebruikt. Ook was bij beide blots de scheiding van de proteïneladder naar afzonderlijke banden minder duidelijk t.o.v. de eerder uitgevoerde blot. De banden waren breder waardoor de banden in elkaar overgaan en op die manier geen goede scheiding vertonen. Echter was dit niet zoals verwacht doordat een verminderd volume dunnere banden zou moeten geven. Er kon hiervoor geen verklaring vooropgesteld worden. Vermoedelijk kon dit opgelost worden door de elektroforese langer uit te voeren. Vervolgens werd de werking van het primaire antilichaam voor de androgeenreceptor getest door een membraan die voordien getransfereerd werd, in twee te verdelen waarbij de ene helft geïncubeerd werd met het primair antilichaam voor β-actine en de andere helft met het primair antilichaam voor de androgeenreceptor. Beide werden vervolgens geïncubeerd met hetzelfde secundair antilichaam. Uit blot B (Figuur 4.3) kon echter niet besloten worden dat de primair antilichaam voor de androgeenreceptor niet werkzaam was doordat de blot overbelicht was.
41 In deze masterproef was de kans er echter niet om een western blot uit te voeren met de gewijzigde methode en een nieuw androgeenreceptor primair antilichaam. Indien deze western blot niet het gewenste resultaat zou geven, kunnen er verdere optimalisaties worden uitgevoerd. Zo kunnen de bekomen banden op de blot onduidelijk zijn door niet optimale running- en transferomstandigheden zoals de duur en stroom gebruikt om de running en transer uit te voeren. Ook kan de transferbuffer niet correct zijn samengesteld en dient deze eventueel opnieuw aangemaakt te worden. Het kan ook zijn dat er regio’s zijn van onvoldoende binding van het proteïne op het membraan. Dit komt doordat het membraan niet voldoende werd bevochtigd bij het samenstellen van de transfersandwich of doordat er nog luchtbellen aanwezig waren. Ook kunnen er zich problemen voortdoen bij de detectie zoals een hoog achtergrondsignaal of een zwak of geen signaal. Een hoog achtergrondsignaal kan de oorzaak zijn van een onvolledige of onzuivere blocking, onvoldoende wasstappen, een te hoge concentratie aan proteïnen die geladen zijn of een inadequate concentratie van het primair en/of secundair antilichaam. Een aanpassing van de samenstelling van de blockingbuffer en wasoplossingen kunnen helpen om dit te vermijden. Ook kan de concentratie van de geladen proteïnen en de gebruikte antilichamen aangepast worden. Indien er geen of zwakke signalen bekomen worden dient geëvalueerd te worden of dit het gevolg is van een inadequate running of transfer (zie hiervoor) of van een inadequate detectie. Indien het probleem veroorzaakt wordt door de detectie kan een oplossing zijn om de proteïneconcentratie waarmee geladen te verhogen. Bij detectie van onvolledige banden kan dit toe te schrijven zijn aan het droog komen van het membraan vooraleer detectie mogelijk was (108).
5.2. CELTEST
5.2.1. Expressie
Eerder is aangetoond dat naarmate LNCaP cellen langer in kweek zijn gehouden, deze minder afhankelijk worden van androgeen om te kunnen groeien en dus androgeenongevoelig worden. Igawa et al. (118) heeft aangetoond dat dit niet gepaard gaat met een verlies aan androgeenreceptor expressie. In deze masterproef werd er onderzocht hoe deze androgeenongevoeligheid gecorreleerd is aan de PSMA expressie. Het is al gekend dat de androgeenreceptor na internalisatie met het overeenkomstig ligand als transcriptiefactor dient voor de PSMA-receptor en de transcriptie van dit mRNA zal downreguleren. Met als gevolg dat bij het toepassen van ADT, de expressie van PSMA wordt upgereguleerd. Desondanks dat androgeenongevoeligheid wordt teweeggebracht door verdere splitsingen van LNCaP, uit zich dit niet verder in een upregulatie van de PSMA-receptor. Castanares et al. (109) heeft aangetoond dat deze verdere splitsingen ervoor zorgen dat de PSMA
42
expressie daalt. Deze tendens kon echter niet opgemaakt worden uit de bekomen resultaten in deze masterproef. In de celtest met automatisch gesynthetiseerd [18F]AlF-PSMA-11 was er geen duidelijke trend te zien
doordat LNCaP 58-63 t.o.v. LNCaP 13-17 een daling vertoonde in specifieke opname, maar LNCaP 79-83 daarentegen vertoonde terug een verhoogde specifieke opname. Er dient wel opgemerkt te worden dat de specifieke opname niet erg varieerde tussen de celsplitsingen. Echter kon er geen statistische analyse uitgevoerd worden op deze resultaten doordat enkel de gegevens opgenomen zijn van één celtest. Indien deze resultaten