1. INLEIDING
1.5 AUTOMATISATIE ANTIMICROBIËLE GEVOELIGHEIDSTESTEN
Zoals eerder vermeld (Paragraaf 1.2.6) zijn fenotypische gevoeligheidstesten gebaseerd op de detectie van bacteriegroei in de aanwezigheid van antibiotica waarvoor lange incubatietijden (18 tot 24 uur) worden vereist vooraleer interpretatie mogelijk is. Automatisatie reduceert de benodigde tijd voor uitvoering van deze testen. Sommige geautomatiseerde systemen kunnen zelfs de incubatieduur verkorten door vroegtijdig kleine veranderingen in bacteriegroei te detecteren, wat meer impact heeft op de time-to-result. Een voorafgaande kweek blijft wel nog steeds nodig en is een tijdrovende factor (10,52).
1.5.1 Systemen voor de disk diffusie methode
Verschillende parameters van de disk diffusie methode (type medium, inoculum densiteit…) werden gestandaardiseerd. Het meten van de zone diameters door MLT’s is een subjectieve waarneming dat zorgt voor een operator afhankelijke variabiliteit. Automaten voor aflezing van de zone diameters, zoals AdagioTM (Biorad) in het lab van het UZ Gent, zijn dan ook een nuttig hulpmiddel voor de standaardisatie van deze variabele. Een geautomatiseerde zone diameter lezer neemt een foto van antibiogrammen, meet automatisch de diameters van de inhibitiezones en interpreteert deze met behulp van de gekoppelde software naar S, I of R. Ondanks het feit dat manueel nazicht en kleine correcties noodzakelijk blijven, neemt het aflezen met behulp van AdagioTM in
ieder geval minder tijd in beslag dan het manueel meten en interpreteren van elke diameter en is er tevens een veel kleiner risico op fouten. Andere hulpsystemen voor de disk diffusie methode zijn een disk dispenser om antibioticumschijfjes aan te brengen en turbidimetrische apparaten om bacteriesuspensies met een 0,5 McFarland densiteit te bekomen (11,52,53). Een volledige automatisatie van de disk diffusie methode kan door koppeling van de WASP® aan het WASP®Lab, zoals aangehaald in Paragraaf 1.3.3. De WASP® brengt na enting van een bacteriesuspensie antibioticumschijfjes aan zodat daarna het antibiogram via de transportband verplaatst wordt naar het WASPLab® voor een verdere verwerking (41).
1.5.2 Systemen voor de broth microdilutie
Verschillende geautomatiseerde hulpsystemen voor de broth microdilutie zijn beschikbaar. De Sensititre AutoInoculator® (Trek Diagnostics) bijvoorbeeld inoculeert automatisch microtiterplaten met bacteriesuspensies. Afleessystemen, zoals Sensititre Autoreader® en AutoSceptor® (Becton Dickinson Diagnostics), evalueren automatisch bacteriegroei in microtiterplaten. Afhankelijk van het systeem is de detectie gebaseerd op fotometrie, turbidimetrie of fluorimetrie (52).
1.5.3 Geautomatiseerde broth-gebaseerde gevoeligheidstesten 1.5.3.1 Historiek
Het Autobac® disk elutie systeem (Pfizer Diagnostics) was één van de eerste automaten die het effect van een antibioticum op de ontwikkeling van bacteriën in een bouillon waarneemt op basis van lichtverstrooiing (54). Een test cuvette bestaat uit dertien kamers waarvan twaalf kamers voor het testen van antibiotica en één controlekamer zonder antibioticum. Elke kamer wordt gevuld met een bepaalde hoeveelheid bacteriesupensie. Antibioticumschijfjes worden boven op de diverse kamers geplaatst zodat deze contact maken met de bouillon, maar zonder binnen te dringen in de kamer en hierdoor niet het licht verstoren. De kamers worden tijdens incubatie bij 35°C geschud zodat het antibioticum uit de schijfjes elueert in de kamers. Een lichtverstrooiende fotometer evalueert de hoeveelheid groei in elke kamer en vergelijkt die met de groei in de controlekamer. Een groei index tussen 0 en 1 wordt bekomen waardoor de gevoeligheid voorspeld kan worden (52,54).
Het Abbott MS-2® systeem, ontwikkeld in 1977, is vergelijkbaar met de Autobac®. Een fotometer neemt turbidimetrische en colorimetrische veranderingen waar in de bouillon waarin het micro-organisme groeit (54). Datzelfde jaar introduceerde McDonnell Douglas Corporation het Automicrobic® systeem, de voorloper van Vitek®, dat gebruik maakt van gedehydrateerde reagentia in plastieken testkaarten, dewelke beschikbaar zijn voor identificatie en gevoeligheidstesten van verschillende micro-organismen. De implementatie van gestandaardiseerde microtiterplaten met antibiotica, ook ontwikkeld in 1977, speelde een belangrijke factor bij
de ontwikkeling van geautomatiseerde gevoeligheidstesten (10). Dit leidde tot het ontstaan van SensititreTM, BBL Sceptor®, een reeks systemen van Microscan en evolueerde verder naar meer complexere systemen zoals AutoScan® en het MicroScan Walkaway® systeem. Van de verschillende systemen zijn er slechts vier die het meest worden gebruikt: Vitek®, SensititreTM, MicroScan WalkAway® systeem en BD PhoenixTM (vergelijking in Tabel 1.1). Het voordeel is dat ze de benodigde tijd vooraleer resultaat kunnen reduceren, arbeidsbesparend en eenvoudig zijn. Nadelen zijn de kostprijs, het optreden van onzuiverheden, de beperkte flexibiliteit met voorgemaakte microtiterplaten en moeilijkheden om heteroresistentie en gemengde culturen te detecteren (10,52).
1.5.3.2 Vitek® en Vitek® 2 systeem
Het Vitek® systeem (bioMérieux) is een geautomatiseerd systeem dat naast het uitvoeren van een antimicrobiële gevoeligheidstest ook snel micro-organismen kan identificeren. Een identificatiekaart bestaat uit 30 wells gevuld met groeimedia en identificeert bacteriën d.m.v. enzymatische reacties. Een gevoeligheidskaart bestaat uit 45 wells gevuld met groeimedia en verschillende concentraties antibiotica. Één well zonder antibiotica dient als positieve controle zodat groei in wells hiermee vergeleken kan worden en er rekening gehouden wordt met de groeisnelheid. Vitek® beschikt over een vulsysteem dat elke well inoculeert met een 0,5 McFarland bacteriesuspensie, een incubatie- en afleessysteem en een computersysteem. Om de vijftien minuten worden turbidimetrische metingen uitgevoerd om bacteriegroei in de wells te detecteren. De gemeten transmissie is omgekeerd evenredig met de totale biomassa van de bacteriën. De verandering van de transmissie (uitgedrukt in %) wordt ten opzichte van de tijd uitgezet in een curve (Figuur 1.13). De MIC wordt bepaald door de curve te vergelijken met databanken die standaardcurves met gekende MIC’s omvatten (geëxtrapoleerde MIC’s) (52,55).
Een meer geautomatiseerde versie is het Vitek® 2 systeem (bioMérieux), beschikbaar in drie formaten die verschillen in capaciteit en automatisatie: Vitek 2 compact, Vitek 2 en Vitek 2 XL. Kaarten worden automatisch na inoculatie naar het incubatie- en afleessysteem gebracht en op het einde weggeworpen. Een 64-well kaart die tot wel twintig antibiotica kan testen wordt, net zoals bij Vitek®, om de vijftien minuten turbidimetrisch gemonitord op groeiactiviteit (17,52).
Figuur 1.13: % Verandering transmissie in functie van de tijd met de blauwe lijn als positieve controle en de groene, gele en rode lijnen antibioticum concentratie (in μg/mL) (https://www.biomerieux-microbio.com).
1.5.3.3 SensititreTM ARIS
SensititreTM Automatic Reading and Incubation System (ARIS, Thermo Scientific) is een geautomatiseerd overnacht incubatie- en afleesssysteem, ontwikkeld in het jaar 1980. Gestandaardiseerde 96-well microtiterplaten worden na innoculatie met de Sensititre Autoinoculator® in de incubator geplaatst. Bacteriegroei wordt fluorimetrisch gemonitord door hydrolyse van fluoroforen. Fluoroforen bestaan uit substraten gelinkt aan fluorescerende componenten, zoals het 4-methylumbelliferone. Deze complexen fluoresceren normaal niet, maar door bacteriegroei ontstaan specifieke enzymen die fluoroforen hydrolyseren. Hierdoor zullen de fluorescerende componenten, nu losgekoppeld van de substraten, fluoresceren onder UV- licht. Gevoelige bacteriën kunnen weinig of niet groeien in aanwezigheid van antibiotica waardoor geen fluorescentie waarneembaar zal zijn. Computer software rapporteert MIC’s (17,52).
1.5.3.4 MicroScan WalkAway® systeem
Het MicroScan WalkAway® systeem (Beckman Coulter) maakt gebruik van gestandaardiseerde 40- of 96- well microtiterplaten die manueel worden geïnoculeerd en daarna in het systeem worden geplaatst voor incubatie en analyse. Platen worden overnacht of een verkorte tijd geïncubeerd met respectievelijk een fotometrische en fluorimetrische detectie van bacteriegroei (17).
1.5.3.5 BD PhoenixTM
Het Becton Dickinson’s PhoenixTM paneel is een zelf-inoculerend polystyreen tray met 136 wells. Het paneel bestaat uit 51 wells gevuld met gedroogde biochemische substraten voor identificatie van bacteriën en 85 wells, waarvan één controle well, voor een antimicrobiële gevoeligheidstest met telkens een tweevoudige verdunningsreeks van elk antibioticum. Het PhoenixTM systeem detecteert bacteriegroei met behulp van een redox-indicator. Bacteriën die in de aanwezigheid van antibiotica kunnen groeien, leiden tot een kleuromslag van de indicator. Om de twintig minuten gebeurt een colorimetrische meting en een turbiditeitsmeting (55).
Tabel 1.1: Vergelijking automatische systemen.
Systeem Capaciteit Principe Resultaat AST
Vitek® 2 (bioMérieux) 64-well kaart met 1 - 6 concentraties van 9 - 20 antibiotica Turbidimetrische meting om de 15 minuten 4 – 10 uur SensititreTM ARIS (Thermo Scientific)
96-well microtiterplaten Fluorimetrische meting door hydrolyse van fluoroforen
18 - 24 uur MicroScan WalkAway® (Beckman Coulter) 40- of 96-well microtiterplaten
Verkorte incubatie: detectie fluorimetrisch Overnacht incubatie: detectie
fotometrisch
3,5 - 7 uur
18 uur of langer
BD PhoenixTM Polystyreen tray met 136
wells waarvan 85 wells voor AST
Colorimetrische meting (redox- reactie) en turbiditeitsmeting om
de 20 minuten