Regenwormen
De aanbevolen testsoort is Eisenia fetida (Savigny 1826), die behoort tot de familie Lumbricidae. Deze soort wordt sinds 1972 onderverdeeld in twee ondersoorten (Eisenia fetida and Eisenia andrei (10)). Volgens Jaenicke (36) gaat het om twee echte, afzonderlijke soorten. Eisenia fetida is gemakkelijk herkenbaar dankzij zijn felgele strepen tussen de segmenten, terwijl Eisenia andrei een egale, donkerrode kleur heeft. Oorspronkelijk zijn ze waarschijnlijk afkomstig uit het gebied rond de Zwarte Zee, maar tegenwoordig zijn ze wereldwijd verspreid, in het bijzonder in door de mens aangepaste habitats zoals composthopen. Beide soorten kunnen voor zowel ecotoxicologische als bioaccumulatietests worden gebruikt.
Eisenia fetida en Eisenia andrei zijn in de handel verkrijgbaar, bv. als visaas. In vergelijking met andere lumbricidenregenwormen hebben ze een korte levenscyclus en bereiken ze volwassenheid binnen ca. 2 – 3 maanden (bij kamertemperatuur). Hun optimale temperatuur is ongeveer 20 – 24°C. Ze geven de voorkeur aan relatief vochtige substraten met een nagenoeg neutrale pH en een hoog gehalte aan organisch materiaal. Aangezien deze soorten al 25 jaar veelvuldig worden gebruikt in gestandaardiseerde ecotoxicologische tests, zijn hun kweekmethoden uitvoerig beschreven (48) (77).
Beide soorten kunnen worden gekweekt in een grote diversiteit aan dierlijke afvalstoffen. Het door de ISO (35) aanbevolen kweekmedium is een 50:50-mengsel van paarden- of rundermest en turf. Het medium moet een pH-waarde van ongeveer 6 tot 7 hebben (gereguleerd met calciumcarbonaat), een lage ionische geleidbaarheid (minder dan 6 mS/cm of minder dan 0,5 % zoutconcentratie) en mag niet overmatig verontreinigd zijn met ammonia of dierlijke urine. Tevens kan in de handel verkrijgbare tuinaarde die vrij is van additieven of kunstmatige grond overeenkomstig OESO (48) of een mengsel van beide in een verhouding van 50:50 worden gebruikt. Het substraat dient vochtig maar niet te nat te zijn.
Kweekbakken met een volume van 10 tot 50 liter zijn geschikt.
Om wormen met een standaardleeftijd en -massa te verkrijgen kan de kweek het beste worden begonnen met cocons. Daartoe worden volwassen wormen in een kweekbak met vers substraat gestopt om cocons te produceren. De praktijk wijst uit dat een populatiedichtheid van ongeveer 100 volwassen wormen per kg substraat (natgewicht) tot goede voortplantingssnelheden leidt. Na 28 dagen worden de volwassen wormen verwijderd. De uit de cocons gekomen regenwormen worden na minimaal 2 maanden, maar minder dan 12 maanden, wanneer ze volwassen zijn, voor de tests gebruikt.
Wormen van de hierboven beschreven soorten kunnen als gezond worden beschouwd als ze zich door het substraat voortbewegen, niet proberen om het substraat te verlaten en zich voortdurend voortplanten. Zeer traag voortbewegen of een geel uiteinde aan de achterkant
409
van de worm (in het geval van Eisenia fetida) duidt op uitputting van het substraat. In dat geval wordt vers substraat en/of een kleiner aantal dieren per bak aanbevolen.
Selectie van aanvullende literatuur
Gerard BM (1964). Synopsis of the British fauna. No. 6 Lumbricidae. Linnean Soc. London, 6: 1-58.
Graff O (1953). Die Regenwürmer Deutschlands. Schr. Forsch. Anst. Landwirtsch. 7: 1-81.
Römbke J, Egeler P, Füll C (1997). Literaturstudie über Bioakkumulationstests mit Oligochaeten im terrestrischen Medium. Bericht für das UBA F + E 206 03 909, 86 S.
Rundgren S (1977). Seasonality of emergence in lumbricids in southern Sweden. Oikos 28:
49-55.
Satchell JE (1955). Some aspects of earthworm ecology. Soil Zoology (Kevan): 180-201.
Sims RW and Gerard BM (1985). A synopsis of the earthworms. Linnean Soc. London 31: 1-171.
Tomlin AD (1984). The earthworm bait market in North America. In: Earthworm Ecology - from Darwin to vermiculture. Satchell, J.E. (ed.), Chapman & Hall, London. 331-338 pp.
Enchytraeidae
De aanbevolen testsoort is Enchytraeus albidus, Henle 1837 (witte potworm). Enchytraeus albidus is een van de grootste soorten (tot 15 mm) van de tot de gelede wormen behorende Oligochaetae-familie van de Enchytraeidae en is wereldwijd verspreid, bv. (8). Enchytraeus albidus wordt aangetroffen in mariene, limnische en terrestrische habitats, hoofdzakelijk in ontbindend organisch materiaal (zeewier, compost) en zelden in weiden (42). Deze brede ecologische tolerantie en een aantal morfologische variaties duiden erop dat er mogelijk verschillende rassen voor deze soort bestaan.
Enchytraeus albidus is in de handel verkrijgbaar als voeding voor vissen. Gecontroleerd dient te worden of de cultuur verontreinigd is door andere, gewoonlijk kleinere soorten (60). Indien verontreiniging optreedt, moeten alle wormen met water worden gewassen in een petrischaal.
Grote volwassen exemplaren van Enchytraeus albidus worden vervolgens geselecteerd (met behulp van een stereomicroscoop) om een nieuwe cultuur te beginnen. Alle andere wormen worden verwijderd. De levenscyclus van de worm is kort, aangezien volwassenheid wordt bereikt tussen 33 dagen (bij 18 °C) en 74 dagen (bij 12 °C). Enkel culturen die zonder problemen gedurende ten minste 5 weken (één generatie) in het laboratorium zijn gehouden, mogen voor een test worden gebruikt.
Andere soorten van het geslacht Enchytraeus zijn ook geschikt, in het bijzonder Enchytraeus luxuriosus. Deze soort is een echte bodembewoner, zoals recentelijk is beschreven in (65).
Indien andere soorten van het geslacht Enchytraeus worden gebruikt, moeten ze duidelijk worden geïdentificeerd en moet de motivering van de keuze van de soort worden gerapporteerd.
410
Enchytraeus crypticus (Westheide & Graefe 1992) is een soort die tot dezelfde groep behoort als Enchytraeus luxuriosus. Het staat niet vast dat deze soort in het veld voorkomt, aangezien de soort alleen in regenwormculturen en composthopen is beschreven (Römbke 2003). De oorspronkelijk ecologische behoeften van de soort zijn derhalve onbekend. Recent laboratoriumonderzoek met diverse veldsubstraten heeft echter bevestigd dat deze soort een ruime tolerantie heeft voor grondeigenschappen als pH en textuur (Jänsch et al. 2005). In de afgelopen jaren is deze soort vaak gebruikt in ecotoxicologische studies vanwege de eenvoud van kweken en testen, bv. Kuperman et al. 2003. De soort is echter klein (3 – 12 mm;
gemiddeld 7 mm (Westheide & Müller 1996)) en dit maakt de hantering moeilijker in vergelijking met Enchytraeus albidus. Bij gebruik van deze soort in plaats van Enchytraeus albidus kan de omvang van het testvat kleiner zijn, maar dat hoeft niet.
Daarnaast moet in overweging worden genomen dat deze soort zich zeer snel voortplant met een generatietijd van minder dan 20 dagen bij 20 ± 2°C (Achazi et al. 1999) en zelfs sneller bij hogere temperaturen.
Enchytraeidae van de soort Enchytraeus albidus (alsmede andere Enchytraeus-soorten) kunnen worden gekweekt in grote plastic bakken (bv. 30 x 60 x 10 cm of voor een cultuur van kleine wormen 20 x 12 x 8 cm) die gevuld zijn met een mengsel van kunstmatige grond en in de handel verkrijgbare, niet verontreinigde tuinaarde zonder additieven.
Compostmateriaal moet worden vermeden, aangezien dat toxische stoffen zoals zware metalen zou kunnen bevatten. Voordat de kweekgrond wordt gebruikt, moet fauna eruit worden verwijderd door driemaal diepvriezen. Zuiver kunstmatige grond kan ook worden gebruikt, maar de voortplantingssnelheid zou langzamer kunnen zijn in vergelijking met gemengde substraten. Het substraat moet een pH van 6,0 ± 0,5 hebben. De cultuur wordt bij een temperatuur van 15 ± 2°C bewaard in een kweekbak zonder licht. In ieder geval moet een hogere temperatuur dan 23°C worden vermeden. De kunstmatige/natuurlijke grond moet vochtig zijn, maar niet nat. Wanneer zachtjes met de hand in de grond wordt geknepen, zouden slechts kleine waterdruppels moeten verschijnen. In ieder geval moeten anoxische omstandigheden worden vermeden (als bijvoorbeeld een deksel wordt gebruikt, moet het aantal gaten in het deksel groot genoeg zijn om voldoende luchtverversing te waarborgen).
De kweekgrond moet worden belucht door de grond eenmaal per week zorgvuldig te mengen.
De wormen moeten minimaal eenmaal per week ad libitum worden gevoederd met havervlokken die in een holte in het grondoppervlak worden geplaatst en met grond worden bedekt. Indien voedsel van het laatste voedertijdstip in de bak achterblijft, moet de hoeveelheid voedsel dienovereenkomstig worden aangepast. Als er schimmels op het achtergebleven voedsel groeien, moet het worden vervangen door een nieuwe hoeveelheid havervlokken. Om de voortplanting te stimuleren, kunnen de havervlokken om de twee weken worden verrijkt met in de handel verkrijgbaar proteïnepoeder met toegevoegde vitaminen. Na drie maanden worden de dieren overgebracht naar een vers voorbereide cultuur of kweeksubstraat. De havervlokken, die in een afgesloten verpakking moeten worden bewaard, moeten voor gebruik in een autoclaaf worden gesteriliseerd of verhit om infecties door meelmijten (bv. Glyzyphagus spp., Astigmata, Acarina) of roofmijten (bv.
Hypoaspis (Cosmolaelaps) miles, Gamasida, Acarina) te voorkomen. Na desinfectie wordt het voedsel vermalen, zodat het gemakkelijk op het grondoppervlak kan worden verspreid.
Andere mogelijke voedingsbronnen zijn bakkersgist of het visvoer TetraMin®.
In het algemeen zijn de cultuuromstandigheden toereikend als de wormen niet proberen het
411
substraat te verlaten, zich snel door de grond voortbewegen, een glanzend buitenoppervlak hebben waaraan geen gronddeeltjes kleven en een min of meer wittige kleur hebben en als wormen van verschillende leeftijden zichtbaar zijn. In feite kunnen wormen als gezond worden beschouwd als ze zich voortdurend voortplanten.
Selectie van aanvullende literatuur
Achazi RK, Fröhlich E, Henneken M, Pilz C (1999). The effect of soil from former irrigation fields and of sewage sludge on dispersal activity and colonizing success of the annelid Enchytraeus crypticus (Enchytraeidae, Oligochaeta). Newsletter on Enchytraeidae 6: 117-126.
Jänsch S, Amorim MJB, Römbke J (2005).Identification of the ecological requirements of important terrestrial ecotoxicological test species. Environ. Reviews 13: 51-83.
Kuperman RG, Checkai RT, Simini M, Phillips CT, Kolakowski JE, Kurnas CW, Sunahara GI (2003). Survival and reproduction of Enchytraeus crypticus (Oligochaeta, Enchytraeidae) in a natural sandy loam soil amended with the nitro-heterocyclic explosives RDX and HMX.
Pedobiologia 47: 651-656.
Römbke J (2003). Ecotoxicological laboratory tests with enchytraeids: A review.
Pedobiologia 47: 607-616.
Westheide W and Graefe U (1992). Two new terrestrial Enchytraeus species (Oligochaeta, Annelida). J. Nat. Hist. 26: 479-488.
Westheide W and Müller MC (1996). Cinematographic documentation of enchytraeid morphology and reproductive biology. Hydrobiologia 334: 263-267."