Pharmacoresistance in epilepsy : modelling and prediction of disease progression
Liefaard, C.
Citation
Liefaard, C. (2008, September 17). Pharmacoresistance in epilepsy : modelling and prediction of disease progression. Retrieved from https://hdl.handle.net/1887/13102
Version: Corrected Publisher’s Version
License: Licence agreement concerning inclusion of doctoral thesis in the Institutional Repository of the University of Leiden
Downloaded from: https://hdl.handle.net/1887/13102
Note: To cite this publication please use the final published version (if applicable).
Inleiding
Epilepsie is een ziekte die al lang bekend is en waartegen dan ook al sinds eeuwen therapie¨en gezocht zijn. Aan het begin van onze jaartelling beschreef Celsus dat epilepsie bestreden kon worden door het drinken van bloed afkomstig van een gladiator, of een aderlating uit de enkels of het achterhoofd. Zijn conclusie hierbij was dat indien dit niet hielp, de ziekte waarschijnlijk levenslang zou zijn.
Hoewel er sinds de tijd van Celsus veel meer bekend is geworden over epilepsie en er veel anti-epileptica beschikbaar zijn gekomen, zijn deze middelen bij ongeveer 30% van de epilepsie pati¨enten niet afdoende en kunnen de epileptische aanvallen niet of slechts gedeeltelijk onderdrukt worden. De mate waarin deze zogenaamde farmacoresistentie optreedt, is verschillend van pati¨ent tot pati¨ent: sommigen zijn nooit aanvalsvrij, terwijl anderen in het begin goed reageren op de anti-epileptica, maar na verloop van de tijd farmacoresistent worden. De mechanismen die ten grondslag liggen aan het ontstaan van farmacoresistentie zijn grotendeels onbekend. Het bestuderen van deze mechanismen is dan ook een belangrijk onderwerp binnen het epilepsie onderzoek.
In de literatuur zijn verschillende hypotheses geformuleerd over de mechanismen die farmacoresistentie tegen anti-epileptica veroorzaken. De twee belangrijkste hypotheses stellen dat (a) de geneesmiddelen niet op de plaats van werking kunnen komen door veranderingen in de bloed-hersen barri`ere, of (b) de receptoren waarop de geneesmiddelen aangrijpen veranderd zijn, waardoor de anti-epileptica hun werk niet meer kunnen doen. Het onderzoek in dit proefschrift richtte zich op het tweede concept, waarbij veranderingen in de GABAA receptor gedurende het proces van ontstaan en ontwikkeling van epilepsie werden bestudeerd. GABA is de belangrijkste inhiberende neurotransmitter in de hersenen. Verminderde effectiviteit van het GABAerge systeem zal dan ook leiden tot verhoogde excitatie, waardoor epileptische aanvallen kunnen ontstaan.
De GABAAreceptor is daarom interessant als doelwit voor anti-epileptica.
Een vorm van epilepsie waarbij farmacoresistentie vaak optreedt, is temporaalkwab epilepsie. Deze vorm van epilepsie heeft een karakteristiek ziekteverloop: het wordt meestal veroorzaakt door een hersenbeschadiging na bijvoorbeeld koortsstuipen, hersenvliesontsteking of een ernstig tekort aan zuurstof voor of tijdens de geboorte. Na een periode van enkele jaren waarin geen epileptische aanvallen optreden, de zogenaamde latente periode, ontwikkelen zich ernstige motorische aanvallen, die meestal ongevoelig zijn voor anti-epileptica en een progressief karakter hebben.
Als onderzoekshypothese voor dit proefschrift was gesteld dat al ten gevolge van die allereerste gebeurtenis veranderingen in de GABAA receptor optreden, die uiteindelijk
158 Pharmacoresistance in epilepsy
leiden tot een verminderde effectiviteit van anti-epileptica. Dit betekent dat de receptor dus al verandert gedurende de latente periode voorafgaand aan het ontstaan van spontane aanvallen. Om deze hypothese te testen, werd onderzoek gedaan in diermodellen van epilepsie, waarbij enerzijds gezocht werd naar biomarkers waarmee de ontwikkeling van epilepsie kan worden gevolgd, en anderzijds de expressie en functionaliteit van de GABAA
receptor werd bestudeerd.
Voor de data analyse werden concepten van populatie “pharmacokinetic- pharmacodynamic” (PK-PD) modellering gebruikt. Bij PK-PD modellering wordt de geneesmiddelconcentratie (farmacokinetiek, PK) gerelateerd aan het geneesmiddeleffect (farmacodynamiek, PD) door middel van wiskundige modellen. Wanneer bovendien rekening gehouden wordt met mogelijke variatie tussen individuen binnen een populatie met behulp van stochastische modellen spreken we van populatie modellering. Dit heeft als voordeel dat alle data gemeten binnen een bepaalde populatie simultaan geanalyseerd kunnen worden, wat meer statistisch onderscheidingsvermogen oplevert. Verder kan met behulp van zogenaamde covariaten onderzocht worden door welke factoren de variatie binnen een populatie wordt veroorzaakt. Een voorbeeld hiervan is variatie in het maximale effect van een geneesmiddel, wat bijvoorbeeld verklaard kan worden door verschillen in receptor dichtheid. Wanneer deze laatste grootheid ook gemeten kan worden, kan de relatie tussen receptor dichtheid en maximaal effect onderzocht en in het model ge¨ımplementeerd worden.
Een diermodel dat het ziekteverloop van temporaalkwab epilepsie goed nabootst is het post-status epilepticus model. Hierbij wordt een status epilepticus (een aaneengesloten reeks van aanvallen) opgewekt in ratten, bijvoorbeeld door injecties met kainaat. Na een latente periode van enkele weken treden spontane epileptische aanvallen op. Een nadeel van dit diermodel is de hoge variabiliteit: sommige dieren ontwikkelen vrijwel geen spontane aanvallen, terwijl in andere dieren meerdere aanvallen per dag waargenomen worden. Daarom is voor enkele experimenten waar minder variabiliteit gewenst was een ander model, het amygdala kindling model, gebruikt. In dit model wordt de amygdala van de ratten electrisch gestimuleerd volgens een specifiek protocol, waardoor de dieren na verloop van tijd verhoogd gevoelig zijn voor het opwekken van een epileptische aanval.
Biomarkers om de ontwikkeling van epilepsie te kwantificeren
Om de hypothese te kunnen toetsen dat de GABAAreceptor al verandert tijdens de latente periode, is het van belang biomarkers te vinden waarmee de ontwikkeling van epilepsie ook tijdens die periode kan worden gekwantificeerd. Daarom werden de volgende twee methodes geselecteerd: (a) het meten van de drempel voor het opwekken van een epileptische aanval met behulp van electrische stimulatie van de cortex en (b) het kwantificeren van de synchronisatie tussen beide hersenhelften gebaseerd op de detectie van pieken in het EEG.
Maat voor de exciteerbaarheid van de hersenen
Stimulatie van de cortex met behulp van een trein van electrische pulsen, die toenemen in stroomsterkte, resulteert in het opwekken van een epileptische aanval die gekarakteriseerd wordt door een vast patroon van gedragscomponenten. Door de duur van de stimulatie, en dus de stroomsterkte van de pulsen te vari¨eren kan de ernst van deze aanval gecontroleerd worden. Op deze manier kan ook bepaald worden wat de drempel is voor het opwekken van een bepaalde gedragscomponent. Een voorbeeld hiervan is de drempel voor clonische activiteit: de TLS. In hoofdstuk 3 werd onderzocht of de TLS gebruikt kan worden als maat voor de exciteerbaarheid van de hersenen. Hiermee zou de progressie van epilepsie in het post-status epilepticus diermodel gekwantificeerd kunnen worden.
Omdat bij epilepsie de hersenen verhoogd exciteerbaar zijn, werd verwacht dat de TLS lager zou zijn in epileptische dan in controle dieren. De resultaten in hoofdstuk 3 laten echter zien dat de drempel zelfs tot vier weken na de inductie van een status epilepticus verhoogd is. Om te onderzoeken waardoor deze verhoging veroorzaakt wordt, werd een aanval, opgewekt op dag 28 na status epilepticus, geanalyseerd door middel van gedragsanalyse. De resultaten van dit experiment laten zien dat er na status epilepticus nog steeds clonische activiteit aanwezig is en dat het patroon waarmee de gedragscomponenten optreden bij electrische stimulatie van de cortex kwalitatief niet is veranderd. Er kan dus geconcludeerd worden dat de TLS een valide maat is, ook na de inductie van status epilepticus, en dat deze drempel inderdaad verhoogd is. Een mogelijke oorzaak hiervoor kan een beschermend mechanisme zijn, dat ontstaat als gevolg van epilepsie en het optreden van epileptische aanvallen.
Een interessant resultaat van de gedragsanalyse is dat, ondanks het feit dat de convulsie kwalitatief niet verschillend is in epileptische en controle dieren, er wel kwantitatieve verschillen te zien zijn in het voorkomen van aanvalscomponenten. Zo werd in epileptische ratten significant minder clonische activiteit in de aangezichtsspieren en voorpoten waargenomen, maar juist meer tonische aanvalscomponenten. Het is bekend dat verschillende hersengebieden verantwoordelijk zijn voor het ontstaan van deze specifieke gedragscomponenten. Ondanks het feit dat de huidige resultaten niet voldoende zijn om hierover conclusies te trekken, geven ze wel aan dat gedragsanalyse een interessante techniek is om veranderingen in hersengebieden te bestuderen.
Kwantificatie van de synchronisatie tussen hersenhelften
De tweede potentile biomarker was het kwantificeren van de synchronisatie tussen beide hersenhelften gebaseerd op de detectie van pieken in het EEG, gemeten op de cortex van de rat. Hiervoor werd een piek gedefinieerd als een uitslag in het EEG met een maximum dat groter of kleiner was dan vier maal de standaarddeviatie van het controle EEG. De mate van synchronisatie werd bepaald aan de hand van het simultaan detecteren van pieken in beide hersenhelften, waarbij een vertraging van maximaal 6 ms werd toegestaan.
160 Pharmacoresistance in epilepsy
Met deze methode werd uiteindelijk het aantal pieken per tijdseenheid (ER) berekend voor beide hersenhelften, alsmede de synchronisatie tussen de hersenhelften (Q).
Wanneer het EEG, opgenomen tijdens de inductie van status epilepticus geanalyseerd wordt met de hierboven beschreven methode, kunnen er 4 fasen onderscheiden worden die verschillen in ER en Q (hoofdstuk 4). Tijdens de inductie van status epilepticus vertonen de ratten verschillende in ernst toenemende epileptische aanvallen volgens een bepaald patroon. In eerste instantie hebben de dieren alleen perioden van immobiliteit, vervolgens aanvallen met krampen in de aangezichtsspieren, die zich daarna uitbreiden naar de voor– en achterpoten, waarna tenslotte convulsies met algehele verkramping van het lijf optreden. Alhoewel het gedrag niet continu geobserveerd werd, viel het op dat deze verschillende aanvalstypen samenvielen met de vier EEG fasen.
De analyse methode werd ook toegepast om het EEG opgenomen gedurende vier weken in een post-status epilepticus rat te analyseren (hoofdstuk 4). Dit liet een interessant tijdsprofiel zien. Tijdens de status epilepticus werden veel pieken gedetecteerd, die in hoge mate gesynchroniseerd waren, resulterend in hoge waarden voor ER en Q gedurende ongeveer twee dagen. Tot dag 6 na de inductie van status epilepticus zakten beide parameters tot onder de basislijn, waarna in eerste instantie periodieke toenamen van ER waargenomen werden, gecorreleerd met toename van Q, totdat vanaf dag 12 post-status epilepticus zowel ER als Q langzaam maar voortdurend toenamen.
In een controle rat werden weliswaar pieken waargenomen, maar deze waren niet gesynchroniseerd. Verder werden er in deze rat geen veranderingen in ER of Q gedurende de tijd waargenomen.
Samenvattend laten de resultaten zien dat het mogelijk is om met deze analyse methode verschillen tussen epileptische en controle dieren te kwantificeren, zowel tijdens als na inductie van status epilepticus. Kwantificeren van synchronisatie gebaseerd op piek- detectie in het EEG is dan ook een veelbelovende biomarker om de ziekteprogressie van epilepsie in kaart te brengen.
De GABAAreceptor in epilepsie
Kwantificatie van de receptor expressie in vivo
Om de receptor expressie in vivo te meten, is positron emission tomography (PET) een veel gebruikte techniek. Hierbij wordt een stof ingespoten die gemerkt is met een radioactief isotoop. Om de expressie van de GABAA receptor te meten, wordt de antagonist flumazenil, gemerkt met11C, gebruikt. Met behulp van een PET scanner kan de locatie van deze stof als functie van de tijd gemeten worden. Vervolgens kan hiermee door middel van wiskundige modellen de receptor expressie (Bmax) en de affiniteit van flumazenil voor de receptor (KD) berekend worden.
Hoofdstuk 5 beschrijft de ontwikkeling van een methode om beide parameters simultaan in ´e´en experiment te bepalen. Hiertoe werd een verzadigingsdosering van flumazenil toegediend, resulterend in een maximale bezetting van de GABAAreceptoren.
Vervolgens werden gedurende een half uur de concentratie-tijd profielen in de hersenen
en het bloed gemeten. Omdat flumazenil snel geklaard wordt in de rat, wordt binnen de tijd van een half uur het volledige bereik van de receptor bezetting bestreken. De concentratie-tijd profielen werden simultaan geanalyseerd met behulp van populatie PK- PD modellering, resulterend in betrouwbare schattingen van zowel Bmaxals KD.
Deze nieuwe methode is een belangrijke verbetering ten opzichte van bestaande methodes, omdat bij de laatstgenoemde methodes meerdere PET scans nodig zijn om zowel Bmax als KD te kunnen bepalen. Bij de in hoofdstuk 5 beschreven methode daarentegen, wordt gebruik gemaakt van het volledige bereik van receptor bezetting, gemeten in ´e´en experiment, waardoor de parameters simultaan bepaald kunnen worden.
Vervolgens werd de ontwikkelde methode toegepast om de eigenschappen van de GABAA receptor in het amygdala kindling model voor epilepsie te bepalen. Zoals in hoofdstuk 6 beschreven is, blijkt de receptor expressie in deze dieren afgenomen te zijn met 36% ten opzichte van controle ratten. Dit komt overeen met een afname van 28% in effectiviteit van midazolam, een allostere modulator van de GABAAreceptor, in hetzelfde diermodel, zoals beschreven door Cleton en collega’s. Verder bleek het distributievolume in de hersenen verhoogd te zijn, wat duidt op een mogelijke verandering in het transport van flumazenil over de bloed-hersenbarri`ere.
De resultaten laten dus zien dat de verminderde effectiviteit van midazolam toegeschreven kan worden aan een lagere expressie van de GABAAreceptor. Verder werd hierbij aangetoond dat deze nieuwe methode gebruikt kan worden om zowel de receptor expressie, als de affiniteit van het ligand voor de receptor te bepalen in ´e´en experiment.
Omdat het een in vivo techniek betreft, kunnen er meerdere PET studies in ´e´en dier gedaan worden, zodat de receptor expressie gedurende de ontwikkeling van epilepsie als functie van de tijd gemeten kan worden.
Functionaliteit van de GABAAreceptor in epilepsie
In de hoofdstukken 7 en 8 is de functionaliteit van de GABAAreceptor onderzocht in het post-status epilepticus diermodel. Hiervoor werd het effect van verschillende GABAerge liganden op de amplitude van de β-frequentie band (11.5–30 Hz) van het EEG op dag 4 en/of dag 14 na inductie van status epilepticus gemeten. Toename in de amplitude van deze frequentieband is een maat voor versterking van GABAerge inhibitie door deze stoffen. De concentratie-werking relaties van de verschillende liganden werden vervolgens geanalyseerd met behulp van populatie PK-PD modellering.
Het eerste ligand was de allostere modulator midazolam. Het maximale effect van midazolam was verlaagd met 48% op dag 4 en zelfs met 74% op dag 14 na status epilepticus, zoals beschreven in hoofdstuk 7. Ex vivo bindingsstudies met flumazenil, gemerkt met3H, in de hersenen van deze ratten lieten zien dat de binding weliswaar afgenomen was in de epileptische dieren ten opzichte van controles, maar niet in dezelfde mate als de verlaging van het maximale midazolam EEG effect.
Er zijn verschillende mogelijke oorzaken die dit verschil kunnen verklaren. Om te beginnen is midazolam een allostere modulator, hetgeen betekent dat het GABA nodig
162 Pharmacoresistance in epilepsy
Figuur 1: De GABAA receptor. Een subunit van de GABAA receptor bestaat uit vier transmembraan segmenten met een extracellulaire NH2en COOH terminus, zoals schematisch weergegeven in onderdeel A.
In onderdeel B is een van de meest voorkomende subunit composities, opgebouwd uit twee α1, twee β2
en ´e´en γ2 subunit, weergegeven. Een dwarsdoorsnede laat het chloride kanaal van de receptor zien.
In de onderdelen C en D worden twee GABAA receptoren met verschillende subunit samenstellingen vergeleken. Wanneer de γ2 subunit vervangen wordt door een δ subunit (vergelijk C met D) kunnen benzodiazepines (BZD), zoals midazolam, niet meer binden. Deze figuur is eerder gepubliceerd in Neurotherapeutics, 2007;4(1):18–61, en overgenomen met toestemming van Elsevier.
heeft om effectief te zijn. Indien er dus minder GABA aanwezig zou zijn als gevolg van epilepsie, kan het effect van midazolam lager zijn, zonder dat de binding van flumazenil afneemt. Om dit te onderzoeken, werd het effect van tiagabine bestudeerd (hoofdstuk 8).
Tiagabine remt de heropname van GABA in de synaptische spleet, zodat GABA langer in de nabijheid van de receptor aanwezig is. De effectiviteit van tiagabine bleek onveranderd te zijn na status epilepticus. Omdat dit dus feitelijk het effect van GABA weergeeft, kan geconcludeerd worden dat het GABAerge effect zelf intact blijft.
Een andere mogelijke verklaring is dat de populaties GABAA receptoren betrokken bij het EEG effect van midazolam en de binding van flumazenil niet exact dezelfde zijn.
Zowel de binding van flumazenil als het EEG werden gemeten in de cortex. Het zou echter kunnen dat de GABAA receptoren die betrokken zijn bij het midazolam effect op het EEG zich niet uitsluitend in de cortex bevinden. Deze suggestie wordt ondersteund door de waarneming dat het sederend effect van midazolam niet afgenomen was, zelfs niet in ratten waarin vrijwel geen EEG effect van midazolam te zien was.
Tenslotte kan een verandering in subunit samenstelling van de GABAA receptor een rol spelen. De GABAA receptor is namelijk opgebouwd uit vijf verschillende subunits, die samen een chloride kanaal vormen (zie figuur 1). Momenteel zijn er 19
verschillende subunits van de GABAAreceptor bekend: 6α, 3β, 3γ, 1δ, 1ε, 1π, 1θ, and 3ρ subunits. De combinatie van subunits bepaalt de farmacologische en electrofysiologische eigenschappen van de receptor. Zo is bijvoorbeeld bekend dat benzodiazepines, waar midazolam er ´e´en van is, γ2 nodig hebben om te kunnen binden, terwijl flumazenil minder afhankelijk is van de subunit samenstelling van de receptor.
Om dit verder te onderzoeken, is de effectiviteit van de neurosteroid alphaxalone bepaald. Alphaxalone heeft een voorkeur voor GABAA receptoren met een δ subunit.
In tegenstelling tot alphaxalone, bindt midazolam niet aan deze receptoren. Zoals in hoofdstuk 8 beschreven staat, is de effectiviteit van alphaxalone op dag 14 na status epilepticus verhoogd, in plaats van verlaagd. Samen met de waarneming dat de effectiviteit van midazolam sterk verlaagd is, wat slechts gedeeltelijk samenging met een verlaging in de binding van flumazenil en een onveranderde effectiviteit van tiagabine suggereert dit een selectieve verandering van de GABAAreceptor na status epilepticus.
Algemene conclusies
Het onderzoek beschreven in dit proefschrift heeft aangetoond dat kwantificeren van de synchronisatie tussen beide hersenhelften, gebaseerd op de detectie van pieken in het EEG, interessante biomarkers biedt om de ziekte progressie van epilepsie te kwantificeren en continu te meten. De TLS bleek echter niet bruikbaar te zijn als maat voor de exciteerbaarheid van het brein. De resultaten van deze experimenten wezen wel op een beschermend mechanisme dat ontstaat ten gevolge van epilepsie of epileptische aanvallen.
Om de expressie van de GABAA receptor in vivo te meten, is een nieuwe methode ontwikkeld, waarmee in ´e´en PET experiment zowel de receptor expressie, als de affiniteit van een ligand voor de receptor gemeten kan worden. Experimenten in het amygdala kindling model lieten zien dat het mogelijk was om met deze methode veranderingen in receptor expressie te meten. Op deze manier kunnen dus veranderingen in de expressie van de GABAAreceptor als gevolg van de progressie van epilepsie gemeten worden.
Tenslotte duidt de waargenomen sterk verminderde effectiviteit van midazolam en de verhoogde effectiviteit van alphaxalone erop dat de GABAA receptor niet zozeer verdwijnt, als wel verandert in epilepsie. Omdat midazolam en alphaxalone selectief zijn voor twee verschillende receptor subtypes, wijst dit op een verandering in subunit samenstelling van de receptor. Wanneer gebruik gemaakt wordt van liganden die selectief zijn voor andere receptor subtypes, zal dit meer kennis van mechanismen die ten grondslag liggen aan de progressie van epilepsie en farmacoresistentie opleveren. Het unieke van de gebruikte methode is dat de veranderingen in receptor subtypes in vivo bestudeerd worden, zodat deze veranderingen gedurende de tijd gemeten kunnen worden en vervolgens gerelateerd aan de progressie van epilepsie.
Alle experimenten beschreven in dit proefschrift zijn uitgevoerd in diermodellen voor epilepsie. Uiteindelijk moeten de resultaten uiteraard vertaald worden naar de klinische situatie. Omdat de gebruikte technieken ook gebruikt kunnen worden in pati¨enten, zal dit de vertaalslag naar de kliniek vereenvoudigen.
