University of Groningen Contributions to the study of the complement system in IgA nephropathy and dialysis Albuquerque Pereira Oliveira, António Bernardo

(1)

Contributions to the study of the complement system in IgA nephropathy and dialysis

Albuquerque Pereira Oliveira, António Bernardo

DOI:

10.33612/diss.154427061

IMPORTANT NOTE: You are advised to consult the publisher's version (publisher's PDF) if you wish to cite from it. Please check the document version below.

Document Version

Publisher's PDF, also known as Version of record

Publication date: 2021

Link to publication in University of Groningen/UMCG research database

Citation for published version (APA):

Albuquerque Pereira Oliveira, A. B. (2021). Contributions to the study of the complement system in IgA nephropathy and dialysis. University of Groningen. https://doi.org/10.33612/diss.154427061

Copyright

Other than for strictly personal use, it is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of the author(s) and/or copyright holder(s), unless the work is under an open content license (like Creative Commons).

Take-down policy

If you believe that this document breaches copyright please contact us providing details, and we will remove access to the work immediately and investigate your claim.

Downloaded from the University of Groningen/UMCG research database (Pure): http://www.rug.nl/research/portal. For technical reasons the number of authors shown on this cover page is limited to 10 maximum.

(2)

551753-L-bw-Faria 551753-L-bw-Faria 551753-L-bw-Faria 551753-L-bw-Faria Processed on: 15-12-2020 Processed on: 15-12-2020 Processed on: 15-12-2020

Processed on: 15-12-2020 PDF page: 209PDF page: 209PDF page: 209PDF page: 209

A

APPENDICES

Samenvatting en Discussie

Sumário e Discussão

Acknowledgments

About the author

(3)

210

SAMENVATTING EN DISCUSSIE

Dysregulatie of overmatige activering van het complement systeem wordt beschouwd als een fundamenteel aspect van de pathogenese van een breedspectrum van immuuncomplex-gemedieerde ziektes en ontstekingsaandoeningen. De goedkeuring voor de complement remmer eculizumab door de Amerikaanse Food & Drug Administration (FDA), onderschrijven de effectiviteit van complement-gerichte therapieën en verhoogde daarmee de interesse in het klinische gebruik ervan, vooral bij nieraandoeningen. Eculizumab is een monoklonaal antilichaam gericht tegen C5 en werd als eerst goedgekeurd in 2007 voor de behandeling van paroxismale nachtelijke hemoglobinurie (PNH) en daarna in 2011 voor de zeldzame nierziekte atypische hemolytisch uremisch syndroom (aHUS).1_{Verder zijn er in de afgelopen jaren ook lessen}

getrokken uit de klinische ervaring die werd opgedaan met het gebruik van eculizumab en heeft dit ervoor gezorgd dat de huidige kennis over de werking van het complement systeem verbetert is. Er zijn echter ook nog steeds resterende en opkomende uitdagingen voor complement-gerelateerde nierziekte die verder onderzocht moeten worden. Met name de klinische studies waarbij eculizumab niet effectief bleek in andere complement-gemedieerde aandoeningen zoals C3-glomerulopathie en niertransplantatie vormt een onderwerp voor toekomstig onderzoek.1_{Dit wijst er ook op dat het hanteren}

van dezelfde aanpak niet perse bevorderlijk is voor alle complement-gemedieerde aandoeningen, en dat een subtielere en verfijndere benadering nodig is per individuele ziekte om de complement cascade te moduleren. Het complement systeem is hier uitermate geschikt voor omdat medicijnen kunnen ingrijpen op verschillende niveaus van de cascade (d.w.z. de activatoren, de convertases, de complement receptoren en de regulatoren). Daarnaast kan een nauwkeurige identificatie van (sub)groepen van patiënten die baat hebben bij complement-gerichte therapieën bijdragen tot het succes ervan. Om deze stap te kunnen maken is er een beter begrip nodig van de mechanismen die betrokken zijn bij complement activering in nierziekten, zowel bij pathologie die de progressie tot nierfalen aanstuurt, als in het uremische milieu bij patiënten met vergevorderde nierziekte. Ook is de identificatie van geschikte biomarkers, die deze processen vertegenwoordigen, essentieel om de toepassing van complement-gerichte behandelingen te vergroten. Het doel van deze therapie is het vertragen en voorkomen van nierfalen en het verlagen van de morbiditeit en mortaliteit die gezien wordt bij dialyse patiënten.

(4)

211

Het werk dat in dit proefschrift wordt gepresenteerd, levert een belangrijke bijdrage aan de huidige kennis over de betrokkenheid van het complement systeem in (1) verschillende ziektes die kunnen leiden tot nierfalen en (2) de chronische ontstekingsreactie in dialysepatiënten. Dit proefschrift laat zien, dat bij een veel voorkomende nierziekte zoals IgA-nefropathie (IgAN), C4d depositie in de glomeruli en in de arteriolen een subgroep van patiënten identificeert met een slechtere prognose. Deze marker kan daarom van belang zijn om patiënten met IgAN te identificeren die baat kunnen hebben bij een andere (dan wel agressievere) klinische benadering. Ook werd aangetoond dat bij hemodialyse (HD) patiënten een verhoogde intra-dialytische C3d over C3-ratio, als maat voor complementactivering, er een verhoogd risico bestaat op het ontstaan van hart- en vaatziekten. Bovendien werd bij dialyse patiënten en patiënten met een chronische nierziekte complement activie gezien nadat zij intraveneuze ijzerformuleringen kregen toegediend, in het bijzonder het middel ijzersucrose. Deze bevinding moet wellicht worden toegevoegd aan de lijst met mogelijke bijwerkingen van dit medicijn, wat vaak wordt toegediend bij dialyse patiënten. Ten slotte werd bij peritoneale dialyse (PD) aangetoond dat zowel lokale als systemische complement activatie plaatsvond via verschillende routes. Het meest opvallende is hierbij dat de systemische complement activatie in PD significant hoger was dan bij HD-patiënten.

De ontdekking van de betrokkenheid van de lectine route (LP) bij een subgroep van IgAN-patiënten heeft nieuwe wegen geopend voor verder onderzoek naar complement in IgAN,2_{en heeft de vroege ontdekking dat complement mogelijk betrokken is bij}

deze ziekte uitgebouwd.3,4_{IgAN is een uiterst heterogene nierziekte, zowel op het}

gebied van histologische bevindingen als op ziekteverloop. IgAN vereist daarom een behandeling op maat, die niet alleen bepaald moet worden door proteïnurie, hypertensie en nierfunctie. De huidige aanpak voor nierziekten is voornamelijk gebaseerd op histologische bevindingen, in tegenstelling tot andere gebieden van de geneeskunde, zoals oncologie, waar het gebruik van immunohistologische biomarkers en genetische benaderingen essentieel zijn geworden voor een behandeling op maat. Indien goed geïmplementeerd, kunnen deze nieuwe benaderingen zich ook vestigen als onderdeel van de standaardzorg voor nieraandoeningen.5_{Daarom werd}

in Hoofdstuk 2 voorgesteld om een immunohistologisch panel van biomarkers te

gebruiken voor IgAN, met daarin o.a. de combinatie van glomerulaire C4d depositie en tubulointerstitiële influx van CD3-positive cellen (een T-cel maker, wat wijst op ontsteking). Daarnaast onderschrijft dit hoofdstuk de voorspellende rol van mesangiale

(5)

212

C4d in IgAN-patiënten, zoals eerder was beschreven.6,7_{Deze aanpak benadrukt ook de}

betrokkenheid van de glomerulaire-tubulaire uitwisseling in IgAN en het belang van tubulo-interstitiële ontsteking bij de achteruitgang van de nierfunctie bij deze ziekte.8

Daarnaast heeft het vasculaire compartiment in IgAN een hernieuwde belangstelling verkregen vanwege recente studies die aantoonde dat een subgroep van IgAN patiënten microangiopathische laesies heeft en dat dit gelinkt is aan een slechtere prognose.9–11_In

Hoofdstuk 3 hebben wij daarom onze analyse van C4d in IgAN uitgebreid tot arteriolaire

depositie en ontdekten wij dat dit zowel geassocieerd was met andere vasculaire laesies als met ziekteprogressie. Samengevat onderstrepen deze studies de potentiële rol die C4d zou kunnen spelen bij het voorspellen van uitkomsten in IgAN patiënten, en breidden de toepassingen van C4d depositie zich nu uit tot de arteriolen. Dit maakt C4d een uitermate geschikte biomarker, daarnaast wordt C4d al veel wordt gebruikt in de kliniek, vooral bij afstoting na transplantatie. C4d kan daarom makkelijk toegevoegd worden aan de huidige analyses bij IgAN biopsieën, waarbij zowel de glomerulaire als de vasculaire compartimenten relevante en complementaire informatie bevatten. Hoewel de meeste onderzoeken naar complement in nieraandoeningen zich richt op de bijdrage van dit systeem aan de progressie tot nierfalen, bestaat er een groeiende interesse in de bijdrage van het complement systeem aan de systemische inflammatoire reactie bij vergevorderde nieraandoeningen.12,13_{Daarop voortbordurend wordt in}_{Hoofdstuk 4 de}

huidige kennis over het complement systeem in dialyse uit de literatuur samengevat. Bij zowel HD als PD lijkt bio-incompatibiliteit een belangrijke factor te zijn die leidt tot complement activatie. In het geval van de HD ontstaat complement activatie door de herhaaldelijke blootstelling van het bloed aan het extracorporale circuit, met name dialysemembraan. In PD lijkt complement activatie in de peritoneale holte te ontstaan door de constante blootstelling aan de dialysevloeistof. De blootstelling hiervan zou mogelijk op het peritoneale membraan leiden tot het verlies van de, constitutief tot expressie gebrachte, complementregulatoren.14_{Op basis van de huidige literatuur,}

stellen wij dat complement activatie tijdens HD geïnitieerd wordt door de lectine en waarschijnlijk ook de alternatieve route en dat dit vervolgens tot ontsteking en stollingsproblematiek leidt.15,16_{In PD lijken de klassieke route en alternatieve route}

verantwoordelijk te zijn voor de complement activering.17,18

Hoofdstuk 5 onderzoekt de rol die het complement systeem speelt in het ontstaan

van hart- en vaatziekten in HD patiënten. Intradialytische complement activatie trad voornamelijk op bij de HD patiënten die later hart- en vaatziekten ontwikkelen.

(6)

213

Bovendien ging de complement activatie, die bij deze patiënten werd waargenomen, gepaard met een versterkte trombo-inflammatoire respons. Dit suggereert dat, in HD, het mechanisme achter het hogere cardiovasculaire risico, mogelijk gedeeltelijk, kan worden toegeschreven aan complement activatie en de daaropvolgende ontsteking en stolling. Naast deze mogelijke langetermijneffecten van complement activatie in HD patiënten, zijn deze bevindingen ook een belangrijke reden voor verder onderzoek naar een mogelijke link tussen complement activatie en andere belangrijke uitkomsten in HD. Hierbij kan gedacht worden aan de toegenomen rapportage van dialysereacties tijdens HD en de nog steeds slecht gedefinieerde etiologie van de veelvoorkomende plotselinge hartdood tijdens de initiële dialysesessies.19,20

Blootstelling aan een extracorporaal circuit of bioincompatibele dialysevloeistoffen zijn niet de enige bron van de ontstekingsreactie bij dialysepatiënten. De herhaaldelijke toediening van medicijnen, zoals intraveneuze ijzermedicamenten, kan ook bijdragen aan de chronische ontstekingen in deze patiënten.21,22_{Hoewel een recente studie de}

bezorgdheid over intraveneuze ijzerbehandelingen heeft geprobeerd weg te nemen,23

blijven er veel vragen onbeantwoord over de mogelijke bijdrage van herhaalde ijzertoedieningen aan het inflammatoire-uremische milieu en het verhoogde risico op infectie en hart- en vaatziekten in de dialysepopulatie. Bovendien zijn er aanwijzingen dat ijzerbehandelingen kunnen leiden tot ijzerstapeling, anafylactische reacties, oxidatieve stress, atherosclerose en cognitieve stoornissen.22,24,25_{Onlangs heeft onze}

groep voor het eerst aangetoond dat ijzermedicamenten het complement systeem in

vitro kunnen activeren, daardoor is het concept dat intraveneuze ijzermedicamenten

kunnen leiden tot complement activatie-gerelateerde pseudoallergieën (CARPA) waarschijnlijker geworden.26_{Vooral de mate van complement activatie die gezien}

werd bij toediening van ijzerdextran zou kunnen leiden tot het optreden van klinische overgevoeligheidsreacties.26_{Dit motiveerde ons tot het doen van een klinische studie,}

om te kijken of complement activatie door ijzermedicamenten ook in vivo optreedt.

In Hoofdstuk 6 lieten wij zien dat in verschillende patiëntengroepen toediening van

ijzertherapie leidt tot een significante toename van systemische complement activatie. Hierbij hebben wij gekeken naar patiënten met chronische nieraandoeningen maar ook naar patiënten met bloedarmoede vanwege andere oorzaken. Zelfs in HD-patiënten zagen wij een significante mate van complement activatie door de ijzertherapie, ondanks het feit dat de hemodialyse sessie zelf ook verantwoordelijk is voor een aanzienlijke toename in complement activatie. Hoewel de toename door ijzermedicamenten

(7)

214

significant was, was het niet voldoende om een acute klinisch reactie te veroorzaken. Dit is niet verrassend, aangezien overgevoeligheidsreactie zeldzaam zijn en de gevonden complement activatie lager was dan de voorgestelde hoeveelheid om dit uit te lokken (~ 5-10-voudige toename).27_{Een andere interessante bevinding was dat complement}

activatie plaatsvond na ijzersucrose maar niet ijzer (III) carboxymaltose toediening. In PD is door verschillende studies het belang van complement regulatoren (Cregs) op peritoneale membraan aangetoond, namelijk door een associatie aan te tonen met peritoneale transport status en complement activatie.14,28_{Vanwege het gebrek aan}

toegang tot de peritoneale membraan zelf, is het echter moeilijk om de Cregs op het peritoneum te bestuderen. Peritoneale membraanbiopten worden zelden genomen in de kliniek en worden vaak alleen gedaan bij het inbrengen van een PD-katheter of bij het stopzetten van PD.29_{Net zoals ‘losgelaten’ mesotheelcellen in de peritoneale}

dialysevloeistof bestudeerd kunnen worden, kan de aanwezigheid van afgesplitste en/of uitgescheiden vormen van Cregs gebruikt worden als surrogaat marker voor hun expressie op het peritoneale membraan. Daarom hebben wij in Hoofdstuk 7

de afgesplitste vorm van CD59 (sCD59) gemeten in PD-patiënten op zowel lokaal als systemisch niveau en de relatie met complement activatie en klinische uitkomsten onderzocht. Verrassend genoeg werd er geen sterke relatie gevonden tussen het sCD59 en complement activatie in het dialysaat. Daarentegen zijn lokale en systemische sCD59 onafhankelijk geassocieerd met klinische uitkomsten betreffende zowel de membraan- als residuale nierfunctie in ons cohort van PD-patiënten. Of het mechanismen achter de associatie van sCD59 met PD-uitkomsten verder gaat dan complement activatie moet nog worden onderzocht. In Hoofdstuk 8 hebben we het complement system in

PD-patiënten verder onderzocht door middel van een uitgebreide complement analyse op zowel lokaal als systemisch niveau. Daarbij zijn verschillende complement componenten en activeringsproducten gemeten en hebben wij onderzocht wat hun relatie is met klinische gegevens. Onze resultaten kwam overeen met de baanbrekende studie van Lambie et al.,30_{die aantoonde dat systemische en lokale ontstekingsmediatoren}

onafhankelijk handelen en verschillende klinische implicaties hebben. Wij vonden dat verschillende activeringsroutes verantwoordelijk waren voor de complement activatie in de circulatie t.o.v. de complement activatie in het peritoneum. Daarnaast werd de systemische complement activatie in PD-patiënten vergeleken met een groep van HD-patiënten en, tegen onze verwachting in, werden er significant hogere niveaus van sC5b-9 gevonden in de PD groep. Verdere studies moeten worden uitgevoerd

(8)

215

om deze intrigerende bevinding te bevestigen en het mechanisme hiervoor te achter halen. Ten slotte wijst onze studie op de potentiële prognostische waarde van complement component C1q als voorspeller voor het optreden van peritonitis in PD-patiënten. Gezamenlijk dragen Hoofdstuk 7 en Hoofdstuk 8 bij aan de hedendaagse

hypothese dat het complement systeem geactiveerd raakt in PD en bijdraagt aan de ontwikkeling van mortaliteit en morbiditeit onder deze patiënten. Ook laten wij zien dat de klinische relevantie van het complement systeem verder gaat dan de traditionele activeringsproducten. Daarmee heeft het meten van complement componenten, regulatoren en activatieproducten in PD de potentie om vooraanstaande biomarkers te worden, die artsen kunnen helpen en ondersteunen bij het maken van klinische beslissingen.

De pathofysiologische bijdrage van het complement systeem, in het bijzonder in IgAN en dialyse, werden verder benadrukt door het werk uit dit proefschrift. Het verband tussen het complement systeem en de lokale en systemische ontstekingsreactie die bij deze aandoeningen wordt waargenomen, leverde in onze onderzoeken echter tegenstrijdige resultaten op. In Hoofdstuk 2 en Hoofdstuk 3 leverde het onderzoek in

nierbiopten van IgAN patienten geen overtuigend antwoordt op de vraag of complement activatie een oorzaak is van actieve ontsteking, of dat het slechts een mesangiale of endotheliale stressmarker is van weefselschade. Met betrekking tot glomerulaire C4d, liet Segarra et al. zien dat de mesengiale C4d depositie al plaatsvindt in een vroeg stadium van de ziekte.31_{Dit suggereert de betrokkenheid van complement bij de vroege}

ontstekingsprocessen in IgAN in plaats van een onbenullige surrogaat marker te zijn van late nierschade. Een subgroep analyse in ons cohort bevestigde de betrokkenheid van het complement systeem in een vroeg stadium van het ziekteproces in IgAN. Patiënten zonder vergevorderde IgAN lieten namelijk nog steeds een associatie zien tussen arteriolaire C4d depositie en ziekteprogressie. Desalniettemin, was de aanwezigheid van arteriolaire C4d depositie in IgAN niet geassocieerd met histologische markers van ontsteking zoals mesangiale, endo- of extracapillaire proliferatie. In Hoofdstuk 5

toonde het ex-vivo hemodialysemodel aan dat complement inhibitie de systemische ontstekingsreactie bijna volledig remt. In Hoofdstuk 6, daarentegen, werd er wel

associatie gevonden tussen complement activatie en MPO, een oxidatieve stress marker,32_{maar vonden wij geen correlatie tussen complement activatie en PTX-3,}

een pentraxine waarvan is aangetoond dat het een sensitieve en vroege marker is van de HD-geïnduceerd onstekingsreactie.33_{Ten slotte werd in}_{Hoofdstuk 7 aangetoond}

(9)

216

dat sCD59 de peritoneale transport status (PSTR) voorspelt. De PSTR houdt nauw verband met de lokale ontsteking in PD,34_{maar in}_{Hoofdstuk 8 was er geen relatie}

gevonden tussen de lokale complement activatie en interleukine-6 (IL-6). De weefsel remodellerende marker, matrix metalloproteinase-2 (MMP-2), liet wel een associatie zien met lokale complement componenten. Gezamenlijk leiden deze bevindingen tot verdere vragen over hoe complement activatie gekoppeld is aan de algemene ontstekingsreactie die optreedt in patiënten met chronische nierziekten en tijdens dialyse en hoe dit de uitkomsten beïnvloedt bij deze patiënten. Daarnaast bieden deze bevindingen wellicht aanwijzingen voor mogelijke nieuwe functies van het complement systeem in nierziekten, afgezien van het genereren van een ontstekingsreactie. Ook moeten wij wellicht ontstekingsreacties niet zien als een universele reactie, maar in plaats daarvan onderscheid maken tussen de verschillende soorten ontstekingsreacties die bij ziekten worden gezien. Sommige daarvan zullen complement-gemedieerd zijn, terwijl andere complement-onafhankelijk zijn.

REFERENCES:

1. Ricklin, D., Mastellos, D. C., Reis, E. S. & Lambris, J. D. The renaissance of complement therapeutics. Nat. Rev. Nephrol. 14, 26–47 (2017).

2. Roos, A. et al. Glomerular activation of the lectin pathway of complement in IgA nephropathy is associated with more severe renal disease. J. Am. Soc. Nephrol. 17, 1724–34 (2006).

3. Daha, M. R. & van Kooten, C. Role of complement in IgA nephropathy. J. Nephrol. 29, 1–4 (2016). 4. Wyatt, R. J. et al. Complement activation in IgA nephropathy. Kidney International vol. 31 (1987). 5. Mariani, L. H. & Kretzler, M. Pro: ‘The usefulness of biomarkers in glomerular diseases’. The problem:

Moving from syndrome to mechanism - Individual patient variability in disease presentation, course and response to therapy. Nephrology Dialysis Transplantation vol. 30 892–898 (2015).

6. Sprong, T. et al. Deficient alternative complement pathway activation due to factor D deficiency by 2 novel mutations in the complement factor D gene in a family with meningococcal infections. Blood 107, 4865–70 (2006).

7. Espinosa, M. et al. Association of C4d deposition with clinical outcomes in IgA nephropathy. Clin. J. Am. Soc. Nephrol. 9, 897–904 (2014).

8. Leung, J. C. K., Lai, K. N. & Tang, S. C. W. Role of Mesangial-Podocytic-Tubular Cross-Talk in IgA Nephropathy. Seminars in Nephrology vol. 38 485–495 (2018).

9. Trimarchi, H. et al. Oxford Classification of IgA nephropathy 2016: an update from the IgA Nephropathy Classification Working Group. Kidney Int. 91, 1014–1021 (2017).

10. Chua, J. S. et al. Complement-mediated microangiopathy in IgA nephropathy and IgA vasculitis with nephritis. Mod. Pathol. 32, 1147–1157 (2019).

11. Cai, Q. et al. Microangiopathic Lesions in IgA Nephropathy: A Cohort Study. Am. J. Kidney Dis. 74, 629–639 (2019).

12. Borceux, P., Morelle, J. & Goffin, E. Complement system activation and peritoneal membrane alterations: Culprit or innocent bystander? Peritoneal Dialysis International vol. 40 115–123 (2020).

(10)

217

13. Ekdahl, K. N., Soveri, I., Hilborn, J., Fellstr.m, B. & Nilsson, B. Cardiovascular disease in haemodialysis: role of the intravascular innate immune system. Nat. Rev. Nephrol. 13, 285–296 (2017).

14. Kitterer, D. et al. Alteration of membrane complement regulators is associated with transporter status in patients on peritoneal dialysis. PLoS One 12, (2017).

15. Mares, J. et al. Proteomic profiling of blood-dialyzer interactome reveals involvement of lectin complement pathway in hemodialysis-induced inflammatory response. Proteomics. Clin. Appl. 4, 829–38 (2010).

16. Chenoweth, D. E., Cheung, A. K. & Henderson, L. W. Anaphylatoxin formation during hemodialysis: effects of different dialyzer membranes. Kidney Int. 24, 764–9 (1983).

17. Bartosova, M. et al. Complement Activation in Peritoneal Dialysis-Induced Arteriolopathy. J. Am. Soc. Nephrol. 29, 268–282(2018).

18. Reddingius, R. E. et al. Complement in serum and dialysate in children on continuous ambulatory peritoneal dialysis. Perit. Dial. Int. 15, 49–53 (1995).

19. Sanchez-Villanueva, R. J. et al. Reacciones de hipersensibilidad a membranas sinteticas de hemodialisis. Nefrologia 34, 520–525 (2014).

20. Makar, M. S. & Pun, P. H. Sudden Cardiac Death Among Hemodialysis Patients. Am. J. Kidney Dis. 69, 684–695 (2017).

21. Butani, L. & Calogiuri, G. Hypersensitivity reactions in patients receiving hemodialysis. Annals of Allergy, Asthma and Immunology vol. 118 680–684 (2017).

22. Vaziri, N. D. Safety Issues in Iron Treatment in CKD. Seminars in Nephrology vol. 36 112–118 (2016). 23. Macdougall, I. C. et al. Intravenous Iron in Patients Undergoing Maintenance Hemodialysis. N. Engl.

J. Med. NEJMoa1810742 (2018) doi:10.1056/NEJMoa1810742.

24. Rostoker, G. When should iron supplementation in dialysis patients be avoided, minimized or withdrawn? Seminars in Dialysis vol. 32 22–29 (2019).

25. Horl, W. H. Clinical aspects of iron use in the anemia of kidney disease. J. Am. Soc. Nephrol. 18, 382–93 (2007).

26. Hempel, J. C. J. C. et al. Distinct in vitro Complement Activation by Various Intravenous Iron Preparations. Am. J. Nephrol. 45, 49–59 (2017).

27. Chanan-Khan, A. et al. Complement activation following first exposure to pegylated liposomal doxorubicin (Doxil): possible role in hypersensitivity reactions. Ann. Oncol. Off. J. Eur. Soc. Med. Oncol. 14, 1430–7 (2003).

28. Sei, Y. et al. Expression of membrane complement regulators, CD46, CD55 and CD59, in mesothelial cells of patients on peritoneal dialysis therapy. Mol. Immunol. 65, 302–309 (2015).

29. Krediet, R. T. The peritoneal membrane in chronic peritoneal dialysis. Kidney Int. 55, 341–356 (1999). 30. Lambie, M. et al. Independent Effects of Systemic and Peritoneal Inflammation on Peritoneal Dialysis

Survival. J. Am. Soc.Nephrol. 24, 2071–2080 (2013).

31. Segarra, A. et al. Mesangial C4d deposits in early IgA nephropathy. Clin. J. Am. Soc. Nephrol. 13, 258–264 (2018).

32. Kitabayashi, C. et al. Positive association between plasma levels of oxidized low-density lipoprotein and myeloperoxidase afterhemodialysis in patients with diabetic end-stage renal disease. Hemodial. Int. 17, 557–567 (2013).

33. Sj.berg, B., Qureshi, A. R., Anderstam, B., Alvestrand, A. & B.r.ny, P. Pentraxin 3, a sensitive early marker of hemodialysis induced inflammation. Blood Purif. 34, 290–7 (2012).

(11)

218

SUMÁRIO E DISCUSSÃO

A desregulação ou excessiva ativação do sistema do complemento é considerada actualmente um aspecto fundamental da patogénese de um largo espectro de doenças inflamatórias e imunomediadas. A aprovação pela US Food and Drug Administration

(FDA) do inibidor do complemento eculizumab, um anticorpo monoclonal dirigido à

proteína do sistema do complemento C5, primeiro em 2007 para a hemoglobinúria paroxística nocturna (HPN), e posteriormente para a doença renal rara, síndrome hemolítica urémica atípica (SHUa), em 2011, e o sucesso subsequente observado nos doentes com estas patologias, provaram a eficácia das terapêuticas dirigidas ao sistema do complemento e como tal aumentaram o interesse na sua utilização clínica, especialmente nas doenças renais.1_{Para além disso, as lições retiradas}

da experiência clínica com o uso do eculizumab nos últimos anos permitiram o desenvolvimento do conhecimento sobre como o sistema do complemento funciona, e explorar os desafios remanescentes e emergentes nas doenças renais associadas ao complemento. Curiosamente, vários dos ensaios clínicos terapêuticos que testaram o eculizumab em outras condições patológicas não tiveram sucesso.1_{Este facto remete}

para a necessidade de uma abordagem mais sofisticada na modulação do sistema do complemento, particularmente devido à possibilidade de atuar neste sistema em níveis diferentes (i.e. nos iniciadores, convertases, receptores, e reguladores); e que uma identificação mais precisa dos subgrupos de doentes que beneficiam de terapêutica dirigida ao complemento pode contribuir para o seu sucesso. Para isso, uma melhor compreensão dos mecanismos envolvidos na activação do complemento, quer na patologia renal que se traduz na progressão da doença renal crónica (DRC), quer no ambiente urémico sistémico em doentes com doença renal avançada, é necessária. Adicionalmente, a identificação de biomarcadores apropriados que traduzam estes processos é essencial para potenciar a contribuição que a terapêutica dirigida ao complemento possa ter na redução da progressão da DRC e na prevenção da morbi-mortalidade nos estádios avançados da DRC como aqueles observados nos doentes em programa crónico de diálise.

O trabalho atual apresentado nesta tese contribui para, e expande a noção do, envolvimento do sistema complemento em vários processos patológicos que participam na progressão da DRC e no meio urémico em doentes em diálise. Particularmente, em uma doença glomerular frequente, como a nefropatia por IgA (NIgA), foi demonstrado que o C4d, como biomarcador glomerular e potencialmente vascular da ativação da

(12)

219

via da lectina, identifica um subgrupo de doentes com pior prognóstico nesta doença complexa e heterogénea, que podem beneficiar de uma diferente abordagem clínica. Para além deste facto, na hemodiálise (HD), os doentes com níveis mais elevados de ativação intra-dialítica do complemento indicado por um aumento do rácio C3d/C3, tiveram um maior risco de evento cardiovascular futuro. Além disso, em doentes com DRC não dependentes de diálise ou DRC em HD que receberam formulações intravenosas de ferro, particularmente óxido férrico sacarosado, a ativação do complemento medida através dos níveis de sC5b-9 foi demonstrada, expandindo a lista de potenciais efeitos colaterais deste medicamento frequentemente administrado em doentes em HD. Finalmente, na diálise peritoneal (DP), a ativação local e sistémica do complemento foi demonstrada como ocorrendo através de vias de ativação aparentemente diferentes e, surpreendentemente, os níveis sistêmicos de sC5b-9 foram significativamente maiores do que aqueles encontrados em doentes em HD.

A descoberta do envolvimento da via da lectina num subgrupo de doentes com NIgA abriu novos caminhos para a investigação na NIgA,2_{e expandiu o papel inicialmente}

atribuído ao sistema do complemento nesta doença.3,4_{Uma doença glomerular}

extremamente heterogénea, tanto em padrões morfológicos como de evolução clínica, exige uma abordagem mais precisa para além daquela apenas guiada por proteinúria, hipertensão e taxa de filtração glomerular estimada. Na verdade, a medicina personalizada na doença glomerular tem-se baseado principalmente na análise dos seus padrões morfológicos, ao contrário do que acontece em outras áreas da medicina, como na oncologia, onde se utilizam painéis imuno-histológicos e também abordagens genómicas que se tornaram essenciais para a tomada de decisões clínicas. Se bem implementadas, estes novas abordagens podem também estabelecer-se como a baestabelecer-se da abordagem clinica para a doença glomerular.5_{Assim sendo, no}

Capítulo 2, para além da confirmação do papel preditivo do C4d mesangial na nossa

coorte de doentes com NIgA, conforme demonstrado anteriormente,6,7 _propusemos

o uso de um painel imuno-histológico de biomarcadores onde a combinação de C4d glomerular e CD3 tubulointersticial (um marcador de células T, indicando inflamação tubulointersticial) poderia ser aplicada. Esta poderia ser uma forma de documentar ainda mais a importância do cross-talk tubo-glomerular na NIgA e a importância que a inflamação tubulointersticial tem na deterioração da função renal nesta doença.8_Além

disso, o compartimento vascular na NIgA tem sido alvo de um interesse renovado, dada a publicação recente de estudos que mostram que o subgrupo de doentes com lesões

(13)

220

microangiopáticas têm pior prognóstico.9-11_{Neste contexto, no}_{Capítulo 3, expandimos}

a nossa análise do C4d para investigar se este poderia ser um marcador de lesão arteriolar, e descobrimos que este marcador foi associado simultaneamente com lesões vasculares e independentemente com os outcomes clínicos na NIgA. Para concluir, os nossos estudos reforçam o papel potencial que o C4d pode ter na previsão da evolução clínica na NIgA, e expandem as suas aplicações diagnósticas potenciais, particularmente pela sua análise nas arteríolas. Um biomarcador simples como o C4d, já utilizado na prática clínica, principalmente na patologia do transplante, pode, portanto, ser aplicado na análise das biópsias de NIgA, onde ambos os compartimentos glomerular e vascular podem fornecer informação relevante e complementar.

Apesar de a maioria da investigação em complemento e doença renal se tenha focado na contribuição deste sistema para a progressão da DRC em várias doenças renais inflamatórias, existe um interesse crescente na contribuição do sistema do complemento para o próprio meio inflamatório sistémico presente na doença renal avançada.12,13_{Assim, no}_{Capítulo 4 o conhecimento atual sobre o sistema do}

complemento em doentes em programa de diálise é resumido. Tanto na hemodiálise (HD) quanto na diálise peritoneal (DP), a bioincompatibilidade parece ser um fator importante na ativação do complemento. No caso da HD, esta resulta da exposição repetida do sangue a um circuito extracorporal, particularmente às membranas de diálise, enquanto na DP, a bioincompatibilidade pode surgir da exposição constante a um fluido de diálise na cavidade peritoneal, que também pode estar intimamente ligado à presença ou perda dos reguladores do complemento expressos constitutivamente na membrana peritoneal.14 _{Com base na literatura atual, os mecanismos propostos para a}

ativação do complemento em HD envolvem tanto as vias da lectina como a alternativa, que posteriormente resultam em inflamação e coagulação.15,16_{Adicionalmente, a via}

clássica e a via alternativa têm sido implicadas na ativação do complemento a nível quer local quer sistémico na DP.17,18

O Capítulo 5 investiga as implicações que o sistema complemento pode ter nos

mecanismos que levam aos outcomes cardiovasculares associados à HD. A activação intradialítica de complemento verificou-se predominantemente nos doentes em HD que mais tarde desenvolveriam um evento cardiovascular. Além disso, a ativação do complemento observada nesses doentes foi acompanhada por uma resposta trombo-inflamatória aumentada. Isso sugere que, em HD, os mecanismos por trás do maior risco cardiovascular podem ser atribuídos, pelo menos em parte, ao sistema do

(14)

221

complemento, inflamação e coagulação. Além dos efeitos a longo prazo da ativação repetida do sistema do complemento em doentes em HD, o recente ressurgimento da temática das reacções ao dialisador durante as sessões de HD, traduzido pelo aumento das suas notificações, e a etiologia ainda mal definida da alta prevalência de morte súbita durante as primeiras sessões de diálise, fornecem a justificação para o aumento da investigação na área da relação entre o sistema do complemento e terapêuticas de HD.19,20

A exposição a um circuito extracorporal ou fluidos bioincompatíveis não é a única fonte potencial de inflamação em doentes em diálise. A administração repetida de medicamentos, como formulações intravenosas de ferro também podem contribuir para a inflamação nestes doentes.21,22_{Embora uma recente publicação tenha diminuído}

as reservas em relação às terapêuticas com ferro intravenoso,23_{muitas questões}

permanecem sem resposta sobre o possível papel da administração repetida de ferro como potencial agente contribuindo para o meio inflamatório urémico que potencia o risco de infecção e eventos cardiovasculares na população com DRC. Além disso, a evidência de sobrecarga de ferro, reações anafiláticas, stress oxidativo, aterosclerose e comprometimento cognitivo foram documentados como efeitos colaterais importantes da terapêutica com ferro.22,24,25 _{Recentemente, o nosso grupo}

de investigação demonstrou pela primeira vez que as formulações de ferro podem ativar o complemento in vitro, expandindo o conceito de pseudo-alergia relacionada à ativação do complemento (CARPA), para o campo de terapêutica com formulações de ferro.26_{Particularmente, os níveis de ativação do complemento demonstrados após a}

administração de ferro dextrano podem ser responsáveis pela ocorrência de reações de hipersensibilidade clinicamente evidentes.26_No_{Capítulo 6, demonstramos que tanto em}

pessoas sem DRC, em doentes DRC não dependentes de diálise e, mais importante, nos doentes em programa crónico de hemodiálise, onde a exposição a estímulos do circuito extracorporal já é responsável por um grau significativo de ativação do complemento, a própria terapêutica com ferro foi responsável por um aumento significativo dos níveis de sC5b-9. Embora esse aumento tenha sido significativo, não foi suficiente para produzir uma reação aguda clinicamente reconhecível, pois foi significativamente menor do que a quantidade proposta para provocar essa reação (aumento de ~ 5-10 vezes).27

Outro achado interessante foi o de que esta ativação do complemento ocorreu após a administração da óxido férrico sacarosado, mas não da carboximaltose férrica.

(15)

222

Na DP, a evidência sobre a importância dos reguladores do complemento (Cregs) na membrana peritoneal foi documentada em vários estudos, demonstrando a sua associação com o perfil de transporte da membrana, bem como com a ativação do complemento.14,28_{É, no entanto, difícil documentar o perfil da expressão dos Cregs}

na membrana peritoneal devido à falta de acesso à própria membrana. Biópsias da membrana peritoneal raramente são realizadas na corrente prática clínica, permanecendo principalmente como uma técnica utilizada nos momentos de inserção do cateter de DP ou descontinuação da DP.29_{Como é o caso da medição da massa}

celular mesotelial no fluido de diálise peritoneal, a disponibilidade de formas solúveis mensuráveis de Cregs podem servir como marcadores aproximados da sua expressão histológica na membrana peritoneal. Portanto, no Capítulo 7, medimos a forma

solúvel de CD59 a nível local (no efluente peritoneal) e sistémico em doentes em DP e investigamos a sua relação com a ativação do sistema do complemento assim como com os outcomes clínicos. Surpreendentemente, um forte relação entre o sCD59 medido no efluente peritoneal e a ativação também local do complemento indicada pelos níveis de sC5b-9 não foi encontrada. Em contraste, o sCD59 local e sistémico associou-se de forma independente com os outcomes relativos à sobrevida da membrana peritoneal assim como à função renal residual nesta coorte de doentes em DP. Os mecanismos para além da activação do complemento que resultam na associação do sCD59 com os resultados clínicos em DP ainda precisam de ser determinados. No

Capítulo 8, prosseguimos a investigação do perfil do sistema do complemento nos

doentes em DP, por meio de uma análise abrangente do mesmo, tanto a nível local como sistémico, incluindo os seus componentes e produtos de ativação, analisando também a sua relação com os dados clínicos. De acordo com o estudo seminal de Lambie et al. que descreveu uma dissociação entre os níveis sistémicos e locais de citocinas com diferentes implicações clínicas,30_{as vias de iniciação do complemento}

na circulação ou na cavidade intra-peritoneal também parecem ser diferentes. Além disso, a ativação sistémica do complemento foi comparada com uma coorte de doentes em HD e, inesperadamente, níveis significativamente mais elevados de sC5b-9 foram encontrados na nossa coorte de DP. Mais estudos devem ser realizados para confirmar esta descoberta intrigante. Finalmente, o nosso estudo aponta para o valor potencial do componente do complemento C1q como um preditor de um outcome clínico significativo na DP, como é o caso da ocorrência de peritonite. Juntos, os dois estudos contribuem para o crescente conhecimento do envolvimento do sistema do complemento na DP e mostram que a sua relevância clínica vai para além da avaliação dos habituais produtos

(16)

223

de ativação deste sistema. Na verdade, a medição dos componentes do complemento e seus reguladores pode permitir que potencialmente estes se tornem biomarcadores importantes, auxiliando a decisão clínica.

As contribuições fisiopatológicas do sistema complemento, particularmente na NIgA e diálise, foram melhor elucidadas com o trabalho descrito nesta tese. Contudo, a ligação entre o sistema do complemento e a resposta inflamatória local e sistémica observada nestas condições mostrou resultados contraditórios nos nossos estudos. Na verdade, no

Capítulo 2 e Capítulo 3, os estudos de biópsias de NIgA não foram conclusivos quanto

ao facto de a activação do complemento que leva à deposição mesangial e arteriolar de C4d ser ou não uma causa de inflamação ativa, ou se apenas um marcador de stress mesangial ou endotelial em áreas de necrose ou fibrose. Em relação ao C4d glomerular, Segarra et al. demonstrou que a sua expressão no mesângio ocorre nos estágios iniciais da doença, fornecendo uma justificação para o seu envolvimento nos processos inflamatórios iniciais, em vez de ser apenas um marcador de lesão estabelecida.31

Além disso, na nossa coorte de NIgA, uma análise de subgrupo com doentes sem DRC avançada confirmou a associação de C4d arteriolar com o outcome clínico, favorecendo o seu envolvimento nos processos iniciais da doença. No entanto, a presença de C4d não se associou com marcadores morfológicos de inflamação, como proliferação mesangial, endo ou extracapilar. Adicionalmente, no Capítulo 5, o modelo de hemodiálise

ex-vivo mostrou que a inibição terapêutica da activação do complemento reduz a

produção de marcadores inflamatórios, enquanto no Capítulo 6, na nossa coorte de

hemodiálise, foram encontradas associações entre a ativação do complemento e o MPO, um marcador de stress oxidativo,32_{mas não entre o complemento e a PTX-3, uma}

pentraxina que mostrou ser um marcador precoce e sensível de inflamação induzida por HD.33_{Finalmente, no}_{Capítulo 7, o sCD59 mostrou prever o perfil de transporte}

da membrana, que tem sido intimamente ligado à inflamação,34_{mas no}_{Capítulo 8, o}

sC5b-9 e os componentes do complemento avaliados não mostraram associação local com a IL-6, mas sim com um marcador de remodelação tecidular, MMP-2. Juntos, estes achados abrem questões sobre como a ativação do complemento está ligada à resposta inflamatória geral que ocorre e influencia a evolução clínica nos doentes com DRC. Além disso, talvez estas descobertas forneçam mais pistas para potenciais novas funções do sistema complemento na doença, para além daquelas associadas ao estabelecimento de uma resposta inflamatória. Por outro lado, em vez de ver a resposta inflamatória como uma reação generalizada, estes achados são favoráveis a uma

(17)

224

eventual discriminação entre os diferentes tipos de respostas inflamatórias observadas nas doenças. Alguns dos quais irão ser mediados pelo complemento, enquanto outros serão independentes do complemento.

REFERENCES

1. Ricklin, D., Mastellos, D. C., Reis, E. S. & Lambris, J. D. The renaissance of complement therapeutics. Nat. Rev. Nephrol. 14, 26–47 (2017).

2. Roos, A. et al. Glomerular activation of the lectin pathway of complement in IgA nephropathy is associated with more severe renal disease. J. Am. Soc. Nephrol. 17, 1724–34 (2006).

3. Daha, M. R. & van Kooten, C. Role of complement in IgA nephropathy. J. Nephrol. 29, 1–4 (2016). 4. Wyatt, R. J. et al. Complement activation in IgA nephropathy. Kidney International vol. 31 (1987). 5. Mariani, L. H. & Kretzler, M. Pro: ‘The usefulness of biomarkers in glomerular diseases’. The problem:

Moving from syndrome to mechanism - Individual patient variability in disease presentation, course and response to therapy. Nephrology Dialysis Transplantation vol. 30 892–898 (2015).

6. Sprong, T. et al. Deficient alternative complement pathway activation due to factor D deficiency by 2 novel mutations in the complement factor D gene in a family with meningococcal infections. Blood 107, 4865–70 (2006).

7. Espinosa, M. et al. Association of C4d deposition with clinical outcomes in IgA nephropathy. Clin. J. Am. Soc. Nephrol. 9, 897– 904 (2014).

8. Leung, J. C. K., Lai, K. N. & Tang, S. C. W. Role of Mesangial-Podocytic-Tubular Cross-Talk in IgA Nephropathy. Seminars in Nephrology vol. 38 485–495 (2018).

9. Trimarchi, H. et al. Oxford Classification of IgA nephropathy 2016: an update from the IgA Nephropathy Classification Working Group. Kidney Int. 91, 1014–1021 (2017).

10. Chua, J. S. et al. Complement-mediated microangiopathy in IgA nephropathy and IgA vasculitis with nephritis. Mod. Pathol. 32, 1147–1157 (2019).

11. Cai, Q. et al. Microangiopathic Lesions in IgA Nephropathy: A Cohort Study. Am. J. Kidney Dis. 74, 629–639 (2019).

12. Borceux, P., Morelle, J. & Goffin, E. Complement system activation and peritoneal membrane alterations: Culprit or innocent bystander? Peritoneal Dialysis International vol. 40 115–123 (2020). 13. Ekdahl, K. N., Soveri, I., Hilborn, J., Fellstr.m, B. & Nilsson, B. Cardiovascular disease in haemodialysis:

role of the intravascular innate immune system. Nat. Rev. Nephrol. 13, 285–296 (2017).

14. Kitterer, D. et al. Alteration of membrane complement regulators is associated with transporter status in patients on peritoneal dialysis. PLoS One 12, (2017).

15. Mares, J. et al. Proteomic profiling of blood-dialyzer interactome reveals involvement of lectin complement pathway in hemodialysis-induced inflammatory response. Proteomics. Clin. Appl. 4, 829–38 (2010).

16. Chenoweth, D. E., Cheung, A. K. & Henderson, L. W. Anaphylatoxin formation during hemodialysis: effects of different dialyzer membranes. Kidney Int. 24, 764–9 (1983).

17. Bartosova, M. et al. Complement Activation in Peritoneal Dialysis-Induced Arteriolopathy. J. Am. Soc. Nephrol. 29, 268–282 (2018).

18. Reddingius, R. E. et al. Complement in serum and dialysate in children on continuous ambulatory peritoneal dialysis. Perit. Dial. Int. 15, 49–53 (1995).

(18)

225

19. Sanchez-Villanueva, R. J. et al. Reacciones de hipersensibilidad a membranas sinteticas de hemodialisis. Nefrologia 34, 520–525 (2014).

20. Makar, M. S. & Pun, P. H. Sudden Cardiac Death Among Hemodialysis Patients. Am. J. Kidney Dis. 69, 684–695 (2017).

21. Butani, L. & Calogiuri, G. Hypersensitivity reactions in patients receiving hemodialysis. Annals of Allergy, Asthma and Immunology vol. 118 680–684 (2017).

22. Vaziri, N. D. Safety Issues in Iron Treatment in CKD. Seminars in Nephrology vol. 36 112–118 (2016). 23. Macdougall, I. C. et al. Intravenous Iron in Patients Undergoing Maintenance Hemodialysis. N. Engl.

J. Med. NEJMoa1810742 (2018) doi:10.1056/NEJMoa1810742.

24. Rostoker, G. When should iron supplementation in dialysis patients be avoided, minimized or withdrawn? Seminars in Dialysis vol. 32 22–29 (2019).

25. Horl, W. H. Clinical aspects of iron use in the anemia of kidney disease. J. Am. Soc. Nephrol. 18, 382–93 (2007).

26. Hempel, J. C. J. C. et al. Distinct in vitro Complement Activation by Various Intravenous Iron Preparations. Am. J. Nephrol. 45, 49–59 (2017).

27. Chanan-Khan, A. et al. Complement activation following first exposure to pegylated liposomal doxorubicin (Doxil): possible role in hypersensitivity reactions. Ann. Oncol. Off. J. Eur. Soc. Med. Oncol. 14, 1430–7 (2003).

28. Sei, Y. et al. Expression of membrane complement regulators, CD46, CD55 and CD59, in mesothelial cells of patients on peritoneal dialysis therapy. Mol. Immunol. 65, 302–309 (2015).

29. Krediet, R. T. The peritoneal membrane in chronic peritoneal dialysis. Kidney Int. 55, 341–356 (1999). 30. Lambie, M. et al. Independent Effects of Systemic and Peritoneal Inflammation on Peritoneal Dialysis

Survival. J. Am. Soc. Nephrol. 24, 2071–2080 (2013).

31. Segarra, A. et al. Mesangial C4d deposits in early IgA nephropathy. Clin. J. Am. Soc. Nephrol. 13, 258–264 (2018).

32. Kitabayashi, C. et al. Positive association between plasma levels of oxidized low-density lipoprotein and myeloperoxidase after hemodialysis in patients with diabetic end-stage renal disease. Hemodial. Int. 17, 557–567 (2013).

33. Sjoberg, B., Qureshi, A. R., Anderstam, B., Alvestrand, A. & Barany, P. Pentraxin 3, a sensitive early marker of hemodialysis induced inflammation. Blood Purif. 34, 290–7 (2012).

(19)

226

ACKNOWLEDGMENTS

For whatever its good and bad aspects are, orthodoxy was never a dominant feature of my Ph.D path. Working as a clinician in Portugal and doing research in the Netherlands at the same time meant countless trips, lost flights and trains, nights slept at airports or train stations, doing morning clinical shifts coming directly from the airport, saving up vacation days to go to Groningen. It made me ask myself several times if I was not overdoing it. Of course I was, but among the many reasons which are still not clear to me, there are two reason that are undisputed and kept me going. The passion for what I was doing, and the people that in Portugal and the Netherlands supported me. I am very sure that without these unique people, that I have had the opportunity to meet and work with during this adventure, none of this would have been possible.

I want to start by thanking Prof. Moh Daha and Dr. Marc Seelen. My first meeting

with them happened in Utrecht at the train station. I was later invited by Marc to have dinner at his house in Assen. On my way back to Portugal, I remember calling my clinical director, to tell her how amazed I was that these great researchers were so nice and humble to listen to my research ideas. In fact, both have remained extremely nice and patient with me throughout all these years. Both were and always will be a source of inspiration and guidance to me.

In the early days, I started my research at the Experimental Nephrology Laboratory with

a series of young Ph.D. students led by Dr. Jaap van den Born. He was always extremely

kind and eager to help. Being in this welcoming and international environment, it was quite easy for me to fit in and I am thankful for my time here. A special thanks to

Saritha Adepu, Saleh Yazdani, Kiran Katta, Katarina Mirkovic, Leandro Cunha, Wendy Dam, Ditmer Talsma, Marco van Londen, Ryanne Hijmans, Wouter Lollinga, Thomas Kaufmann, Saskia Italianer, Rossana Franzin, Rosa Lammerts, Wellington Candido,

and Pragyi Shrestha, who were great people to meet and work with.

Shortly after this, I met Felix Poppelaars and Mariana Gaya da Costa. They were already

a team back then. Fortunately, they let me be part of it. Working with them was pure joy because although hard work was always at the center of it, it was incredibly fun and our discussions would go in the same light mood after work in our “Mexican” or “Piri-Piri” dinners. In the early days, I would joke with Felix saying he was my protegee, and in the end, he became my co-supervisor. I like to think that this is only due to his extreme scientific brilliance, which is undisputed. In addition to his brilliance, Felix is

(20)

227

an extremely generous person who is truly passionate about science. Mariana would always balance the excesses of our creative process discussions and bring us back to earth. Her courage and wisdom to conciliate all aspects of life inspire me.

Together with Felix and Mariana, I also started to attend the yearly international complement workshops. In addition, Tina Jager and Judith van Zanden, from Marc

Seelen´s research group, joined us during these trips and I had the pleasure to meet them. During these workshops, I also got to know a great group of young researchers who had the same mindset as ours: work and joy can walk together. Great personal and professional relationships were built in these great scientific environments, much more appealing than the clinical meetings I had attended so far as a nephrologist.

Diana Pauly, Nicole Shaefer, Augustin “Tin” Tortajada, Xavier Derveilleux, and Lorenz Jenny were great people to meet and remain friends with. It is great to see that from

this connection, European research projects on complement are now coming to life. Additionally, in these meetings, I got the opportunity to meet and talk with the Hycult Biotech team, mostly Loek Willems, who has contributed to large number of our studies

through great collaboration.

When I decided to become a Ph.D. candidate, I was very happy and honored that

Prof. Dr. Stefan Berger became my promoter. I was extremely impressed that with

all the academic and clinical duties he had as the nephrology department director, he found time to review my data and manuscripts and go into details that would change the direction of our work. I am very grateful for the time and effort you have put into these discussions. I am also grateful for the collaborations with Dr. Casper Franssen, Dr. Ferdau Nauta, Dr. Solmaz Assa, and Prof. Dr. Carlo Gaillard. Their input and support

were extremely helpful for the progression of the dialysis and iron studies.

A constant presence along my Ph.D. years was Anita Meter. Her constant happiness

and uncomplicatedness was always a reminder for me to keep things in perspective, and that scientific successes or failures are just that, and no more.

I would also like to thank the staff from the Nephrology Department; Winie de Jong, Joline Stavasius, Joke Drent, and Rob-Jan Kruit for all the support during my Ph.D.

Back in Portugal, there was one person that constantly supported me: Prof. Dr. Manuel Pestana. My choice to pursue Nephrology as a clinician was mostly influenced by his

lectures during medical school. During this time, my friend Roberto Roncon gave me

(21)

228

of Physiology led by Prof. Leite-Moreira, and through that, I had the privilege to start

learning something about translational research. During my specialty years, I looked at Prof Pestana as the right side of things. His ideas and struggles to bring Nephrology in Portugal to levels near what is seen in academic departments throughout Europe and the US were, and still are, inspirational. During my clinical internships in Hospital de São João, I had the opportunity to further deepen this collaboration and to participate

in additional research projects with him and my friend Luis Coentrão. When I started

this Groningen adventure, he was the first to support me, and his constant generosity was vital to my whole Ph.D. path. Also, the help of Prof. Fatima Carneiro, Dr. Pedro Rodrigues Pereira, Dr. Susana Sampaio, Dr. Rorberto Silva, and Dr. Pedro Canão was

essential to the progress of the IgAN biopsy studies.

I can never be too thankful to the Nephrology team at the Hospital de São Teotónio, in

Viseu, who was extremely supportive when I started my research fellowship and kept giving their support to the continuous projects I had with this institution. I would like to especially thank my friends and colleagues Tânia Sousa, Carla Lima, Sérgio Lemos, Giovanni Sorbo, Carolina Costa, and Cátia Pêgo for the time they took to help me

with these projects and to cover my clinical duties while I was away. Also, the great collaboration of Prof. Carla Henriques and Prof. Ana Matos was essential. I thank you

for all the effort you have put in and the great discussions we had in the IgAN studies. I would also like to thank the support of the clinical staff of the Nephrology Department, Day Hospital, and Pathology Departments at the Hospital de Braga, Braga. I would

like to especially thank all the nurses and technicians that took their time to help me with the collection and handling of the patient samples. Also, I would like to thank my clinical director Dr. Jose Queirós at NephroCare who was always supportive of my

research activities.

Lastly, I want to thank the reading committee Prof. Dr. Jan-Luuk Hillebrands, Prof. Dr. Cees Van Kooten and Prof. Dr. Marc Verloet, for the time and effort in reading and

reviewing my thesis.

Finally, I would like to thank my family and friends, who are my true home.

(22)

229

ABOUT THE AUTHOR

Antonio Bernardo Albuquerque Pereira Oliveira Faria was born on the 5th_{of February}

1981. He grew up in Porto, Portugal and completed his primary, secondary and university education there. In 2005, Bernardo got his medical degree from the Faculty of Medicine at the University of Porto. He then went on to pursue his specialization in nephrology at the Hospital São Teotónio in Viseu, Portugal. In 2014 he moved to Braga, Portugal for his current job as a nephrologist at the Hospital de Braga. Since 2012 Bernardo has been part of the Nephrology Research group hosted by the Nephrology Department of Hospital São João in Porto, currently integrated into the Instituto de Investigação e Inovação em Saúde (Institute of Research and Healthcare Innovation) of the University of Porto.

After finishing his Nephrology training, Bernardo decided to pursue his interests in research, particularly in the field of immunopathology. He proceeded to contact Professor Dr. Mohamed Daha and Dr. Marc Seelen, two experts in the complement system and kidney diseases, to explore research opportunities with them. In 2013 he was awarded the ERA-EDTA research fellowship at the Experimental Nephrology Lab of the University Medical Center Groningen. During this fellowship, Bernardo studied the role of the complement system in IgA Nephropathy. He was mentored, supported and supervised by Dr Marc Seelen (University Medical Center Groningen), Professor Dr. Mohamed Daha (University Medical Center Groningen/Leiden University Medical Center) and Professor Dr. Manuel Pestana (University of Porto). Throughout this fellowship, Bernardo started several new projects in collaboration with various Nephrology centres in Portugal. In 2017, he, therefore, decided to combine these projects into a thesis and become a PhD candidate at the University of Groningen. Under the supervision of Professor Dr. Stefan Berger, Professor Dr. Manuel Pestana, Dr. Marc Seelen and Dr. Felix Poppelaars, Bernardo was able to successfully complete his research projects and publish the vast majority in scientific, peer-reviewed journals.