University of Groningen Circulating microRNAs in heart failure Vegter, Eline Lizet

Circulating microRNAs in heart failure

Vegter, Eline Lizet

IMPORTANT NOTE: You are advised to consult the publisher's version (publisher's PDF) if you wish to cite from it. Please check the document version below.

Document Version

Publisher's PDF, also known as Version of record

Publication date: 2017

Link to publication in University of Groningen/UMCG research database

Citation for published version (APA):

Vegter, E. L. (2017). Circulating microRNAs in heart failure. Rijksuniversiteit Groningen.

Copyright

Other than for strictly personal use, it is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of the author(s) and/or copyright holder(s), unless the work is under an open content license (like Creative Commons).

Take-down policy

If you believe that this document breaches copyright please contact us providing details, and we will remove access to the work immediately and investigate your claim.

Downloaded from the University of Groningen/UMCG research database (Pure): http://www.rug.nl/research/portal. For technical reasons the number of authors shown on this cover page is limited to 10 maximum.

Appendices

Nederlandse samenvatting

Dankwoord

About the author

List of publications

Nederlandse samenvatting

Dutch summary

A

pompfunctie van het hart tekort schiet. Hierdoor kan een scala van klachten ontstaan waaronder vermoeidheid, kortademigheid en oedeem. Helaas is de prognose van hart-falen slecht, ondanks de ontwikkeling van verschillende behandelmogelijkheden. De medicamenteuze behandeling van hartfalen bestaat op dit moment met name uit medi-camenten gericht op het neuro-hormonale systeem, zoals bèta-blokkers, ACE-remmers, angiotensine receptor blokkers en de recent ontwikkelde angiotensine receptor-nyprili-syine blokkers. Nieuwe aangrijpingspunten voor therapie zijn daarom zeer gewenst en zouden mogelijk de uitkomst van patiënten met hartfalen kunnen verbeteren. De laatste jaren wordt er steeds meer gekeken naar de genetische en epigenetische informatie van hartfalen patiënten, wat mogelijk nieuwe inzichten oplevert wat betreft de pathofysiolo-gische processen die bijdragen aan het ontstaan en de progressie van hartfalen. Ingrijpen in deze cellulaire processen zou in de toekomst voor nieuwe therapieën kunnen zorgen en is daarom een groot punt van aandacht binnen het hartfalen onderzoek.

Het lichaam bestaat voor een groot gedeelte uit eiwitten en deze worden gevormd op basis van de genetische informatie in ons DNA. DNA bestaat uit sequenties van nucleo-basen (A, T, C en G) welke samen in de vorm van genen het erfelijk materiaal bevatten. Dit gedeelte op het DNA kan worden afgelezen door het RNA, waarna het transcript (mes-senger RNA, of mRNA) uit de celkern wordt getransporteerd. Dit mRNA kan weer worden vertaald in aminozuren die uiteindelijk eiwitten vormen. Dit proces (van gen naar gen-product) wordt ook wel genexpressie genoemd. Als in dit proces wordt geïntervenieerd, kunnen fysiologische processen verstoord raken en ziekten ontstaan. Genexpressie kan worden beïnvloed door verschillende mechanismen zonder dat de genetische code zelf wordt aangetast, deze processen worden vaak onder de noemer epigenetica geschaard. Niet-coderende RNAs hebben een epigenetische functie en zijn in staat de genexpressie te reguleren. Deze RNAs coderen niet voor eiwitten en werden vroeger als “junk” be-schouwd. Nu weten we dat vele niet-coderende RNAs zeer belangrijk zijn in het reguleren van diverse (patho)fysiologische processen in het menselijk lichaam.

MicroRNAs (miRNAs) behoren tot de kleine, niet-coderende RNAs en bestaan uit ~22 nucleotiden. Zij oefenen hun functie uit door aan het complementaire gedeelte van de mRNA te binden waardoor deze degradeert of niet meer functioneel kan zijn. In verschil-lende aandoeningen, waaronder hartfalen, blijken miRNAs een grote rol te spelen. Zo is het bekend dat diverse miRNAs betrokken zijn bij de cardiogenese, het ontstaan van hartfalen en de progressie hiervan. Deze genexpressie regulerende functie vindt plaats in cellen, maar in 2008 hebben wetenschappers ook miRNAs ontdekt in circulerend bloed en andere lichaamsvloeistoffen (zoals urine, hersenvocht en speeksel). Dit leidde tot de hypothese dat deze circulerende miRNAs mogelijk als biomarkers zouden kunnen functioneren. Biomarkers kunnen (patho)fysiologische processen reflecteren en infor-matie geven over de gezondheidstoestand van patiënten, zo ook bij hartfalen. Hierbij

kunnen ze behulpzaam zijn in het stellen van de diagnose, het voorspellen van de prog-nose en het inschatten van de respons op de ingezette therapie. Circulerende miRNAs zijn in de afgelopen jaren onderzocht als potentiële biomarkers voor hartfalen, al is dit met name in kleine groepen geweest en vooral in patiënten met chronisch hartfalen. Daarnaast weten we nog niet goed wat de functie van deze miRNAs is in de circulatie, waar ze vandaan komen en welke rol ze bij hartfalen spelen. Daarom hebben we in dit proefschrift de volgende primaire doelen opgesteld:

1) Het identificeren van een miRNA profiel in de circulatie van acute hartfalen patiënten 2) Meer informatie verkrijgen wat betreft klinische factoren en achterliggende ziekte-mechanismen welke mogelijk door deze circulerende miRNAs worden gereflecteerd 3) Een geschikt diermodel identificeren voor mechanistisch vervolgonderzoek

In Hoofdstuk 2 geven we een overzicht van de huidige kennis over de rol van miRNAs

in hartfalen. Hierbij hebben we ons gericht op de betrokkenheid van miRNAs in het ontstaan van cardiale hypertrofie en fibrose alsmede op mogelijke toepassingen voor toekomstige therapieën. In zowel diermodellen als in mensen is aangetoond dat een verlaging van de miRNAs miR-1 en miR-133 (met specifieke expressie in het hart en spieren) cardiale hypertrofie tot gevolg heeft. Voor de miRNAs miR-21, miR-24 en miR-29 is gebleken dat ze intensief betrokken zijn bij het ontwikkelen van cardiale fibrose, een ander belangrijk mechanisme in het ontstaan van hartfalen. Knock-down en overexpres-sie experimenten hebben laten zien dat deze processen geremd kunnen worden en suggereren mogelijkheden voor de ontwikkeling van op miRNAs gerichte therapieën.

Tevens belichten we de mogelijkheden van circulerende miRNAs als potentiële biomarkers in relatie tot de diagnose, prognose en evaluatie van therapie in patiënten met hartfalen. Meerdere studies tonen aan dat circulerende miRNAs verschillend tot expressie komen in plasma of bloed van hartfalen patiënten in vergelijking met gezonde controle personen. Helaas is er slechts weinig overlap in miRNAs tussen deze studies wat mogelijk zou kunnen komen door verschillende meetmethodes, het gebrek aan gevalideerde normalisatie (mi)RNAs en de heterogeniteit van de onderzochte popula-tie. We bespreken ook hoe miRNAs uitgescheiden worden in de circulatie en hoe het transport plaatsvindt. Omdat miRNAs zelf niet kunnen overleven in de circulatie worden ze getransporteerd in extracellulaire vesikels of apoptotische lichaampjes, of zijn ze gebonden aan o.a. HDL of andere eiwitten. Er zijn aanwijzingen dat miRNAs door cel-len kunnen worden gesecreteerd in de circulatie en door targetcelcel-len kunnen worden opgenomen. Dit suggereert een mogelijk paracriene functie van circulerende miRNAs, al moet dit bij mensen in vivo nog worden aangetoond.

A

dE idENTifiCATiE VAN EEN CiRCuLERENd MiCRoRNA PRofiEL iN PATiëNTEN MET ACuuT HARTfALEN

De meeste studies naar circulerende miRNAs in hartfalen zijn uitgevoerd met chroni-sche hartfalen patiënten, in vaak kleine groepen. Daarom hebben wij circulerende miRNAs gemeten in een relatief groot cohort van acute hartfalen patiënten en laten we in Hoofdstuk 3 zien dat de miRNAs let-7i-5p, 16-5p, 18a-5p, 26b-5p,

miR-27a-3p, miR-30e-5p, miR-106a-5p, miR-199a-3p, miR-223-3p, miR-423-3p, miR-423-5p en miR-652-3p differentieel tot expressie komen in bloedplasma van patiënten met acuut hartfalen ten opzichte van de expressie hiervan in plasma van gezonde controles. Ook konden deze miRNAs worden gevalideerd in een ander onafhankelijk acuut hartfalen cohort en zagen we een uniek patroon van oplopende miRNA waarden naarmate het acute moment van hartfalen afnam. Zo laten we zien dat de laagste miRNA concentra-ties voorkomen in patiënten vlak na opname voor acuut hartfalen, gradueel oplopend in patiënten ten tijde van ontslag en in chronische hartfalen patiënten, met de hoogste concentratie in gezonde controles. Een verlaging tijdens de eerste 48 uur van opname was tevens geassocieerd met een verhoogde kans op mortaliteit binnen 180 dagen. Interessant genoeg bleek dat als we deze miRNAs bepaalden in patiënten met een acute exacerbatie van chronisch obstructief longlijden (COPD) en gematchte controles, we geen verschillen zagen. Dit suggereert dat deze miRNAs niet alleen acute benauwd-heid of hypoxie reflecteren, maar specifiek lijken voor hartfalen. Deze robuuste en consistente resultaten suggereren een mogelijke diagnostische en prognostische rol voor deze miRNAs, al moeten verdere studies uitwijzen of (deze) miRNAs hier inderdaad geschikt voor zijn. Daarnaast is er zeer weinig bekend over de onderliggende pathofy-siologische processen die deze miRNAs reflecteren. Aanvullend onderzoek naar hun rol in de circulatie van hartfalen patiënten is daarom zeer wenselijk.

CiRCuLERENdE MiCRoRNAs EN HuN MoGELijkE RoL EN fuNCTiE iN HARTfALEN Omdat er weinig bekend is over de rol van circulerende miRNAs in hartfalen hebben we verschillende hypotheses onderzocht in dit proefschrift.

Als eerste hebben we geprobeerd de circulerende miRNAs ontdekt in hoofdstuk 3 te linken aan hartfalen gerelateerde pathofysiologische mechanismen. Hoofdstuk 4

beschrijft associaties tussen circulerende miRNAs in acute hartfalen patiënten en an-dere, reeds bekende, hartfalen biomarkers. Deze biomarkers reflecteren verschillende ziekteprocessen in hartfalen waaronder inflammatie, remodeling en cardiale stretch, en kunnen daarom mogelijk een weerspiegeling zijn van onderliggende ziekteprocessen. Biomarkers werden geselecteerd op basis van hun predicatieve waarde voor 180-dagen

mortaliteit waarna vervolgens op 2 tijdspunten werd gekeken naar mogelijke correla-ties tussen miRNAs en biomarkers. Patiënten werden verdeeld in 4 groepen aan de hand van klinische parameters tijdens opname. Ten tijde van opname voor acuut hartfalen werden geen significante correlaties gezien. Echter, na 48 uur vonden we meerdere significante negatieve correlaties tussen miRNAs en biomarkers, met name in patiën-ten met de meest ongunstige klinische eigenschappen patiën-ten tijde van hospitalisatie en daarbij een slechte uitkomst. Deze correlaties vonden we voor miR-16-5p en c-reactive

protein (CRP), miR-106a-5p en creatinine, miR-223-3p en growth differentiation factor 15 (GDF-15), miR-652-3p en soluble ST2, miR-199a-3p en procalcitonine (PCT), miR-18a-5p en PCT en miR-199a-3p en galectine-3. Deze resultaten suggereren dat deze relaties tijdsafhankelijk zijn en gerelateerd zijn aan de ziektestatus van patiënten opgenomen met hartfalen. Door de heterogeniteit welke onder andere wordt veroorzaakt door ver-schillen in comorbiditeiten, etiologie van hartfalen, volume status en medicijngebruik, blijft het lastig om deze miRNAs mechanistisch te positioneren met behulp van andere biomarkers. Het is daarom belangrijk dat onze resultaten als hypothese genererend beschouwd worden, waarbij toekomstige experimentele studies nodig zijn om de mo-gelijke associaties en onderliggende ziekteprocessen te onderzoeken.

Een opvallende bevinding was dat alle geïdentificeerde miRNAs in plasma van hartfalen patiënten verlaagd waren ten opzichte van gezonde controles. Hiervoor kunnen ver-schillende verklaringen zijn, zoals een verhoogde opname vanuit de circulatie of een verminderde productie en uitscheiding in de circulatie, al zijn deze theorieën nog niet bevestigd.

Hoofdstuk 5 beschrijft de relatie tussen miRNAs en andere belangrijke

eigenschap-pen van hartfalen patiënten, namelijk congestie en hypervolemie. Door de verminderde pompfunctie in patiënten met hartfalen ontstaat vochtophoping en bijbehorende teke-nen van dyspneu, oedeem, verhoogde centraal veneuze druk en ascites. Hemoglobine kan verlaagd zijn in patiënten met een volume overschot door verdunning, ook wel hemodilutie genoemd. Bij behandeling met vocht afdrijvende middelen zoals diuretica kan hemoglobine weer stijgen, dit wordt hemoconcentratie genoemd. Dit leidde tot de hypothese dat de eerder gevonden circulerende miRNAs mogelijk verlaagd zouden kunnen zijn door een verhoogd circulerend volume. Dat circulerende miRNAs inderdaad geassocieerd lijken te zijn met volume status blijkt uit onze resultaten waarbij patiënten met hemoconcentratie stijgende miRNA levels laten zien (op dag 7 ten opzichte van

baseline), terwijl in patiënten zonder hemoconcentratie miRNA waarden een daling laten zien over tijd. We vonden dat deze verschillen significant waren voor 5 van de onderzochte miRNAs. Om uit te sluiten dat deze relatie vooral gebaseerd is op de klini-sche toestand van acute hartfalen patiënten, hebben we gecorrigeerd voor parameters welke reeds eerder in dit cohort voorspellend bleken te zijn voor een slechte uitkomst.

A

status inderdaad een effect lijkt te hebben op miRNA waarden. Dit is in lijn met de eer-der gevonden resultaten van lage concentraties in hartfalen patiënten, welke gradueel stijgen in stabiele hartfalen patiënten en het hoogst zijn in plasma van gezonde mensen. Hierbij dient wel te worden opgemerkt dat de verschillen in dit cohort subtiel zijn en dat andere factoren en onderliggende mechanismen ook een bijdragende rol lijken te hebben wat betreft de lagere miRNA concentraties in hartfalen patiënten.

Enkele studies hebben gekeken of circulerende miRNA waarden overeenkomen met miRNA expressie in het myocard. Sommige onderzoeksgroepen hebben gekeken naar de transcoronaire miRNA concentratie gradiënt en zagen dat deze verhoogd was in patiënten na een myocardinfarct en bij hartfalen, wat suggereert dat deze miRNAs door het hart worden uitgescheiden. Vaak werden er echter geen perifere miRNA metingen verricht of werd niet vergeleken met een controlegroep, wat de vertaalbaarheid naar perifere, veneuze miRNA concentraties in hartfalen patiënten moeilijk maakt. Tevens is aangetoond dat miRNAs welke rijkelijk in de circulatie van kankerpatiënten aanwezig zijn en significant verschillen met gezonde controles, afkomstig zijn van bloedcellen. In hartfalen werd bevestigd dat het miRNA expressie patroon in het hart niet overeenkomt met die in de circulatie. Hierbij werd gezien dat de meeste miRNAs hoog tot expres-sie komen in bloedcellen en endotheelcellen, terwijl slechts 0.1-1% van alle miRNAs aanwezig in de circulatie hart-specifiek zijn of hoog tot expressie komen in het hart. In onze eerdere studie zagen we inderdaad dat de cardiaal- en spier specifieke miRNAs (miR-208, miR-499, miR-1 en miR-133) niet detecteerbaar waren of niet verschillend tot expressie kwamen in plasma van hartfalen patiënten. Onze data maar ook eerder werk van anderen suggereren dat bloed- en endotheelcellen mogelijk de bron zijn van circulerende miRNAs. Hoewel enkele in onze eerdere studie geïdentificeerde miRNAs geassocieerd lijken met cardiovasculaire ziekteprocessen (zoals ook beschreven in hoofdstuk 3), zijn er tevens aanwijzingen in de beschikbare literatuur dat deze miRNAs nauw betrokken zijn bij vasculaire processen zoals inflammatie, endotheel dysfunctie en angiogenese. Daarom onderzochten we in Hoofdstuk 6 de associaties tussen de

eer-der gevonden, aan hartfalen gerelateerde miRNAs en vasculaire processen in patiënten met hartfalen en tevens atherosclerotische ziekte. We zagen dat met een toenemend aantal uitingen van atherosclerose (transient ischaemic attack (TIA)/cerebrovasculair accident (CVA), coronairlijden en perifeer arterieel vaatlijden) miRNA waarden afnemen. Deze lage levels zijn het meest uitgesproken in patiënten met hartfalen en perifeer vaatlijden. Daarnaast laten we zien dat deze miRNAs significant gerelateerd zijn aan biomarkers die processen als inflammatie, endotheel dysfunctie en angiogenese reflec-teren, waarbij lagere miRNA levels geassocieerd zijn met hogere biomarker levels. Tot slot vinden we dat lage concentraties van 6 miRNAs gerelateerd zijn aan een verhoogd

risico op een heropname in het ziekenhuis door cardiovasculaire oorzaken, terwijl dit niet het geval was voor andere eindpunten zoals mortaliteit en een hartfalen rehospita-lisatie. Dit geeft aan dat lage miRNA levels gerelateerd lijken te zijn aan vasculaire ziekte zoals weerspiegeld in atherosclerose en aan vasculair gerelateerde pathofysiologische processen en bijbehorende eindpunten. In lijn met de resultaten in hoofdstuk 3,4, en 5 blijken lage miRNA concentraties in bloedplasma van hartfalen patiënten gerelateerd te zijn aan een ongunstige klinische status en een slechte uitkomst, waarbij deze miRNAs vooral geassocieerd lijken te zijn met vasculaire ziekteprocessen zoals deze voorkomen in patiënten met hartfalen en additioneel atherosclerose.

diERModELLEN VooR MECHANisTisCHE MiCRoRNA VERVoLGsTudiEs

Om betere inzichten te krijgen in de precieze werkingsmechanismen van miRNAs in hartfalen is de identificatie van een bruikbaar diermodel noodzakelijk. In Hoofdstuk 7 beschrijven we het onderzoek naar drie mogelijke rat- en muismodellen welke allen

hartfalen reflecteren; het homozygote TGR(mREN2)27 rat model (gekarakteriseerd door overexpressie van het renin-2 gen), muizen met angiotensine II (AngII)-geïnduceerd hartfalen en muizen met een permanent myocardinfarct, veroorzaakt door ligatie van de linker coronairarterie. Ren2 ratten ontwikkelen ernstige hypertensie met als gevolg linker ventrikel hypertrofie en cardiale fibrose, uiteindelijk resulterend in hartfalen. Bij AngII muizen ontstaat tevens cardiale hypertrofie en fibrose en met name diastolische dysfunctie. Om een breed spectrum van verschillende hartfalen mechanismen te onder-zoeken hebben we tevens een ischemisch hartfalen muismodel toegevoegd. In al deze drie diermodellen vonden we interessant genoeg geen verschillen in plasma miRNA concentraties tussen hartfalen dieren en controles. In het ischemische model hebben we additioneel 2 cardiaal specifieke miRNAs gemeten (miR-499a-5p en miR-208a-3p). Hierbij was in het bloedplasma van zowel hartfalen- als controledieren miR-208a-3p niet detecteerbaar en werd miR-499a-5p alleen in lage concentraties gevonden. In nier- en hartweefsel van deze dieren zagen we wel een duidelijk miRNA expressie verschil van deze, maar ook andere miRNAs tussen de hartfalen muizen en controle dieren, waarbij er sprake was van een verhoogde miRNA expressie in het hart ten opzichte van de nieren. Met deze kleine aantallen konden we geen verschillen tussen muizen met en zonder hartfalen aantonen.

Deze resultaten zijn van belang voor vervolgstudies die gebaseerd worden op circu-lerende miRNA resultaten in mensen, aangezien onze eerdere bevindingen van lagere miRNA levels in plasma van hartfalen patiënten niet in deze diermodellen gerepliceerd konden worden. Verschillende verklaringen zijn hiervoor te bedenken, zoals een moge-lijk verminderde conservatie van miRNA functie tussen soorten, of de gebruikte

meet-A

humane hartfalen situatie nabootsen, gezien de heterogene populatie en het feit dat er in deze diermodellen geen rekening met comorbiditeiten en medicatiegebruik gehou-den wordt. De bevindingen beschreven in dit hoofdstuk bemoeilijken de interpretatie van circulerende miRNAs en hun rol in hartfalen. De humane situatie kan niet worden vertaald naar diermodellen en andersom zijn de resultaten van miRNA onderzoek in dieren niet direct te linken aan de klinische setting. Hierdoor is het moeilijk om goede, experimentele dierexperimenten op te zetten om de verdere functie en regulatie van miRNAs in hartfalen te bestuderen.

ToEkoMsT PERsPECTiEVEN

kunnen microRNAs als klinisch bruikbare biomarkers fungeren?

Biomarkers kunnen (patho)fysiologische mechanismen reflecteren in ziekte en gezond-heid en kunnen daarom goede hulpmiddelen zijn bij het diagnosticeren van hartfalen. Daarnaast kunnen biomarkers informatie geven over de prognose van een patiënt en de respons op ingezette therapie. In dit proefschrift (met name hoofdstuk 2) beschrijven we verschillende miRNAs die reeds als biomarkers zijn onderzocht. Er is echter weinig overlap tussen deze miRNAs in de verschillende studies, wat diverse oorzaken kan heb-ben. Ten eerste is er een grote variabiliteit in de methodologie en werden circulerende miRNAs in kleine groepen onderzocht. Tevens werden niet alle resultaten gevalideerd in onafhankelijke cohorten. In hartfalen zijn de natriuretische peptiden (BNP en NT-proBNP) de meest gebruikte biomarkers in de dagelijkse praktijk. Slechts in enkele studies waarin miRNAs werden onderzocht als biomarkers is gekeken naar de toege-voegde waarde van miRNAs in vergelijking of in combinatie met natriuretische peptides. Omdat deze natriuretische peptides slechts een klein gedeelte van alle betrokken pathofysiologische processen in hartfalen weerspiegelen is het goed voorstelbaar dat andere biomarkers zoals miRNAs mogelijk extra informatie zouden kunnen verschaffen in aanvulling op de reeds bekende biomarkers.

Er zijn nog verschillende stappen te nemen voordat miRNAs overwogen kunnen worden als klinisch toepasbare biomarkers. Een gestandaardiseerde meetmethode zou ontwikkeld moeten worden met daarbij een algemeen geaccepteerde manier voor data normalisatie. Daarnaast zullen de te bestuderen populaties groter moeten worden en zal in de data analyse de toegevoegde waarde van miRNAs in vergelijking met of bovenop conventionele biomarkers en klinische parameters meegenomen moeten worden. Tot slot, idealiter zouden biomarkers de klinische praktijk positief moeten veranderen, door bijvoorbeeld het makkelijker stellen van de diagnose, het bewerkstelligen van aanpas-singen in therapie of door betere klinische uitkomsten.

Een andere eigenschap van biomarkers is dat ze pathofysiologische mechanismen reflecteren. In hartfalen, en met name in hartfalen met een behouden ejectiefractie (HFpEF) is er weinig bekend over de verschillende mechanismen die leiden tot dit ziek-tebeeld. Circulerende miRNAs zouden bij kunnen dragen aan de kennis op dit gebied en additionele informatie kunnen verschaffen over de onderliggende biologische mecha-nismen. Hiervoor is tevens uitgebreide kennis nodig over hun oorsprong, uitscheiding in de circulatie, mogelijke opname door organen en de associatie met miRNA expressie in weefsels. Ondanks de reeds gemaakte progressie op dit gebied is er meer onderzoek nodig om de exacte biologie van circulerende miRNAs te begrijpen. Er zijn dus nog meer-dere hindernissen te overwinnen op weg naar de klinische applicatie van circulerende miRNAs en op dit moment lijkt er geen plaats voor circulerende miRNAs als biomarkers voor de diagnose, prognose en evaluatie van therapie in hartfalen patiënten.

Potentiele therapeutische toepassingen

De functie van miRNAs kan worden geremd of gestimuleerd door antimirs en miRNA

mimics, respectievelijk. De mogelijkheid om de regulerende functie van miRNAs te kun-nen beïnvloeden heeft tot vele studies geleid die de therapeutische mogelijkheden van miRNAs onderzoeken. De reeds bekende sequenties met complementaire binding aan het mRNA in combinatie met het kleine formaat maakt ze aantrekkelijke aangrijpings-punten voor therapie. De farmacologische ontwikkelingen van vooral antimirs heeft de afgelopen jaren veel progressie gemaakt, zowel op cardiovasculair als niet-cardiovascu-lair gebied. Er zijn tot op heden nog geen klinische trials opgezet in hartfalen patiënten, maar pre-klinisch werk met verschillende diermodellen heeft reeds successen geboekt. Zo kunnen specifieke miRNAs geremd worden door anitmirs, wat er toe leidt dat proces-sen zoals cardiale fibrose en hypertrofie teruggedraaid of voorkomen kunnen worden. Klinische studies zijn reeds gestart voor niet-cardiovasculair ziekten, zoals hepatitis C (met antimir-122), type 2 diabetes (met anitmir-103/107) en longkanker (met miR-16

mimic). Hierbij is Miravirsen, een antimir voor het lever-specifieke miR-122, het dichtst bij klinische toepassing en lopen er op dit moment additionele fase II studies waarbij ook lange termijn effecten worden onderzocht.

Terwijl de toekomst van miRNAs als biomarkers nog onzeker is, lijkt de toekomstige toepassing van miRNAs als aangrijpingspunten voor therapie dichtbij. Dit komt door de reeds behaalde successen in het cardiovasculaire pre-klinische veld en klinische studies in andere vakgebieden. Toch zijn er nog diverse obstakels die de ontwikkeling van op miRNA gebaseerde therapieën bemoeilijken. Zo is de selectie van een miRNA als poten-tieel, ziekte-specifiek aangrijpingspunt lastig. Dit is vooral het geval bij hartfalen, wat een zeer heterogene populatie betreft waarbij verschillende mechanismen en pathways betrokken zijn. Integratie van miRNA(-sequencing) data met mRNA en proteomics zou een gedetailleerde netwerk analyse mogelijk moeten maken om zo díe regulators te

A

se-quencing en CLIP-seq zijn in staat om in het gehele genoom miRNA-mRNA interacties te bestuderen, zodat eenvoudiger veelbelovende miRNA aangrijpingspunten geselecteerd kunnen worden. Zoals ook in dit proefschrift is aangetoond, is het lastig om humane data te vertalen naar resultaten in diermodellen. Ondanks dat de conservatie van de meeste miRNAs behouden lijkt te zijn, kan de precieze miRNA functie en hun rol in het ontstaan van hartfalen verschillend zijn in mensen en dieren en dit bemoeilijkt de zoek-tocht naar een geschikt diermodel. Daarnaast is er meer onderzoek nodig naar stabiele technieken die het afleveren van medicamenten op de juiste plaats mogelijk maken, waarbij ook rekening gehouden dient te worden met off-target effecten.

Toch lijken op miRNA gebaseerde nieuwe therapieën veelbelovende mogelijkheden voor de toekomst en zullen naar verwachting ook de eerste klinische studies in patiën-ten met cardiovasculaire ziekpatiën-ten en hartfalen worden gestart.

Long non-coding RNAs en circular RNAs

Naast miRNAs zijn er vele andere niet-coderende RNAs die genexpressie kunnen beïnvloeden. De meeste hiervan behoren tot de long non-coding RNAs (lncRNAs). Dit zijn grote transcripten (>200 nucleotiden) welke niet coderen voor eiwitten (enkele uitzonderingen daargelaten). In tegenstelling tot miRNAs zijn lncRNAs minder goed ge-conserveerd in verschillende organismen. De genexpressie regulerende functie is zeer divers en kan zowel op transcriptioneel als translationeel niveau plaatsvinden. De pre-cieze werkingsmechanismen zijn echter nog niet bekend. LncRNAs zijn reeds in verband gebracht met cardiovasculaire ziekte en hartfalen. Zo is bijvoorbeeld de lncRNA MIAT geassocieerd met het risico op een myocardinfarct en is MYHEART gerelateerd aan het ontstaan van cardiale hypertrofie. Er is weinig onderzoek verricht naar de rol van circu-lerende lncRNAs in hartziekten en in het specifiek hartfalen. In het bloed van patiënten die een myocardinfarct hebben doorgemaakt was de circulerende lncRNA LIPCAR ge-identificeerd als voorspeller van cardiale remodeling en het risico op overlijden. Tevens verschillen de circulerende levels van MYHEART en NRON in hartfalen patiënten met dat van gezonde individuen. De meeste studies hebben bij het identificeren van deze markers gekeken naar de differentiële expressie tussen gezonde mensen en patiënten met cardiovasculaire ziekte. Het is echter niet aannemelijk dat deze methode gaat leiden tot potentiële nieuwe hartfalen biomarkers. Het is zeer wenselijk meer te weten te komen over hun werkingsmechanisme, gezien het niet tot nauwelijks bekend is hoe de reeds beschreven lncRNAs functioneren en hoe specifiek ze hartfalen gerelateerde processen reflecteren. Daarnaast is de verminderde conservatie een punt van aandacht en een beperkende factor in de translatie van diermodellen naar de humane setting en andersom. Omdat de plasma concentraties van lncRNAs over het algemeen laag zijn, is het betrouwbaar detecteren van lncRNAs lastig. Bloed zou daarom een betere bron van

lncRNAs zijn, al kunnen de verschillende bloedcomponenten ook van invloed zijn op de expressie van lncRNAs en daarom de interpretatie van de resultaten bemoeilijken.

Circular RNAs (circRNAs) zijn gesloten, cirkelvormige, enkelstrengs transcripten, ge-lokaliseerd in de celkern en cytoplasma van de cel. Ze worden gevormd door precursor mRNA door back-splicing van exonen afkomstig van eiwit coderende genen, al is de pre-cieze biogenese nog niet bekend. CircRNAs zijn al meer dan 2 decennia bekend, maar onderzoekers dachten toentertijd dat ze niet functioneel en slechts splicing bijproduc-ten waren. Nu is bekend dat ze aanwezig zijn in meerdere organismen, in zowel weefsels als in de circulatie, waarbij sommige circRNAs in staat zijn genexpressie te reguleren. Hierbij kunnen ze functioneren als concurrenten van mRNAs voor miRNA binding en kunnen ze genexpressie reguleren in cis (nabij gelegen loci). Verder wordt gedacht dat door vorming van circRNAs er simpelweg minder mRNAs gevormd kunnen worden. Cir-cRNAs zijn ook detecteerbaar in bloed, al is de rol van cirCir-cRNAs als mogelijke biomarkers in hartfalen nog weinig onderzocht. Dit nieuwe veld biedt waardevolle mogelijkheden om de reeds beschikbare kennis wat betreft de rol van niet-coderende RNAs in hartfalen uit te breiden. Ondanks dat de implementatie van circRNAs als mogelijke biomarkers ruwweg dezelfde obstakels kent als die van lncRNAs en miRNAs, is het gunstig dat deze circRNAs in relatief grote hoeveelheden aanwezig zijn in de circulatie. Daarnaast is een groot gedeelte van de (bekende) circRNAs cel specifiek. Al met al maken deze laatste eigenschappen circRNAs aantrekkelijk voor verdere exploratie in hartfalen.

Klinische toepasbaarheid van lncRNAs en circRNAs als biomarkers lijkt niet in de nabije toekomst te liggen. Er is nog veel te leren over hun biogenese en functie, welke mogelijk meer inzicht kan geven over de pathofysiologische mechanismen in cardiovasculaire ziekten en hartfalen. Dit biedt tevens de mogelijkheid om hun rol als mogelijke aangrij-pingspunten voor therapie te onderzoeken. De specificiteit voor bepaalde celtypen of organen en de relatief hoge weefsel expressie zijn hierbij gunstige factoren.

Dankwoord

A

graag op deze manier zou willen bedanken.

Beste prof. Voors, beste Adriaan, ik had geen betere promotor kunnen treffen; het was fantastisch om ruim drie jaar lang te mogen samenwerken aan een nieuw en interes-sant project. Je enthousiasme werkt enorm stimulerend en hierdoor heb ik altijd het vertrouwen gehad dit promotietraject tot een goed einde te brengen. Je betrokkenheid heb ik erg gewaardeerd en ik ben dankbaar voor de ruimte die jij mij hebt geboden om te groeien in mijn kennis en vaardigheden. Ontzettend bedankt voor deze uitdaging en goede tijd!

Beste dr. van der Meer, beste Peter, dankzij jou heb ik de mogelijkheid gekregen naar Boston te gaan voor mijn onderzoeksstage in het laatste jaar van mijn studie, om zo mijn eerste stappen in de wetenschap te zetten. Deze ervaring heeft mijn interesse in het doen van onderzoek gewekt en daar ben ik je enorm dankbaar voor. Als copromotor heb ik veel aan je eerlijke, scherpe blik gehad. Hierdoor zijn mijn stukken naar een hoger niveau getild en daar wil ik je ontzettend voor bedanken.

Graag wil ik de leden van de leescommissie hartelijk bedanken voor het lezen en beoor-delen van dit proefschrift; prof. dr. L.J. de Windt, prof. dr. J. van der Velden en prof. dr. M.P. van den Berg.

Dear prof. dr. Berezikov, dear Eugene, thank you for your valuable input on the circu-lating microRNA projects. Your detailed knowledge on the subject and critical point of view was crucial for the methodology of our projects. Thank you for the possibility to perform the microRNA measurements in your laboratory at the ERIBA institute.

Prof. dr. van der Harst, Pim, bedankt voor je hulp bij verschillende projecten binnen mijn promotieonderzoek. Vooral bij lastige statistische en genetische kwesties was je input zeer waardevol.

Prof. dr. van Veldhuisen, beste Dirk Jan, bedankt dat ik de mogelijkheid heb gekregen om binnen deze afdeling mijn promotieonderzoek te kunnen verrichten. Tevens heb ik de behulpzame feedback en inhoudelijke bijdragen aan meerdere projecten zeer gewaardeerd.

Prof. dr. de Boer, beste Rudolf, bedankt voor je betrokkenheid bij met name hoofdstuk 7. Ondanks de “negatieve” resultaten zag jij het belang van dit onderzoek en heb je een belangrijke rol gespeeld in het tot stand komen van de resultaten en het artikel.

Beste dr. Silljé, beste Herman, ook jou wil ik hartelijk danken voor je waardevolle bij-drage aan dit laatste hoofdstuk. Je kennis van diermodellen en hulp bij het vormgeven van het artikel is hierbij zeer nuttig geweest.

Dear Katya, it was a pleasure working together with you on the circulating microRNA projects. I can’t remember how many qPCR’s we ran (many!!), but I’m extremely grate-ful for your help and expertise. I also want to thank you for all the fun and good talks, especially the ESC-HF conference in Seville was memorable.

Dear Daniela, thank you for the great collaboration of the last couple years. Although based in two different countries, we managed to successfully work on several projects and papers, in which your contribution was gratefully acknowledged. It was very special to take part in your thesis defense as your paranymph.

Mohsin and Yanick, thank you for all your methodological and statistical help regarding Chapter 4. It has been a long yet interesting journey exploring the different aspects of the data and I’m grateful for the work you both have done.

Dr. Domian, many thanks for the possibility to start a research fellowship at your labo-ratory at the Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School, in Boston. I’ve had an amazing time and learned so much in these 7 months; on how to expand and differentiate embryonic stem cells to surviving Nemo, the winter storm of February 2013. This interesting project in the cardioregenerative field made me realize I wanted to pursue a PhD in cardiology.

Dear Prof. Sir Samani, I’m grateful I was given the opportunity to join your research team at the Cardiovascular Research Department, University of Leicester, a couple months ago. Working on the transcriptomics data of BIOSTAT focusing on long non-coding RNAs was an exciting follow-up on my previous microRNA work. Simon and Mintu, I want to thank you for the great collaboration on the protein coding and non-protein coding projects. Your detailed knowledge of the complicated dataset is noteworthy, and it was a pleasure working with the both of you. Stephen and Chris, I also want to thank you for the great time and collaboration.

Beste Alma, Audrey, Daniëlle en Carla; jullie zijn absoluut onmisbaar geweest in de afgelopen paar jaar, ik wil jullie ontzettend bedanken voor al jullie steun en hulp! Afgelopen paar jaar heb ik met veel plezier gewerkt aan vele klinische hartfalen studies in samenwerking met de Cardio Research. Ik zou iedereen ontzettend willen bedanken

A

Ca-rolien, Trienke, Carlien, Margriet en Geert, het was mij een genoegen! Geert, bedankt voor de kopjes koffie met wat lekkers uit de snackjesla en natuurlijk de gezelligheid in Frankfurt.

Lieve hartfalers, of zoals bij de pubquiz; hardfalers, ik heb het ontzettend naar mijn zin gehad de afgelopen paar jaar, en dit was mede te danken aan deze fantastische groep; van Mattia, IJsbrand, Sven en Rogier (ofwel de “oude garde”) tot aan Harmen, Wouter, Licette, Jozine, Thomas, Laura, Koen en de “nieuwe lichting” Bernadet, Jan en David; ik heb een top tijd gehad, zowel op het werk als daarbuiten (de legendarische ESC-HF congressen, borrels, uitjes, weekenden en nog veel meer!), heel erg bedankt hiervoor! Dan uiteraard mijn lieve kamergenootjes waar ik het zowel op onderzoeksvlak als daarbuiten ontzettend mee heb getroffen. Hanna, in het Triade gebouw hebben wij samen in de zomer een loeiwarme en in de winter een ijskoude kamer mogen delen. Gelukkig hadden we, naast al onze onderzoeksperikelen, genoeg theepauzes om ook even rustig bij te kletsen. Jozine, naast een top collega ben je ook nog eens ontzettend gezellig en zijn we goede borrelmaatjes. Wat een mooie tijd hebben we beleefd tijdens de 4(!) ESC-HF congressen, als vaste hotelkamergenoten konden we natuurlijk ook alle enerverende gebeurtenissen nog eens rustig nabespreken. Tot op de volgende borrel! Licette, ik heb een ontzettend leuke tijd met jou als collega gehad, maar zeker ook daarna! Jammer dat je het mooie Groningen gaat verlaten, we houden onze koffie- en borreldates hopelijk gewoon in stand! Dear Biniyam, you have been my roommate for the longest time and I couldn’t have asked for a better one. Beside the fact that you are the best “statistical team”, you are also funny and great to talk to. I have tons of respect for your perseverance and ambition and wish you and your wife all the best for the future, wherever that may be! Koen, mijn partner-in-crime als het gaat om heerlijk Italiaans eten, de vrolijke noot van onze kamer en daarnaast ook nog eens heel sociaal. Bedankt voor de fijne tijd! Bernadet, wat ben je een goede aanvulling op onze hartfalen groep. Bedankt voor alle gezelligheid tijdens de eindfase van mijn promotietraject! Ook alle andere (oud)collega’s van de (experimentele) cardiologie wil ik ontzettend be-danken; Minke, Anne H., Jennie, Rob, Ernaldo, Bastiaan, Mariëlle, Meelad, Ruben de W., Ruben E., Ymkje, Niels, Haye, Jasper, Yuya, Lawien, Johanneke, Carlijn, Chris, Hilde, Tom H., Marthe, Marlies, Mathilde, Salva, Nils, Carolin, Atze, Wouter te R., Anne S., Joylene, Navin, Vincent, Aad, Irene, Janny, Niek, Martin, Tom van L., Silke, Marloes, Guido, Randy, Diederik, Yldau, Quint, Martijn, Edgar, Lysanne, Sebastiaan, Anne-Marie, Arnold, Jin Li en Sophie.

En niet te vergeten alle lieve vrienden waarmee ik vooral ook niet promotie-gerelateerd lief en leed kon delen; bedankt lieve jaarclub, bedankt lieve chiquita’s en bedankt lieve vrienden in Groningen en (ver) daarbuiten; ik had het niet zonder jullie gekund!

Dan mijn paranimfen; ik ben heel blij en trots dat ik jullie aan mijn zijde heb. Jullie zijn mij enorm dierbaar en gelukkig zien we elkaar nog regelmatig, ondanks het feit dat we in 3 verschillende steden wonen. Lieve Jozien, nadat ik eerst als jouw paranimf je met verve je proefschrift heb zien verdedigen, vind ik het fantastisch dat je nu hetzelfde voor mij wilt doen. Naast een geweldig bestuursgenootje alweer lang geleden ben je bovenal een goede vriendin en daar ben ik heel dankbaar voor. Lieve Laura, over een tijdje sta je hier zelf, wat een respect heb ik voor je doorzettingsvermogen. Ik wil je ontzettend bedanken voor alle steun de afgelopen tijd en zeker ook de gezelligheid!

Lieve schoonfamilie, lieve Henk Jan & Jacqueline, Dirk & Indra, Paul & Nynke en Fre-derieke & Owen, wat voel ik me thuis bij jullie! Bedankt voor alle leuke momenten, heerlijke vakanties, gezellige etentjes en fijne weekenden in zowel Rome als Hengelo. Lieve opa en oma Visser en opa en oma Vegter, wat ben ik dankbaar ik jullie in mijn midden heb.

Lieve Rik, wat fijn om een broertje te hebben dat in zo veel opzichten zo verschillend van mij is maar toch ook zo hetzelfde. Je humor en muzikaliteit maken dat het thuis in Lochem nooit saai is. Sara, wat fijn dat jij erbij gekomen bent! Ik ben jullie erg dankbaar voor de prachtige omslag van dit proefschrift.

Pap, mam, zonder jullie steun was ik nooit gekomen waar ik nu ben. Jullie nuchtere blik en vertrouwen hebben mij enorm geholpen deze mijlpaal te bereiken. Bedankt voor alle zorg, liefde en het feit dat jullie er altijd voor mij zijn.

Lieve Harm, het is moeilijk in woorden uit te drukken hoeveel jij voor mij betekent. Je steun, liefde en vertrouwen waren voor mij onmisbaar tijdens deze periode. Nog even en dan promoveer je zelf; ik ben zo enorm trots op je! Ik kijk er naar uit om volgend jaar volmondig “ja” tegen je te zeggen en ben ervan overtuigd dat we nog heel veel mooie momenten samen gaan beleven!

A

She grew up and attended primary school in Baarlo, after which she moved with her family to Lochem. Here, she attended pre-university secondary education and ob-tained her Gymnasium degree in 2006. Eline started Life Science and Technology at the University of Groningen and obtained her propaedeutic degree in 2007. After this, she started medical school at the University of Groningen. During her first years as a medical student she actively participated in the International Federation of Medical Students’ Association, and from 2009 to 2010 she was a board member of the Inter-national Student Congress of (bio)Medical Sciences. In 2010, she started her clinical rotations at the University Medical Center Groningen (UMCG) and proceeded with her second year in the Deventer Ziekenhuis, where she also functioned as president of the Intern Committee. Eline conducted her research fellowship at Harvard Medical School in Boston (Massachusetts, USA) in her final year of medical school, under the supervi-sion of Dr. Domian and Dr. van der Meer. Here, she investigated the proliferation and differentiation of embryonic and stem cell-derived cardiomyocytes and gained experi-ence in the cardioregenerative research field. After her final clinical internship at the cardiology department of the UMCG, she graduated from medical school in April 2014. She started her PhD project with Prof. Dr. Voors and Dr. van der Meer focusing on the role of circulating microRNAs in heart failure. In the last year of her PhD project she spent two months at the Department of Cardiovascular Sciences at the University of Leicester (United Kingdom) to investigate circulating long non-coding RNAs in heart failure, under the supervision of Prof. Sir Samani. Her PhD project resulted in this thesis which she plans to defend on October 18, 2017. In the summer of 2017 she started as a cardiology resident at the UMCG.

A

Harst P, Pinto YM, de Boer RA, Meyer S, Teerlink JR, O’Connor CM, Metra M, Davison BA, Bloomfield DM, Cotter G, Cleland JG, Mebazaa A, Laribi S, Givertz MM, Ponikowski P, van der Meer P, van Veldhuisen DJ, Voors AA, Berezikov E. Signature of circulating microRNAs in patients with acute heart failure. Eur J Heart Fail. 2016 Apr;18(4):414-23.

Bruno N, ter Maaten JM, Ovchinnikova ES, Vegter EL, Valente MA, van der Meer P, de

Boer RA, van der Harst P, Schmitter D, Metra M, O’Connor CM, Ponikowski P, Teerlink JR, Cotter G, Davison B, Cleland JG, Givertz MM, Bloomfield DM, Dittrich HC, Pinto YM, van Veldhuisen DJ, Hillege HL, Berezikov E, Voors AA. MicroRNAs relate to early worsening of renal function in patients with acute heart failure. Int J Cardiol. 2016 Jan 15;203:564-9.

Vegter EL, van der Meer P, de Windt LJ, Pinto YM, Voors AA. MicroRNAs in heart failure:

from biomarker to target for therapy. Eur J Heart Fail. 2016 May;18(5):457-68.

Vegter EL, Schmitter D, Hagemeijer Y, Ovchinnikova ES, van der Harst P, Teerlink JR,

O’Connor CM, Metra M, Davison BA, Bloomfield D, Cotter G, Cleland JG, Givertz MM, Ponikowski P, van Veldhuisen DJ, van der Meer P, Berezikov E, Voors AA, Khan MA. Use of biomarkers to establish potential role and function of circulating microRNAs in acute heart failure. Int J Cardiol. 2016 Dec 1;224:231-239.

Vegter EL, Ovchinnikova ES, van Veldhuisen DJ, Jaarsma T, Berezikov E, van der Meer P,

Voors AA. Low circulating microRNA levels in heart failure patients are associated with atherosclerotic disease and cardiovascular-related rehospitalizations. Clin Res Cardiol. 2017 Aug;106(8):598-609.

Vegter EL, Ovchinnikova ES, Silljé HHW, Meems LMG, van der Pol A, van der Velde AR,

Berezikov E, Voors AA, de Boer RA, van der Meer P. Rodent heart failure models do not reflect the human circulating microRNA signature in heart failure. PLoS One. 2017 May 5;12(5):e0177242.

Vegter EL, van der Meer P, Voors AA. Associations between volume status and circulating

microRNAs in acute heart failure. Eur J Heart Fail. 2017 Aug;19(8):1077-1078.

Grote Beverborg N, Klip YT, Meijers WC, Voors AA, Vegter EL, van der Wal HH, Swinkels

DW, van Pelt J, Mulder AB, Bulstra SK, Vellenga E, Mariani MA, de Boer RA, van Veldhuisen DJ, van der Meer P. Definition of iron deficiency based on the gold standard of bone marrow iron staining in heart failure patients. Submitted