Magnetic tweezers based force spectroscopy studies of the structure and dynamics of nucleosomes and chromatin
Kruithof, M.C.
Citation
Kruithof, M. C. (2009, October 1). Magnetic tweezers based force spectroscopy studies of the structure and dynamics of nucleosomes and chromatin. Retrieved from https://hdl.handle.net/1887/14030
Version: Corrected Publisher’s Version
License: Licence agreement concerning inclusion of doctoral thesis in the Institutional Repository of the University of Leiden
Downloaded from: https://hdl.handle.net/1887/14030
Note: To cite this publication please use the final published version (if
applicable).
Samenvatting
Dieren en planten bestaan uit een groot aantal cellen. Deze cellen reageren voortdurend op signalen van buiten en binnen de cel door diverse soorten eiwitten te maken. De bouwte- keningen van deze eiwitten zijn opgeslagen in de genen van de cel. De genen in cellen met een celkern bevinden zich in zogenaamde chromosomen: draadachtige structuren in de cel- kern die zichtbaar worden wanneer de cel, tijdens het delen, deze structuren condenseert.
De chromosomen bestaan ruwweg uit twee onderdelen: eiwitten, die zorgen voor conden- satie en DNA, de drager van de genetische informatie van de cel. Zonder condensatie zou het DNA van een menselijke cel nooit in de celkern passen. Bij een celdeling moet het DNA nog meer worden gecondenseerd. De condensatie moet op een ordelijke manier gebeuren zo- dat de chromosomen correct worden gedupliceerd bij iedere celdeling. Behalve dat het DNA compact moet zijn, moet het, voor de werking van de genen, nog wel toegankelijk zijn voor eiwitten. De cel moet het DNA dus kunnen opvouwen en weer ontvouwen. Dit opvouwen en ontvouwen kan zelfs gebruikt worden door de cel om de activiteit van de genen te reguleren.
Voor een volledig inzicht in opvouwen en ontvouwen van DNA, moeten wij, in moleculair detail, niet alleen de structuur maar ook de dynamica van het opvouwen van DNA begrijpen.
Op het eerste niveau van compactie, wikkelt DNA twee keer om specifieke eiwitten, histo- nen genaamd. Het DNA-histon complex wordt een nucleosoom genoemd. Een ander histon, het zogenaamde linker histon, bindt aan het DNA dat uit het nucleosoom komt, waardoor de structuur van het nucleosoom wordt gestabiliseerd. Onder fysiologische omstandigheden vouwt een lange ketting van nucleosomen zich tot een compacte vezel, die bekend staat als een chromatine vezel. De steeds veranderende structuur van nucleosomen en de interactie tussen nucleosomen in een chromatine vezel speelt een belangrijke rol in het opvouwen en ontvouwen van DNA. Wij hebben gekozen voor het gebruik van krachtspectroscopie omdat deze techniek het mogelijk maakt om de structuur en de dynamica van de nucleosomen op het niveau van enkele moleculen te bestuderen.
In hoofdstuk introduceerden wij een eenvoudige methode om dynamische krachtspectro- scopie op enkele moleculen uit te voeren, met behulp van een magnetisch pincet. Deze me- thode maakt het mogelijk om krachten kleiner dan een piconewton uit te oefenen op enkele moleculen, door de kracht te kalibreren aan de afstand tussen de magneten en de magnetische bolletjes waaraan wordt getrokken door het magnetische pincet. Bij de eerste dynamische krachtspectroscopie experimenten op DNA moleculen zagen wij een grote hysterese in de kracht-uitrekkingscurve. Deze hysterese werd veroorzaakt door de weerstand die het mag- netische bolletje ondervond in water en zou het onmogelijk maken de zwakke interacties tussen DNA en eiwitten te meten. Kleinere bolletjes verminderden deze weerstand en dus de hysterese waardoor het mogelijk werd intramoleculaire interactie te bestuderen bij krachten kleiner dan een piconewton. Onze methode is significant sneller dan de gebruikelijke quasi- statische krachtspectroscopie waardoor het mogelijk word snel veranderende structuren en tussenproducten van reacties te bestuderen. Als een eerste bewijs van onze methode hebben we de nucleosoom-nucleosoom interacties van niet volledig bezet chromatine geanalyseerd.
In hoofdstuk onderzochten wij de Brownse beweging van het magnetisch bolletje in een mag- netisch pincet. Wij bestudeerden het krachtsafhankelijke ontwikkelen van DNA van enkele nucleosomen met statische krachtspectroscopie. We lieten zien dat met verborgen Markov analyse, aangepast voor het niet-lineaire uitrekkings gedrag van DNA, lengteveranderingen in het DNA tijdens het onwikkelen gemakkelijk geanalyseerd kan worden zelfs als die lengteveran- deringen beduidend kleiner zijn dan de Brownse bewegingen. De waarschijnlijkheidsdistribu- tie van de hoogte van het magnetische bolletje werd gebruikt om de contourlengte en persi- stentielengte van het DNA molecuul met een nucleosoom nauwkeurig te bepalen. Wij lieten zien dat de persistentielengte direct gerelateerd is aan de buigingshoek van het DNA dat uit het nucleosoom komt. De aangepaste verborgen Markov analyse kan voor ieder snel veran- derend DNA-eiwit complex worden gebruikt en is een robuuste methode voor het onderzoek aan deze snel veranderende complexen.
In hoofdstuk bestudeerden wij de mechanische eigenschappen van een reeks van nucle- osomen, gevouwen tot een chromatine vezel met behulp van een magnetisch pincet. De vezel rekte lineair, als een Hookse veer, uit tot meer dan drie keer de startlengte bij krachten tot pN.
Deze onverwacht grote uitrekking toont aan dat een chromatine vezel een enkele spiraal als onderliggende structuur heeft. Verrassend genoeg beïnvloeden linker histonen de lengte of de stijfheid van de vezels niet. Ze stabiliseerden de vezel wel tot krachten van pN. De chroma- tine vezels met baseparen DNA tussen de nucleosomen in plaats van baseparen waren beduidend stijver en rekten minder ver uit, overeenkomend met twee in elkaar grijpende spi- ralen als structuur. De uitgebreide thermische ademhaling van de chromatine vezel, die een gevolg is van de waargenomen hoge flexibiliteit, vormt een basis voor het evenwicht tussen de
Samenvatting
compactie van DNA om in de celkern te passen en de openheid van het DNA om uitgelezen te worden door eiwitten.
In hoofdstuk onderzochten wij het onverwachte verschil tussen experimenten op enkele nu- cleosomen en nucleosomen in een chromatine vezel, in de kracht die nodig is voor het ont- wikkelen van de eerste en de tweede wikkeling van het DNA in een nucleosoom. De benodigde kracht voor het ontwikkelen voor een enkele nucleosoom was veel kleiner, pN voor de eerste wikkeling en pN voor de tweede wikkeling, dan die voor nucleosoom in een vezel, respec- tievelijk pN en pN. Wij modelleerden het nucleosoom-DNA-bol systeem, zoals gebruikt is in de krachtspectroscopie experimenten, als bollen en veren. Wij vonden dat de thermische bewegingen van naburige nucleosomen een nucleosoom in een vezel stabiliseerden, waardoor de benodigde kracht voor het ontwikkelen ervan werd verhoogd. Dit effect toont aan dat de resultaten die voor enkele nucleosomen worden verkregen niet eenvoudig uit te breiden zijn naar een systeem dat meer dan één nucleosoom bevat.
