The keloid disorder
Limandjaja, G.C.
2020
document version
Publisher's PDF, also known as Version of record
Link to publication in VU Research Portal
citation for published version (APA)
Limandjaja, G. C. (2020). The keloid disorder: Histopathology and in vitro reconstruction.
General rights
Copyright and moral rights for the publications made accessible in the public portal are retained by the authors and/or other copyright owners and it is a condition of accessing publications that users recognise and abide by the legal requirements associated with these rights. • Users may download and print one copy of any publication from the public portal for the purpose of private study or research. • You may not further distribute the material or use it for any profit-making activity or commercial gain
• You may freely distribute the URL identifying the publication in the public portal ? Take down policy
If you believe that this document breaches copyright please contact us providing details, and we will remove access to the work immediately and investigate your claim.
E-mail address:
C ha C ha pt er 2 C ha pt er 3 C ha pt er 4 C ha pt er 5 C ha pt er 6 C ha pt er 7 C ha pt er 8 C ha pt er 9 A pp en di ce s
Chapter 9
Nederlandse samenvatting
Keloïden:
histopathologie en in vitro
reconstructie
OVERZICHT
1. Histopathologische afwijkingen in keloïden 2. In vitro reconstructie van keloïden
C
ha
pt
er
9
Onze huid is het meest zichtbare, maar ook het grootste en zwaarste orgaan dat gemid-deld een oppervlakte van 1.5-2 m2 beslaat en 15% van het totale lichaamsgewicht in
beslag neemt [18, 19, 30]. De huid bedekt en omvat alle lichaamsstructuren en is een voortzetting van de slijmvlies belijning die de binnenkant van het lichaam bekleedt. Op microscopisch niveau is de huid te onderscheiden in een epidermis (opperhuid) en de daaronder gelegen dermis (lederhuid). De epidermis heeft met name een bedekkende functie, terwijl de dermis voor de stevigheid van de huid zorgt. Onder de dermis bevindt zich de subcutis, een vetlaag die de huid scheidt van de bindweefsellaag (fascie) rond-om de spieren. De huid vervult meerdere belangrijke functies, waaronder temperatuur-regulatie, tastzin en vitamine D3 productie. Tevens functioneert de huid als een fysieke
barriere en heeft daarmee een belangrijke beschermende functie tegen mechanische, chemische en andere aanvallen van buitenaf (e.g. UV bestraling, brandwonden); maar ook tegen vochtverlies en infectie met micro-organismen. [18, 19, 34]
Wanneer de fysieke barriere van de huid doorbroken wordt in het geval van verwon-ding of andersoortig letsel, worden de verschillende processen van de wondgenezing in gang gezet die uiteindelijk leiden tot het vormen van een vrij smal en relatief onopvallend litteken. Soms echter ontspoort de wondgenezing en ontstaan er abnormale littekens, zoals hypertrofische littekens of keloïden. [18, 30] Hypertrofische littekens zijn verheven littekens waarvan de groei beperkt blijft tot rondom de grenzen van de oorspronkelijke wond. Ze komen vaker voor dan keloïden en het risico op hypertrofische littekenvorming is aanzienlijk groter naarmate de diepte van de verwonding toeneemt. [4, 10] Keloïden zijn abnormale, verheven littekens, die vaak na een relatief klein trauma of ontsteking kunnen ontstaan en gekenmerkt worden door hun invasieve, buitensporige groei buiten de grenzen van de oorspronkelijke verwonding [5, 12, 32]. Ze komen minder vaak voor dan hun hypertrofische tegenhangers, maar de kans op keloïdvorming is beduidend groter in donker gepigmenteerde ethniciteiten [5, 32]. Keloïden ontstaan meestal bin-nen enkele maanden na de verwonding, maar kunbin-nen ook pas jaren later ontstaan [9]. Hoewel keloïden goedaardig zijn, kunnen ze door hun omvang veel ongemak en beperking van beweging veroorzaken, klachten van jeuk of pijn geven en een sociaal stigma geven wanneer ze zich bevinden op zichtbare plekken [3, 14]. Uitermate verve-lend daarbij is dat keloïden heel moeilijk te behandelen zijn en vaak terugkomen als ze operatief worden verwijderd, en dan vaak nog groter dan ervoor [2, 6, 27, 29]. Dit blijft een grote bron van frustratie voor zowel de patient als de behandelaar en geeft aan hoe weinig we eigenlijk begrijpen van de processen die keloïdvorming veroorzaken.
Het doel van het onderzoek beschreven in dit proefschrift was om keloïden te onder-zoeken door een in vitro keloïd model te ontwikkelen met behulp van nieuwe, state-of-the-art, ‘skin tissue engineering’ technieken. De resultaten van dit onderzoek kunnen grotendeels onderverdeeld worden in twee delen (zie fig. 14 van hoofdstuk 1): i. een EX VIVO deel waarin weefselbiopten van keloïden bestudeerd werden (hoofdstuk 2-3), en ii. een IN VITRO deel waarin weefselkweek van keloïd-cellen centraal staat (hoofdstuk 4-7). In het eerste deel (ex vivo) hebben we de epidermis en dermis van keloïden en andere littekensoorten nader onderzocht, tevens om nieuwe keloïd-parameters te identificeren waaraan we de in vitro reconstructie in het tweede deel konden toetsen. In het tweede deel (in vitro) hebben we gepoogd om het keloïd na te bootsen in het lab
middels weefselkweek van keloïd-cellen, in eerste instantie met cellen van de keloïd epidermis en dermis, maar later ook met keloïd immuuncellen (monocyten).
1. HISTOPATHOLOGISCHE AFWIJKINGEN IN KELOÏDEN
In hoofdstuk 2 en 3 hebben we onze aandacht gericht op de epidermale component
van de keloïden, een onderdeel van de huid dat nog vaak over het hoofd wordt gezien in onderzoek naar keloïden (zie fig. 1 van hoofdstuk 8). In normale huid toont de epider-mis in de diepst gelegen cellaag een kartelend profiel, deze golvende kartels worden ook wel retelijsten genoemd en zorgen ervoor dat de epidermis meer grip heeft op de onderliggende dermis [18]. In keloïden waren aanzienlijk minder retelijsten te zien en was de epidermis daarom meer afgevlakt in vergelijking met de normale huid. Een ver-gelijkbare epidermale afvlakking werd in de normale en hypertrofische littekens gezien. Daarnaast was de epidermis van keloïden ook dikker door een groter aantal cellagen vergeleken met de epidermis van normale huid of normale littekens. Deze toename in epidermale dikte was niet het gevolg van toegenomen celdeling, maar was wel geasso-cieerd met toegenomen expressie van de epidermale differentiatiemarker involucrine. Het eiwit involucrine is een belangrijk onderdeel van de verhoornde envelop (cornified envelope) die samen met de intercellulaire lipidenlaag de barriere functie van de meest oppervlakkig gelegen hoornlaag vervult [23]. Het differentiatieproces dat uiteindelijk leidt tot de vorming van de hoornlaag is een uiterst precies en gecompliceerd proces [7]. Hierdoor ontstond het vermoeden dat naast de abnormale involucrine expressie ook de hoornlaag aangedaan zou kunnen zijn. Uit nader onderzoek bleek dit inderdaad het geval te zijn, de afzonderlijke lagen van de hoornlaag sloten minder goed op elkaar aan en toonden algehele disorganisatie in keloïden vergeleken met normale huid. Hypertrofische littekens toonden ook toegenomen epidermale dikte, maar in 20-30% van de gevallen was daarbij ook normale involucrine expressie te zien. Opvallend was dat in jonge, onvolgroeide littekens van 3-5 weken oud ook involucrine overexpressie te zien was, ondanks dat er geen sprake was van toegenomen epidermale dikte. In tegenstelling tot beide abnormale littekens, toonden de jonge littekens ook toegenomen epidermale celdeling en zelfs nog sterker verminderde retelijstvorming waardoor de epidermis vrijwel geheel was afgevlakt. Concluderend waren er dus epidermale afwij-kingen in zowel keloïden als hypertrofische littekens aanwezig, en deels ook in jonge littekens.
Nadat we hadden vastgesteld dat jonge littekens ook abnormale epidermale invo-lucrine expressie toonden net als de abnormale littekens, ontstond de hypothese dat abnormale littekens wellicht gekenmerkt worden door een onvermogen tot maturatie waardoor het jonge litteken-stadium van de wondgenezing blijft aanhouden. In hoofd-stuk 3 hebben we dit nader onderzocht middels immunohistochemische kleuringen om
met name de dermale celpopulatie in keloïden en hypertrofische littekens te vergelijken met jonge littekens, normale littekens en normale huid. Zowel jonge littekens, keloïden als hypertrofische littekens werden gekenmerkt door de afwezigheid van CD34
expres-C
ha
pt
er
9
sie in combinatie met de aanwezigheid van α-SMA-positieve myofibroblasten. Dit is in sterk contrast met de normale littekens en de normale huid, die beiden in de dermis een CD34+/α-SMA− profiel laten zien. Hoewel jonge littekens daarnaast actief delende (Ki67) cellen bevatten in de epidermis en de dermis, bevatten beide abnormale littekens een toegenomen hoeveelheid verouderde dermale cellen die niet langer in staat waren tot celdeling (p16). Deze resultaten ondersteunen de eerder gestelde hypothese dat in ieder geval een partieel jong litteken-fenotype persisteert in beide abnormale littekens.
Klinisch wordt het verschil tussen beide abnormale littekens gemaakt op basis van de invasieve horizontale groei die zo kenmerkend is voor keloïden. Histopathologisch is het verschil echter niet zo eenduidig. In hoofdstuk 3 onderzochten we ook de
aan-wezigheid van markers die worden beschouwd als onderscheidende kenmerken tus-sen hypertrofische littekens en keloïden. Zo worden dikke collageenbundels genaamd keloïdaal collageen (keloidal collagen) als kenmerkend voor keloïden gezien [18, 22], terwijl de aanwezigheid van contraherende myofibroblasten (α-SMA) en dermale nodu-les als specifiek voor hypertrofische littekens worden gezien [8]. Keloïdaal collageen was altijd aanwezig in keloïden, maar werd ook gevonden in een van de hypertrofische littekens. Dermale nodules bleken echter niet aanwezig in alle hypertrofische littekens en daarnaast bevatten sommige keloïden ook nodules, zij het van kleinere omvang. Tenslotte waren α-SMA-positieve myofibroblasten aanwezig in zowel hypertrofische littekens als in keloïden. Over het algemeen vertoonden keloïden echter verminderde α-SMA immunoreactiviteit met sterkere kleuring rond de marges van het litteken in ver-gelijking met de intensere en diffuus positieve kleuring die werd gezien in hypertrofische littekens. Toegenomen epidermale dikte en involucrine expressie waren aanwezig in beide abnormale littekens, maar hypertrofische littekens toonden meer een gematigd profiel terwijl de epidermale afwijkingen in keloïden meer uitgesproken en constitutief aanwezig waren. Concluderend bleek dus dat de histopathologische afwijkingen tus-sen keloïden en hypertrofische littekens zoals beschreven in hoofdstuk 2 en 3, meer
gradueel dan absoluut van aard zijn. Uiteindelijk maken onze ex vivo epidermale en dermale bevindingen nog geen absoluut onderscheid tussen hypertrofische littekens en keloïden mogelijk, maar suggereren ze wel dat ze niet eenvoudigweg één en dezelfde zijn en onderschrijven ze de algemeen heersende opvatting dat keloïden nog steeds primair op basis van de kliniek gediagnosticeerd worden.
Normaliter worden abnormale littekens niet standaard ingestuurd voor verder pathologisch-anatomisch onderzoek, maar soms kunnen verheven littekens met een onduidelijk groeipatroon daar wel aanleiding toe geven. De bevindingen van hoofdstuk 2 en 3 kunnen dan samen met resultaten van andere onderzoekers [8, 11, 13, 20,
26, 31, 33] ook helpen bij het stellen van de diagnose keloïd of hypertrofisch litteken wanneer de kliniek geen eenduidig beeld geeft (zie ook fig. 5 van hoofdstuk 8). Nadat de diagnose van abnormaal litteken is bevestigd door de afwezigheid van CD34 in combinatie met de aanwezigheid van α-SMA en p16, kunnen we vervolgens proberen onderscheid te maken tussen de twee soorten littekens. Zo wijst een behoorlijke hoe-veelheid keloïdaal collageen, eventuele aanwezigheid van kleinere dermale nodules, beperkte α-SMA immunoreactiviteit die het sterkst is rond de marges van het litteken-gebied, samen met een verdikte en sterk abnormale involucrine-positieve epidermis
sterk richting de diagnose keloïd. Daarentegen wordt het argument voor de diagnose hypertrofisch litteken sterker gemaakt door de combinatie van sterke diffuse a-SMA immunoreactiviteit die geconcentreerd is in grotere dermale nodules (indien aanwezig), en de afwezigheid of verwaarloosbare hoeveelheden keloïdaal collageen, samen met een gematigde involucrine-positieve epidermis.
Samengevat bleek uit het onderzoek naar de huidbiopten van keloïden dat er niet alleen afwijkingen waren in de dermis, maar ook in de daarboven gelegen epidermis (hoofdstuk 2 en 3). Opvallend was dat een deel van deze epidermale en dermale
afwij-kingen ook gevonden werden in hele jonge littekens (3-5 weken oud) en hypertrofische littekens. Dit ondersteunde onze vermoedens dat abnormale littekens blijven hangen in de wondgenezingsfase van de jonge littekens en niet in staat zijn tot maturatie. Tot slot concluderen we ook dat de histopathologische onderscheiding tussen hypertrofische littekens en keloïden op basis van de verschillen in de expressie van involucrine, CD34, α-SMA, p16, keloïdaal collageen and dermale nodules, eerder gradueel dan absoluut van aard zijn; hoewel keloïdaal collageen een sterke biomarker voor keloïd blijft.
2. IN VITRO RECONSTRUCTIE VAN KELOÏDEN
In hoofdstuk 5 hebben we de keratinocyten en fibroblasten afkomstig van keloïdweefsel
gebruikt om een ‘full thickness’, in vitro keloïd model te ontwikkelen en deze te vergelij-ken met normale huid, en normale en hypertrofische littevergelij-ken modellen die op dezelfde wijze waren geproduceerd. Alle kweekmodellen toonden een volledig gedifferentieerde (keratine 10) en prolifererende (Ki67) epidermis bovenop een met fibroblasten gepo-puleerde (vimentine) dermale matrix, ongeact het weefsel van origine (zie fig. 2 van hoofdstuk 8). Er was een niet-significante trend richting toegenomen dermale dikte in de hypertrofische en keloïd kweekmodellen, en beiden toonden significant toegenomen contractie waardoor de kweekmodellen in oppervlakte afnamen. Daarnaast toonde het keloïd model ook verhoogde epidermale genexpressie van het basale membraaneiwit laminine α1 vergeleken met normale littekens, terwijl de dermale genexpressie van collageen IV α2 verlaagd was in het keloïd ten opzichte van de normale huid. Der-male genexpressie van hyaluronan synthase 1 was verlaagd in alle littekenmodellen (normaal, hypertrofisch en keloïd) vergeleken met normale huid, terwijl matrix metal-loproteinase 3 alleen verlaagd was in het hypertrofische littekenmodel en het keloïd model. Tevens scheidde het keloïd model ook signficant verminderde hoeveelheden uit van het anti-fibrotische HGF (hepatocyte growth factor) [21, 22] vergeleken met normale huid, met een vergelijkbare niet-significante trend voor CCL27. We hebben ook het eerder vastgestelde CD34−/α-SMA+/p16+ profiel van de abnormale littekens onder-zocht in onze in vitro kweekmodellen (hoofdstuk 3). CD34 was uniform afwezig in alle kweekmodellen en derhalve niet uniek voor abnormale littekens in vitro. Een mogelijke verklaring ligt in de relatief korte kweekduur van 5 weken, waarin de in vitro kweekmo-dellen nog steeds actief de weefselstructuur aan het opbouwen zijn. Daarnaast zullen de bindweefsel-producerende CD34− dermale cellen nog niet terug zijn veranderd
C
ha
pt
er
9
naar het meer rustende CD34+ [1] fenotype dat normaliter in normale huid en normale littekens gezien wordt. De expressie van α-SMA en p16 was in alle experimentele groepen in enige mate aanwezig, maar de hypertrofische en in het bijzonder de keloïd modellen vertoonden een duidelijke toename in immunoreactiviteit. Dit geeft aan dat het abnormale cellulaire fenotype van keloïden grotendeels behouden blijft gedurende de
in vitro celamplificatie die plaatsvindt tijdens de kweekperiode. Dit valideert tevens het
CD34−/α-SMA+/p16+ biomarker-profiel maar correleert ook verder de bevindingen van de in vitro littekenmodellen aan het originele littekenweefsel. Verhoogde epidermale dikte en verhoogde involucrine-expressie werden eerder geïdentificeerd als epidermale markers van abnormale littekens. De epidermale dikte was echter niet toegenomen in de hypertrofische of keloïd kweekmodellen en involucrine overexpressie was aanwezig in alle kweekmodellen. De celdichtheid (vimentine) was tevens niet verhoogd in beide abnormale littekenmodellen. We vermoeden dat de afwezigheid van deze markers een gevolg kan zijn geweest van het kweekproces, waarbij altijd een kans bestaat dat een deel van de cellulaire afwijkingen verloren gaan door de kunstmatige omgeving waarin de cellen worden gekweekt. Daarnaast is het ook heel goed mogelijk dat voor het ontwikkelen van een extremer keloïd fenotype in vitro − zoals dat zichtbaar is in de keloïdbiopten, de toevoeging van andere celsoorten is vereist.
Waar onze ex vivo bevindingen nog niet tot de ontdekking van absolute verschil-len tussen hypertrofische littekens en keloïden hebben geleid, leidden onze in vitro modellen tot de identificatie van de meeste nieuwe potentiële specifieke hypertrofische littekenmarkers en keloïdmarkers. Zo werd de verlaagde epidermale genexpressie van laminine α1 alleen in het keloïd model gezien, en was er alleen in het hypertrofische littekenmodel sprake van significant verlaagde uitscheiding van CCL5 vergeleken met de normale huid. Het keloïd model toonde ook verschillen vergeleken met het hypertro-fische littekenmodel. In het hypertrohypertro-fische model was er namelijk sprake van verhoogde dermale integrine α5 genexpressie vergeleken met het keloïd model en omgekeerd was de dermale matrix metalloproteinase 1 genexpressie verhoogd in het keloïd model ten opzichte van het hypertrofische litteken. Middels ‘skin tissue engineering’ was het dus mogelijk om nieuwe keloïdmarkers te identificeren die met de immunohistochemische analyses van de huidbiopten alleen niet naar voren waren gekomen.
Klinische observaties van keloïden in patienten hebben geleid tot de speculatie dat keloïden geen eenvoudige homogene gezwellen zijn. Zo is er vaak sprake van een donker gepigmenteerde en verhoogde perifere rand die actief de omliggende huid ingroeit, terwijl het minder verhoogde en lichter gepigmenteerde centrale deel van het keloïd tekenen van klinische regressie toont [16, 17, 28]. In hoofdstuk 2 en 3 hebben
we ook de keloïd weefselbiopten onderzocht op mogelijke heterogeniteit tussen de pe-rifere, centrale oppervlakkige en centrale diepe gebieden (zie fig. 3 van hoofdstuk 8 en aanvullende tabellen 3 en 6 van hoofdstuk 1). Noch het epidermale noch het dermale compartiment vertoonde duidelijke regionale verschillen in de expressie van de geteste histologische en immunohistochemische markers. Uit de in vitro keloïd modellen die gemaakt waren met cellen uit de verschillende keloïdgebieden in hoofdstuk 6 bleek
echter dat er wel degelijk verschillen bestonden tussen verschillende keloïdgebieden. Het centrale diepe keloïd gebied vertoonde het meest extreme keloïd fenotype met
betrekking tot verhoogde contractie, verhoogde epidermale dikte, verminderde HGF uitscheiding en verminderde dermale collageen IV α2 genexpressie. Daarnaast hadden we ook een huidmodel ontwikkeld uit de cellen van de normale huid rondom het keloïd, direct aangrenzend op de perifere marge van de keloïden. Op basis van het eerdere ex vivo werk (hoofdstuk 2 en 3) leek de normale huid direct naast de keloïden over het
algemeen op normale huid of een volgroeid normaal litteken. Echter in de in vitro ge-reconstrueerde omringende huid, werden veranderingen waargenomen die op zichzelf niet statistisch significant waren, maar over de gehele linie een duidelijk patroon van intermediaire abnormale expressie vormden. Het in vitro model van de omringende huid vertoonde namelijk een mate van contractie, α-SMA-immunoreactiviteit, HGF-secretie en dermale collageen IV α2-genexpressie, die extremer was dan het normale huidmo-del, maar minder aggressief dan het perifere keloïd model.
In een poging om een extremer keloïd fenotype te induceren in het in vitro keloïd model, vermoedden we dat hiervoor naast de keloïd keratinocyten en fibroblasten nog minstens één ander celtype nodig was. In hoofdstuk 7 hebben we daarom het in
vitro keloïd model samen gekweekt met monocyten afkomstig van keloïd-vormende
patiënten, daarbij diende gereconstrueerde normale huid met monocyten van niet-keloïd-vormende patiënten als controlegroep (zie fig. 4 van hoofdstuk 8). Hoewel de monocyten verhoogde CCL2-uitscheiding in het keloïd model induceerden, hadden ze helaas geen ander waarneembaar effect op het keloïd fenotype van het kweek-model. De kweekmodellen hadden daarentegen wel invloed op de differentiatie van meegekweekte monocyten. Alle gekweekte monocyten vertoonden een fenotypische verschuiving van CD11choog/CD14hoog/CD68laag-expressie naar CD11choog/CD14laag/
CD68hoog-expressie, maar alleen monocyten die samen waren gekweekt met normale
huid of keloïd kweekmodellen ontwikkelden zich tot CD68+/CD206+ M2 macrofagen (zie fig. 4 en van hoofdstuk 8). De alternatief geactiveerde M2-macrofagen zijn een macrofaag-subset die betrokken zijn bij het weefselherstel processen van de wondge-nezing en zijn ook geassocieerd met fibrotische processen [24, 25]. In tegenstelling tot wat we hadden verwacht, vonden we geen significante verschillen tussen normale huid en het keloïd model in hun vermogen om het M2-fenotype te induceren. Een mogelijke reden hiervoor is dat de monocyten en de weefselmodellen samen werden gekweekt in de opbouwende fase van de weefselkweek, waardoor we dus eigenlijk hebben geke-ken naar de vroege weefselreconstructie fase in plaats van het keloïd-milieu zoals dat bestaat bij volgroeide keloïden. Als het keloïd fenotype behouden of verergerd wordt door de M2 macrofagen, dan vindt dit waarschijnlijk pas plaats in een later stadium gedurende de 1-2 jaar na de verwonding waarin een litteken nog een maturatieproces doorloopt [15]. Dat is dan wanneer normaliter de macrofagen langzaam weer zouden verdwijnen uit het wondbed in een normaal litteken, maar mogelijk persisteren in kelo-iden. Na de 5 weken durende kweekperiode zijn onze kweekmodellen nog maar net in de remodelleringsfase beland, wanneer er nog geen verschillen in macrofaag densiteit waar zijn te nemen. Daarnaast vermoeden we dat de significante diffusieafstand (10 ml medium) tussen de huidmodellen en de onderliggende monocyten en de relatief lage hoeveelheid monocyten (1x106 monocyten), allen ook een rol kunnen spelen. Het
C
ha
pt
er
9
van de bovengenoemde problemen aan te pakken of co-cultuur met andere immuuncel-len zoals T-lymfocyten zijn beide interessante en relatief simpele vervolgexperimenten om in de toekomst uit te voeren.
Samengevat hebben we in dit tweede deel van het proefschrift de keratinocyten en fi-broblasten van keloïden gebruikt om in het lab opnieuw een keloïd op te kweken als ‘full thickness’ weefselmodel. Dit gaf nieuwe inzichten in de manieren waarop keloïd-cellen afwijken van normale huidcellen. Het gekweekte keloïd model (hoofdstuk 5) vertoonde
keloïd-achtige kenmerken zoals toegenomen contractie van het kweekje en afwijkende expressie van bindweefseleiwitten; en vertoonde bovendien verschillen vergeleken met kweekmodellen van hypertrofische littekens. Door kweekmodellen te maken van cellen uit verschillende gebieden binnen en rondom het keloïd (hoofdstuk 6), kon ook
worden aangetoond dat er verschil is in keloïd-activiteit afhankelijk van de locatie bin-nen het keloïd. Diep centraal gelegen gebieden toonden de grootste keloïd afwijkingen en de normale huid direct rondom keloïd bleek deels gelijkenissen te vertonen met de periferie van een keloïd. In hoofdstuk 7 lieten we zien dat het keloïd kweekmodel
daarnaast eenvoudig was uit te breiden met bepaalde immuuncellen (monocyten) in een poging om een realistischer keloïd model te ontwikkelen, dit is een veelbelovende ontwikkeling die nog nader onderzoek behoeft om de kweekomstandigheden verder te optimaliseren.
3. CONCLUSIES EN TOEKOMSTPERSPECTIEF
In dit proefschrift is aangetoond dat: i. afwijkingen in keloïden niet beperkt zijn tot de fibroblasten en de door hen geproduceerde dermis − zoals vaak wordt gedacht, maar ook duidelijk aanwezig zijn in de epidermis; ii. keloïden zich deels gedragen als jonge littekens die niet verder matureren; iii. keloïden heterogeen van aard zijn, waarbij de keloïd-activiteit afhankelijk is van de locatie binnen het in vitro gereconstrueerde keloïd, iv. er aantoonbare verschillen zijn tussen in vitro gereconstrueerde keloïden en hyper-trofische littekens, v. ‘skin tissue engineering’ een waardevolle complementerende rol heeft naast de bestaande weefselbiopten in keloïd onderzoek (zie figuur 6 van hoofd-stuk 8). De bevindingen van hoofdhoofd-stuk 5 en 6 illustreren hoe keloïd kweekmodellen het mogelijk maken om keloïd eigenschappen te bestuderen die niet in weefselbiopten aan te tonen zijn. Zo genereerde ons in vitro keloïd model de meeste nieuwe keloïdmarkers die verschilden in expressie met het hypertrofische litteken model. Ook bevestigden onze in vitro gereconstrueerde verschillende keloïd-gebieden het bestaan van hete-rogeniteit binnen keloïden. Met andere woorden, een relatief eenvoudig in vitro keloïd model was reeds in staat om bepaalde intrinsieke afwijkingen van keloïd keratinocyten en fibroblasten aan te tonen en identificeerde daarbij bepaalde aspecten van keloïd gedrag die niet alleen konden worden afgeleid van statische ex vivo analyses van het oorspronkelijke littekenweefsel. Naar onze mening illustreert en valideert dit het gebruik van skin tissue engineering als een belangrijk instrument voor onderzoek naar de onderliggende pathogenese van keloïdvorming.
Het keloïd model bestaat momenteel alleen nog uit keloid fibroblasten en keratinocy-ten, maar de huid bevat nog vele andere celsoorten wiens bijdrage aan keloïdvorming relatief eenvoudig kan worden onderzocht door deze systematisch toe te voegen aan dit kweekmodel. Op deze wijze kan het keloïd model de oorzaken van keloïdvorming helpen ontrafelen, tevens zou het in een later stadium ook nog dienst kunnen doen als dierproef alternatief voor het testen van (nieuwe) therapeutica. Onderzoek voeren leidt altijd tot het ontstaan van nieuwe onderzoeksvragen die weer vragen om verder on-derzoek, maar onze hoop is dat de bevindingen in dit proefschrift zullen bijdragen aan het nader bepalen van de meest interessante onderzoeksrichtingen en dat ons in vitro keloïd model tevens als een nieuw hulpmiddel kan dienen voor keloïd-onderzoekers om deze onderzoeksambities te verwezenlijken.
C ha pt er 9
REFERENTIES
1. Aiba S, Tagami H (1997) Inverse correlation between CD34 expression and proline-4 hydroxyase immunoreactivity on spindle cells noted in hypertrophic scars and keloids. J Cutan Pathol 24:65–69 2. Balci D, Inandi T, Dogramaci C, Celik E (2009) DLQI scores in patients with keloids and hy-pertrophic scars: a prospective case control study. J der Dtsch Dermatologischen Gesellschaft 7:688–692
3. Bijlard E, Kouwenberg CAE, Timman R, et al (2017) Burden of keloid disease: a cross-sectional health-related quality of life assessment. Acta Derm Venereol 97:225–229
4. van den Broek LJ, Niessen FB, Scheper RJ, Gibbs S (2012) Development, validation, and testing of a human tissue engineered hypertrophic scar model. ALTEX 29:389–402
5. Burd A, Huang L (2005) Hypertrophic response and keloid diathesis: two very different forms of scar. Plast Reconstr Surg 116:150e-157e
6. Butler PD, Ly DP, Longaker MT, Yang GP (2008) Use of organotypic coculture to study keloid biology. Am J Surg 195:144–148
7. Candi E, Schmidt R, Melino G (2005) The cornified envelope: a model of cell death in the skin. Nat Rev Mol Cell Biol 6:328–340
8. Ehrlich HP, Desmoulière A, Diegelmann RF, et al (1994) Morphological and immunochemical dif-ferences between keloid and hypertrophic scar. Am J Pathol 145:105–113
9. Ghazawi FM, Zargham R, Gilardino MS, et al (2018) Insights into the pathophysiology of hypertro-phic scars and keloids: how do they differ? Adv Ski Wound Care 31:582–595
10. Honardoust D, Ding J, Varkey M, et al (2012) Deep dermal fibroblasts refractory to migration and decorin-induced apoptosis contribute to hypertrophic scarring. J Burn Care Res 33:668–677 11. Kamath NV, Ormsby A, Bergfeld WF, House NS (2002) A light microscopic and
immunohistochemi-cal evaluation of scars. J Cutan Pathol 29:27–32
12. Kumar V, Abbas AK, Fausto N (2004) Tissue renewal and repair: regeneration, healing, and fibro-sis. In: Kumar V, Abbas AK, Fausto N (eds) Robbins and Cotran, Pathologic basis of disease, 7th ed. Elsevier Saunders, pp 87–118
13. Lee JYY, Yang CC, Chao SC, Wong TW (2004) Histopathological differential diagnosis of keloid and hypertrophic scar. Am J Dermatopathol 26:379–384
14. Lee SS, Yosipovitch G, Chan YH, Goh CL (2004) Pruritus, pain, and small nerve fiber function in keloids: a controlled study. J Am Acad Dermatol 51:1002–1006
15. Lorenz HP, Longaker MT (2003) Wounds: biology, pathology, and management. In: Li M, Norton J, Bollinger RR, et al (eds) Essential Practice of Surgery. Springer-Verlag New York, pp 77–88 16. Louw L, van der Westhuizen J, Duyvene de Wit L, Edwards G (1997) Keloids: peripheral and
central differences in cell morphology and fatty acid compositions of lipids. Adv Exp Med Biol 407:515–520
17. Lu F, Gao J, Ogawa R, et al (2007) Biological differences between fibroblasts derived from periph-eral and central areas of keloid tissues. Plast Reconstr Surg 120:625–630
18. Martini FH, Nath JL, Bartholomew EF (2014) The integumentary system. In: Fundamentals of Anatomy & Physiology: Pearson New International Edition, 9th ed. Pearson education limited, pp 180–206
19. Moore KL, Dalley AF (2006) Integumentary system. In: Clinically oriented anatomy, 5th ed. Lip-pincott Williams & Wilkins, pp 12–16
20. Moshref S, Mufti ST (2009) Keloid and hypertrophic scars: comparative histopathological and immunohistochemical study. J King Abdulaziz Univ - Med Sci 17:3–22
21. Mukhopadhyay A, Fan S, Dang VD, et al (2010) The role of hepatocyte growth factor/c-Met system in keloid pathogenesis. J Trauma - Inj Infect Crit Care 69:1457–1466
22. Naim R, Naumann A, Barnes J, et al (2008) Transforming growth factor-beta1-antisense modulates the expression of hepatocyte growth factor/scatter factor in keloid fibroblast cell culture. Aesthetic Plast Surg 32:346–352
23. Nemes Z, Steinert PM (1999) Bricks and mortar of the epidermal barrier. Exp Mol Med 31:5–19 24. Pan B, Liu G, Jiang Z, Zheng D (2015) Regulation of renal fibrosis by macrophage polarization.
Cell Physiol Biochem 35:1062–1069
25. Pechkovsky D V, Prasse A, Kollert F, et al (2010) Alternatively activated alveolar macrophages in pulmonary fibrosis — mediator production and intracellular signal transduction. Clin Immunol 137:89–101
26. Ring HC, Mogensen M, Hussain AA, et al (2015) Imaging of collagen deposition disorders using optical coherence tomography. J Eur Acad Dermatology Venereol 29:890–898
28. Seifert O, Bayat A, Geffers R, et al (2008) Identification of unique gene expression patterns within different lesional sites of keloids. Wound Repair Regen 16:254–265
29. Shih B, Garside E, McGrouther DA, Bayat A (2010) Molecular dissection of abnormal wound heal-ing processes resultheal-ing in keloid disease. Wound Repair Regen 18:139–153
30. Sterry W, Paus R, Burgdorf W (2006) Introduction to skin biology. In: Thieme Clinical Companions - Dermatology, 6th ed. Thieme, pp 1–15
31. Szulgit G, Rudolph R, Wandel A, et al (2002) Alterations in fibroblast α1β1 integrin collagen recep-tor expression in keloids and hypertrophic scars. J Invest Dermatol 118:409–415
32. Wolfram D, Tzankov A, Pülzl P, Piza-Katzer H (2009) Hypertrophic scars and keloids - a review of their pathophysiology, risk factors, and therapeutic management. Dermatologic Surg 35:171–181 33. Yoo MG, Kim IH (2014) Keloids and hypertrophic scars: characteristic vascular structures
visual-ized by using dermoscopy. Ann Dermatol 26:603–609
34. Young B, Heath JW (2001) Skin. In: Wheater’s functional histology: a text and colour atlas, 4th ed. Elsevier Health Sciences, pp 157–171
