The handle
http://hdl.handle.net/1887/136520
holds various files of this Leiden University
dissertation.
Author: Hafkenscheid, L.
Title: Anti Citrullinated Protein Antibodies-IgG variable domain glycosylation in
rheumatoid arthritis
NEDERLANDSE SAMENVATTING
Reumatoïde artritis (RA) is een auto-immuunziekte die voornamelijk invloed heeft op de gewrichten. Wanneer reuma onbehandeld blijft, resulteert dit in beschadiging van het gewricht en kan de ziekte leiden tot vergroeiing van het gewricht met een verminderde bewegelijkheid. De ziekte komt bij ongeveer 1% van de wereldbevolking voor en treft daarom veel mensen. Om deze reden is het nodig om het mechanisme achter de ziekte beter te begrijpen om zo meer mogelijkheden te vinden om de ziekte te behandelen en/ of te voorkomen.
RA wordt gekenmerkt door de aanwezigheid van auto-antilichamen. Met name autoantilichamen gericht tegen gecitrullineerde eiwitten (in het engels: Anti-Citrullinated Protein Antibodies of kortweg ACPA) komen vaak voor bij mensen met RA. Rond 50-70% van de RA-patiënten is positief voor ACPA en de aanwezigheid van ACPA functioneert als een diagnostische en prognostische marker. Kortgeleden, hebben wij ontdekt dat ACPA-IgG een unieke eigenschap heeft. ACPAs hebben een groter molecuulgewicht dan veel andere antistoffen omdat ze extra suikers (“N-glycanen”), in het variabel domein van het molecuul dragen. Dit is opmerkelijk en interessant, ook omdat verschillende functies zijn toegeschreven aan de glycanen in het variabel domein van een antilichaam. Zo is, bijvoorbeeld, beschreven dat deze suikers de halfwaardetijd van het antilichaam in het lichaam kunnen verlengen, en de bindingssterkte van antilichamen aan hun doelwit kunnen beïnvloeden, (hoofdstuk 2). Het is nog niet duidelijk wat de functie is van de extra versuikering van ACPA is en of dit betrokken is bij de pathogenese- en/of ontwikkeling van de ziekte. Het doel van de studies die staan beschreven in dit proefschrift was gericht op een beter begrip van1) de functie van variabel domein glycanen op ACPA-IgG 2) het moment van ziekte-ontwikkeling waarop de glycanen worden geïntroduceerd in ACPA-IgG en 3) de voorspellende waarde van de aanwezigheid van de glycanen op ontwikkeling van ziekte in mensen met een verhoogde kans op RA.
90% van het ACPA-IgG geglycosyleerd is in het variabel domein, terwijl dit veel lager is in “conventioneel” IgG (17%) (hoofdstuk 3).
De bovenstaande studie was gericht op het type- en de hoeveelheid variabel domein glycanen van ACPA-IgG. De volgende stap in mijn studies was om een beter begrip te krijgen over de locatie van de glycosyleringsplaats in het variabel domein van ACPA-IgG. De glycosyleringsplaats kenmerkt zich door de aminozuurvolgorde “N-(X≠P)-S/T”. Het was echter niet bekend hoe de glycosyleringsplaatsen zijn ontstaan en of de introductie van deze plaatsen een willekeurig proces is dat optreedt gedurende de opwekking van een antistofreactie of dat, ten gevolge van selectiedruk, de introductie van glycosyleringsplaatsen wordt gestimuleerd. Om dit te onderzoeken is de DNA-volgorde van de B cel receptoren van ACPA positieve B-cellen bepaald (Hoofdstuk 4) en is er gekeken naar de aanwezigheid van glycosyeringsplaatsen. De resultaten van deze studie onthulde dat B-celreceptoren van ACPA positieve B-cellen in hoge mate gemuteerd zijn en dat de glycosyleringsplaatsen vanuit deze mutaties zijn ontstaan. Een andere interessante bevinding was dat de mate van mutatiegraad van de ACPA B-cel receptor niet correleerde met de hoeveelheid glycosyleringsplaatsen die geïntroduceerd waren. Dit duidt erop dat de introductie van de glycosyleringsplaats niet willekeurig plaatsvindt. Daarnaast, vonden wij ook dat de glycosyleringsplaatsen verrijkt waren in een specifieke regio (CDR1) van het variabel domein. Ook onthulde deze studies dat de ”net niet glycosyleringsplaats”, N-P-S/T, afwezig was in de B-cel receptor van ACPA positieve B-cellen. Dit alles duidt erop dat de introductie van een glycosyleringsplaats in het variabel domain onder een selectiedruk plaatsvindt tijdens het ontstaan van de autoreactieve B-celreactie.
met uiteindelijk RA tot gevolg. De studies beschreven in hoofdstuk 6 hadden tot doel te bepalen wanneer in het ziekteproces de ACPA B-cellen de glycosyleringsplaatsten in het variabel domein introduceren. We veronderstelden hierbij dat dit voor het ontstaan van ziekte plaatsvindt omdat op dit moment de T-cellen die nodig zijn voor de ontsporing van de autoreactieve B-cel reactie actief worden. Om deze reden hebben wij de aanwezigheid van de ACPA-IgG variabel domein glycanen geanalyseerd van ACPA-positieve eerste graad gezonde familieleden (EGGF) van RA-patiënten. We hebben hierbij materiaal gebruikt afgestaan van de oorspronkelijke Noord-Amerikaanse bevolking in Canada. De data onthulde dat ACPA-positieve EGGF die later in het leven reuma ontwikkelen al een hoge ACPA-IgG variabele domain glycosylering hebben jaren voordat de ziekte ontstaat. Dit was in tegen stelling tot mensen die gezond bleven; zij lieten een lage ACPA variabel domain glycosylering zien. Deze resultaten wijzen erop dat de ACPA variabel domein glycosylering mogelijk gebruikt kan worden om te voorspellen of iemand met een verhoogd risico om RA te krijgen, daadwerkelijk de ziekte ontwikkelt. Naast de voorspellende waarde op de ontwikkeling van RA later in de tijd, werd ontdekt dat de variabel domain glycosylering van ACPA al aanwezig kan zijn, jaren voordat de ziekte wordt bemerkt waarbij in een aantal gevallen een toename van de mate van glycosylering in de tijd werd vastgesteld. Deze resultaten suggereerden dat de ontwikkeling van reuma niet per se gepaard gaat met één tweede treffer, maar dat er meerdere “tweede treffers” die plaatsvinden en resulteren in de introductie van glycosyleringsplaatsen in het variabel domain van ACPA-IgG.
studies beschreven in hoofdstuk 7 lieten zien dat de glycanen op ACPA-IgG geen invloed hebben op de bindingsterkte aan antigenen. Echter, er werd wel een effect gevonden op de hoeveelheid antigeen dat gebonden werd door de antilichamen (deze was minder). In sommige gevallen werd dit effect versterkt door de aanwezigheid van siaalzuur. Naast de bindingstudies is er een modeleringsbenadering toegepast om te visualiseren hoe de ruimtelijke oriëntatie van de glycanen zijn ten opzichte van de bindingsplaats. De data liet zien dat de glycanen aan de buitenkant van het variabel domein zijn gelokaliseerd, weg van de bindingsplaats. Wat men in gedachte moet houden is dat glycanen erg dynamisch/flexibel zijn. Hierdoor zouden toch de antigeenbindingsplaats kunnen bereiken en mogelijk de bindingsplaats kunnen blokkeren zodat de gecitrullineerde antigenen niet kunnen binden. De bindingstudies beschreven in hoofdstuk 7 duiden erop dat dit inderdaad het geval is.
Naast het reduceren van de antigeen-binding zijn er mogelijk andere redenen waarom een glycosyleringsplaats wordt geïntroduceerd. Het is opmerkelijk dat de glycanen in ACPA-IgG een hoog gehalte aan siaalzuur hebben. Siaalzuur bevattende suikerketens kunnen een ligand zijn voor siaalzuur-bindende receptoren, de zogenoemde siglecs, op B-cellen. Het zou kunnen dat de glycanen op ACPA-IgG de B-celreceptor signalering kan moduleren door binding aan CD22. Over activatie van B-cellen kan resulteren in “negatieve selectie” doordat deze B-cellen doodgaan. Het heel denkbaar dat ACPA B-cellen constant geactiveerd worden door de aanwezigheid van zelf-antigenen en zouden daarom een remmend signaal van CD22 nodig kunnen hebben om over-stimulatie te voorkomen en zo te ontsnappen aan negatieve selectie. Daarnaast, worden er meerdere siglecs tot expressie gebracht op andere afweercellen zoals dendritische cellen. Deze cellen hebben een sleutelrol in de selectie en uitrijping van B-cellen en B-celreacties. In het geval van ACPA B-cellen zou gepostuleerd kunnen worden dat de siaalzuur-bevattende glycanen in het variabele domein, een selectievoordeel geven aan de B-cel
dat er meerder “treffers” optreden of dat de introductie van glycosyleringsplaatsen zelfs een gevolg is van een constante aanwezigheid is van “treffers” die er uiteindelijk toe leiden dat de ACPA B-celreactie ontspoort. Alhoewel het niet bekend is waarom er glycanen worden geïntroduceerd in het variabel domein van ACPA, heb ik in hoofdstuk
8 een aantal hypotheses voorgesteld hoe de glycaan een selectievoordeel kan geven
