University of Groningen
Ultrasound-triggered release and activation of drugs and biomacromolecules from nucleic acid scaffolds
Zhao, Pengkun
DOI:
10.33612/diss.168542653
IMPORTANT NOTE: You are advised to consult the publisher's version (publisher's PDF) if you wish to cite from it. Please check the document version below.
Document Version
Publisher's PDF, also known as Version of record
Publication date: 2021
Link to publication in University of Groningen/UMCG research database
Citation for published version (APA):
Zhao, P. (2021). Ultrasound-triggered release and activation of drugs and biomacromolecules from nucleic acid scaffolds. University of Groningen. https://doi.org/10.33612/diss.168542653
Copyright
Other than for strictly personal use, it is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of the author(s) and/or copyright holder(s), unless the work is under an open content license (like Creative Commons).
Take-down policy
If you believe that this document breaches copyright please contact us providing details, and we will remove access to the work immediately and investigate your claim.
Downloaded from the University of Groningen/UMCG research database (Pure): http://www.rug.nl/research/portal. For technical reasons the number of authors shown on this cover page is limited to 10 maximum.
Samenvatting
——————————————————————————————————————
116
In het opkomende gebied van polymeermechanochemie kunnen de gunstige eigenschappen van ultrasoon geluid (US) worden benut om eigenschappen op moleculair niveau te regelen door bindingen plaatsspecifiek te herschikken of te splitsen. Voor een succesvolle en selectieve bindingsactivering door mechanische spanning is een macromoleculair raamwerk vereist dat de kracht omzet in de mechanochemisch labiele binding van het latente moleculaire motief (de mechanofoor). Voor biomedische toepassingen is het gebruik van niet-invasieve US bijzonder gunstig, omdat het ruimtelijke en temporele controle combineert met eenvoudige regeling van de weefselpenetratiediepte middels variatie van de frequentie en energie door de blootstellingstijd. Alhoewel onderzoek in de mechanochemie tot dusver vooral gericht was op het begrijpen van de krachtgeïnduceerde chemische transformaties en hun impact op materiaaleigenschappen, bleef het gebruik van plaatsselectieve binding-splitsing voor medicijnactivatie in de geneeskunde onontgonnen. In deze context hebben we twee haalbare manieren bedacht om medicijnen en eiwitten uit poly-nucleïnezuren of DNA-geconjugeerde nanodeeltjes te activeren door de behandeling van ultrasoon geluid, met als doel toepassingen te vinden in het biomedische veld. Met name presenteerden we het eerste moleculaire ontwerp om eiwitten en geneesmiddelen te activeren vanuit hun gedeactiveerde aptameer-gebonden vorm door mechanische kracht in de vorm van ultrasoon geluid te gebruiken.
In Hoofdstuk 1 hebben we de vooruitgang benadrukt van op nucleïnezuur gebaseerde medicijnafgiftesystemen die worden geactiveerd door externe stimuli, waaronder elektrische en magnetisch velden, licht en ultrasoon geluid. De classificatie van elke stimulus op basis van verschillende mechanismen werd ook beoordeeld door representatieve referenties samen te vatten.
In Hoofdstuk 2 hebben we hoogmoleculaire poly-aptameren gesynthetiseerd, bestaande uit herhalende eenheden van nucleïnezuur-aptameren gebonden aan de antibiotica neomycine B (NeoB) of paromomycine (Paromo). Toepassing van US vernietigde de niet-covalente interacties (zoals waterstofbruggen of elektrostatische interacties), leidde tot verdere desaggregatie en covalente bindingsafsplitsing van de fosfodiëster RNA-ruggengraat en activeerde vervolgens de geneesmiddelen. De minimale remmende concentratie (MIC)-tests van NeoB@poly-aptameren daalden tot 8 μg/ml na 10 minuten en bereikten de MIC van zuiver NeoB na 30 minuten
117
ultrasonicatie. Belangrijk is dat de kleinere NeoB@aptameren dit gedrag niet vertoonden, wat aangeeft dat deze resultaten afkomstig zijn van de mechanochemische splitsing van niet-covalente gastheer-gast-interacties en covalente afbraak van de nucleïnezuur ruggengraat. Levensvatbaarheidstesten van Staphylococcus aureus toonde verder aan dat hoewel zuiver NeoB bijna alle bacteriën doodde, NeoB@poly-aptameren alleen activiteit vertoonden na ultrasonicatie, maar niet eerder. Dit werk breidt het gebruik van mechanochemie uit naar de farmaceutische sector.
In dezelfde context hebben we in Hoofdstuk 3 het eiwit trombine als lading voor het nucleïnezuur raamwerk verder onderzocht om ultrasoon-gecontroleerde activering te bereiken. De eiwitten werden ingekapseld en tijdelijk gedeactiveerd door poly-aptameren, welke werden vervaardigd door middel van rollende cirkel amplificatie (RCA). Opnieuw werd ultrasoon geluid gebruikt als een niet-invasieve en diep doordringende trigger om enzymactiviteit te activeren. Na 30-60 seconden US-toepassing werd een bijna volledig herstel van de oorspronkelijke katalytische activiteit van trombine (80-90%) voor fibrinevorming waargenomen. Optische microscopie-experimenten toonden verder aan dat trombine@poly-aptameren die 30-60 seconden met US werden behandeld, resulteerden in dichte fibrinevezelnetwerken vergelijkbaar met zuiver trombine. Langere blootstelling aan US verminderde de activiteit, aangezien trombine zelf een biomacromolecuul is dat onder schuifkracht in oplossing denatureert. In dit werk werd gedemonstreerd dat eiwitten kunnen worden geactiveerd door US op moleculair nauwkeurige wijze toe te passen.
Naast de biomacromolecuul-raanwerken die in Hoofdstuk 2 en Hoofdstuk 3 werden besproken, werd de focus in Hoofdstuk 4 verlegd naar een op nanodeeltjes gebaseerd platform voor eiwitactivering. Hier hebben we een aptameer-nanodeeltjes-systeem gefabriceerd om trombine te deactiveren en vervolgens vrij te zetten. Daarom hebben we twee soorten gouden nanodeeltjes (AuNP's) gemaakt die op de oppervlakken zijn gefunctionaliseerd met een gethioleerde gespleten aptameer. In aanwezigheid van trombine assembleerden de twee gespleten aptameerdelen tot de intacte aptameer-tertiaire structuur en induceerden ze tegelijkertijd de aggregatie van de twee AuNP-typen. Bij toepassing van ultrasoon geluid werden deze aggregaten gedemonteerd en werd trombine vrijgezet en daardoor geactiveerd. Na 15 seconden US-bestraling werd een activiteit vergelijkbaar met 50% van zuiver trombine behaald, en meer dan 70%
Samenvatting
——————————————————————————————————————
118
activiteit werd verkregen na 30 seconden. Dit proces zou met name gedurende verschillende cycli kunnen worden gemanipuleerd zonder duidelijke vermoeidheid, waardoor deze hybride structuur omkeerbaar wordt. Het monster werd getransformeerd in zijn gedemonteerde staat door simpelweg 15 seconden lange US-bestraling en teruggebracht naar zijn geassembleerde staat door 30 minuten bij kamertemperatuur te equilibreren, zoals aangegeven door de oppervlakte plasmon resonantie (SPR)-band in UV/Vis spectroscopiemetingen. Deze benadering omzeilt de beperkingen van
architecturen met één enkele mechanofoor welke lijden aan lage
belastingsverhoudingen om voldoende hoeveelheden functionele soorten vrij te geven of de moeilijkheid om de kettinggecentreerde positie van de mechanofoor nauwkeurig te regelen.
In Hoofdstuk 5 hebben we een snelle en eenvoudige methode ontwikkeld om onderscheid te maken tussen associatie en dissociatie van eiwitten en nucleïnezuren, geïnspireerd door werk aan AuNP's met positieve ladingen, die met succes zijn getest bij het detecteren van antibioticaresiduen in rauwe melk. De elektrostatische interactie tussen positief geladen AuNP's en polyanionisch DNA (lysozym bindende aptameer, (LBA)) leidt tot de aggregatie van kationische AuNP's vergezeld van een snelle rood-naar-blauwe kleurverandering. Negatieve ladingen van LBA zouden worden verdund met de binding van lysozym (Lys) in een verhouding van 1:1, resulterend in de resterende rode kleur van individuele AuNP's. Als het Lys-LBA-complex wordt uitgedaagd door gedurende 1 minuut ultrasoon geluid toe te passen, vindt dissociatie plaats en kunnen AuNP's opnieuw elektrostatisch binden met LBA. In dit geval zou de aggregatie van AuNP's plaatsvinden en zou de rood-naar-blauwe kleurverandering opnieuw worden waargenomen. Het belangrijkste kenmerk van deze test is directe visualisatie van de interacties tussen eiwitten met nucleïnezuren met het blote oog, wat het handiger maakt dan andere methoden die afhankelijk zijn van geavanceerde instrumenten en arbeidsintensieve karakteriseringsprocedures.
