University of Groningen
Air pollution exposure of lung models
Cattani Pinto Cavalieri, Isabella
DOI:
10.33612/diss.172080794
IMPORTANT NOTE: You are advised to consult the publisher's version (publisher's PDF) if you wish to cite from it. Please check the document version below.
Document Version
Publisher's PDF, also known as Version of record
Publication date: 2021
Link to publication in University of Groningen/UMCG research database
Citation for published version (APA):
Cattani Pinto Cavalieri, I. (2021). Air pollution exposure of lung models: focus on inflammation, oxidative stress and cyclic AMP signaling. University of Groningen. https://doi.org/10.33612/diss.172080794
Copyright
Other than for strictly personal use, it is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of the author(s) and/or copyright holder(s), unless the work is under an open content license (like Creative Commons).
Take-down policy
If you believe that this document breaches copyright please contact us providing details, and we will remove access to the work immediately and investigate your claim.
Downloaded from the University of Groningen/UMCG research database (Pure): http://www.rug.nl/research/portal. For technical reasons the number of authors shown on this cover page is limited to 10 maximum.
229 Summary
Air pollution is a global public health concern and represents one of the main environmental risk factors for mortality associated with unwanted respiratory events. A growing body of evidence indicates that air pollution promotes the induction of inflammation and oxidative stress in the lungs. Conversely, intracellular signaling associated with (an increase in) the second messenger cAMP is known to reduce and/or protect against airway inflammation, oxidative stress and mitochondrial dysfunction. Interestingly, a relationship between mitochondrial dysfunction (as an underlying pathological mechanism) and several chronic diseases, including COPD and asthma, has been proposed.
Air pollution contains considerable amounts of particulate matter (PM), including diesel exhaust particles (DEP) that contain highly toxic compounds. We evaluated the effects of DEP and biodiesel PM on lung (patho)physiology in vitro (e.g., by using human bronchial epithelial cells) and in vivo in mouse models of acute and chronic air pollution exposure. The studies described in this thesis show that exposure to these air pollutants promotes airway inflammation, oxidative stress and epithelial-to-mesenchymal transition. In addition, exposure to DEP induced mitochondrial dysfunction and changes in the cellular ability to produce cAMP. We speculate that mitochondrial cAMP nanodomains are critical in disrupting cAMP homeostasis. From a more clinically relevant perspective, our studies identify and highlight the therapeutic potential of dimethyl fumarate (DMF) to reduce DEP-induced parameters of airway inflammation, oxidative/nitrosative stress, and overall lung injury. The exact mechanisms by which DMF affects the inflammatory response and antioxidant system will be the topic of future research by our group.
231 Resumo
A poluição do ar é uma preocupação de saúde global e um dos principais fatores de risco de morte associada a complicações respiratórias indesejadas. O sistema respiratório é afetado principalmente porque está diretamente e regularmente exposto à poluição do ar, que tem sido associada com o DPOC e câncer de pulmão. Em muitos países, a poluição do ar excede os padrões aceitáveis da OMS e está relacionada ao desenvolvimento econômico, crescimento industrial, urbanização, consumo de energia e transporte. A poluição do ar consiste principalmente de partículas e gases, que contribuem para os efeitos tóxicos. As partículas da exaustão do diesel (DEP) representam o principal componente da poluição do ar e contêm componentes altamente tóxicos, como metais e hidrocarbonetos aromáticos policíclicos. Em um esforço para conter o impacto da poluição do ar, o uso de biodiesel está atualmente sob escrutínio como uma alternativa ao diesel.
Nesta tese, investigamos os efeitos da exposição a componentes conhecidos da poluição do ar, incluindo DEP e material particulado do diesel-biodiesel (DBPM), na (pato)fisiologia do pulmão usando ambos in vitro como modelos in vivo. Para esses estudos, obtivemos o DEP do "Instituto Nacional de Padrões e Tecnologia (NIST)"; que é amplamente usado para estudar os efeitos da DEP em vários parâmetros de várias doenças pulmonares.
Há evidências substanciais que indicam que a poluição do ar pode induzir inflamação e estresse oxidativo nos pulmões. Por outro lado, o "segundo mensageiro" cAMP é conhecido por reduzir a inflamação das vias aéreas, o estresse oxidativo e a disfunção mitocondrial. O objetivo principal dos estudos descritos nesta tese foi elucidar os mecanismos subjacentes à inflamação induzida pela poluição do ar e ao estresse oxidativo e seu impacto na sinalização do cAMP e na função mitocondrial.
Efeitos dos componentes da poluição do ar no estresse oxidativo respiratório O estresse oxidativo desempenha um papel importante nos efeitos negativos induzidos pela poluição do ar no sistema respiratório. No Capítulo 5, mostramos que a exposição aguda a DBPM via instilação intranasal leva a um aumento nas espécies reativas de oxigênio (ROS) no lavado broncoalveolar (BAL) de camundongos. A superprodução de ROS pode levar a danos oxidativos; de acordo com isso, mostramos que os níveis do marcador de estresse oxidativo malondialdeído estavam aumentados nos pulmões de camundongos expostos ao DBPM. De acordo com nossas descobertas, em células
232
epiteliais de câncer de pulmão humano e macrófagos de camundongo, as partículas de exaustão de petróleo mostraram induzir a peroxidação lipídica, que é caracterizada por um aumento no malondialdeído. O Capítulo 7 descreve os efeitos terapêuticos do dimetil fumarato (DMF) em camundongos. O tratamento com DMF reduziu o aumento de ROS intracelular, óxido nítrico (NO) e peroxinitrito (OONO) no BAL de animais expostos à DEP por 60 dias. A partir disso, concluímos que os componentes da poluição do ar podem induzir estresse oxidativo, e que este pode ser inibido farmacologicamente com DMF.
O sistema antioxidante celular é capaz de prevenir (parcialmente) ou reduzir os efeitos do estresse oxidativo. A via de sinalização do fator de transcrição Nrf2 (fator nuclear derivado do eritroide 2) é ativada por sinais de estresse e é extremamente importante na defesa contra o estresse oxidativo. Nomeadamente, a ativação de Nrf2 conduz à expressão e secreção de várias enzimas citoprotetoras. Os efeitos da exposição aguda ao DBPM na sinalização de Nrf2 e NF-ΚB nos pulmões foram investigados em um modelo de camundongo (Capítulo 5). Nossos resultados mostram que a menor concentração de DBPM aumentou a expressão proteica de Nrf2 e heme oxigenase-1 (HO-1). No entanto, uma alta concentração de DBPM não teve efeito sobre o Nrf2, mas foi capaz de induzir um aumento significativo de ROS, indicando que com uma alta concentração de DBPM, uma resposta pulmonar mais intensa provavelmente ocorrerá envolvendo outras vias antioxidantes.
A DEP induziu a expressão gênica de HO-1, tioredoxina e superóxido dismutase 2 (SOD-2) em células epiteliais brônquicas humanas (Capítulo 6). A exposição crônica ao DEP (60 dias) não teve efeito na expressão de Nrf2 (Capítulo 7). No entanto, a expressão proteica da glutationa peroxidase-1/2 (Gpx-1/2) e da catalase foi aumentada na defesa contra o estresse oxidativo induzido pela DEP; isso foi inibido pelo tratamento com DMF (Capítulo 7). Isso foi notável, pois se esperava que o DMF aumentasse a expressão antioxidante (para reduzir os efeitos do DEP). Em contraste, pode-se especular que, como o DMF foi tratado e, portanto, o estresse foi neutralizado ao longo do tempo, a resposta antioxidante não é particularmente pronunciada no momento da medição.
Com base em nossos achados e na literatura atual, a resposta celular à exposição aos componentes da poluição do ar depende fortemente do modelo experimental, do tipo de célula estudada, do tempo de exposição ao estímulo e do tempo de coleta de dados. Mostramos diferentes efeitos na expressão de Nrf2 em nossos estudos DEP e DBPM em modelos agudos e crônicos, e mostramos que os componentes da poluição do ar
233
têm a capacidade de direcionar várias vias de sinalização celular nos pulmões em resposta ao estresse oxidativo. Nosso achado de que a exposição aguda e crônica a DBPM e DEP, respectivamente, afeta diferencialmente Nrf2, parece confirmar que a expressão de Nrf2 depende do tempo de exposição e/ou do estímulo. No entanto, esses resultados podem identificar uma nova dinâmica na expressão e função do Nrf2 no estresse agudo e crônico.
Os efeitos dos componentes da poluição do ar na inflamação das vias aéreas A inflamação das vias aéreas está profundamente envolvida nos efeitos negativos da poluição do ar no sistema respiratório, e a poluição do ar tem sido associada a exacerbações na asma e na DPOC. Células inflamatórias, como neutrófilos e macrófagos, são fundamentais no processo inflamatório, principalmente por sua capacidade de produzir citocinas. Os dados nos Capítulos 5 e 7 mostram que a exposição aguda de camundongos a DBPM e DEP aumenta o número de macrófagos no BAL. Além disso, a exposição crônica à DEP resultou em um aumento no número total de células inflamatórias no BAL, o que poderia ser efetivamente inibido pelo tratamento com DMF (Capítulo 7). Nossos resultados mostram que a exposição aguda e crônica aos componentes da poluição do ar é suficiente para induzir um aumento nas células inflamatórias no trato respiratório de camundongos.
O fator de transcrição NF-ΚB está significativamente envolvido na regulação da inflamação (das vias aéreas) ao desencadear a transcrição e a secreção de várias citocinas, quimiocinas e fatores de crescimento. Nos Capítulos 5 e 7, mostramos um aumento na expressão de p-NF-ΚB e NF-ΚB p65 nos pulmões de camundongos estimulados com DBPM ou DEP. O potencial terapêutico do DMF para inibir a inflamação das vias aéreas induzida por DEP foi confirmado pela observação de que a expressão da proteína de NF-ΚB p65 foi reduzida nos pulmões de camundongos expostos a DEP e tratados com DMF (Capítulo 7).
Também estudamos os efeitos de DBPM e DEP na indução de citocinas em células epiteliais de camundongo e humana (BEAS-2B), respectivamente. DBPM aumentou fator de necrose tumoral-α (TNF-α) em BAL (Capítulo 5) e DEP levou a um aumento na expressão de mRNA e proteína de interleucina (IL) -8 e IL-6 (Capítulo 6). Um estudo anterior usando outro modelo experimental já havia mostrado que a DEP pulverizada aumentou a expressão do gene do ligante 8 da quimiocina C-X-C motivo (CXCL8), TNF-α e NF-ΚB em células epiteliais brônquicas humanas primárias. Cumulativamente, esses dados indicam que a exposição a componentes poluentes transportados pelo ar
234
pode ativar a via de sinalização NF-ΚB, levando a um aumento de citocinas e quimiocinas (produzidas por células residentes, como células epiteliais, entre outras) e, finalmente, um agravamento da inflamação das vias aéreas.
Embora o DBPM e o DEP sejam ambos capazes de induzir adequadamente a inflamação das vias aéreas e uma resposta (celular) associada ao estresse oxidativo, certas características são influenciadas diferencialmente por esses componentes poluentes das vias aéreas. Para responder à pergunta se o DBPM é menos prejudicial à saúde pulmonar do que o DEP, com base em estudos que analisam a inflamação e o estresse oxidativo, é necessário comparar os efeitos do DBPM e da DEP diretamente e no mesmo modelo. Atualmente, estudos estão sendo elaborados para atingir esse objetivo.
A influência da exposição DEP na transição epitelial-mesenquimal
A transição epitelial-mesenquimal (EMT) é caracterizada por uma perda na integridade epitelial e na função de barreira associada à transformação de um fenótipo epitelial para um mais mesenquimal. No Capítulo 6, os efeitos da DEP na expressão de marcadores EMT foram investigados. A exposição das células BEAS-2B ao DEP resultou na indução dos marcadores mesenquimais TGF- β 1, β -catenina e colágeno-1, e uma redução nos marcadores epiteliais E-caderina e ZO-1. Apenas alguns outros estudos investigaram a influência da poluição do ar na EMT. Por exemplo, um trabalho recente mostrou que a exposição de BEAS-2B a uma baixa concentração de DEP (50-150 vezes menor do que a usada em nossos estudos) por 6 meses não alterou a expressão da proteína de E-caderina, vimentina e N-E-caderina, indicando que não houve efeito sobre a EMT. Para nossa surpresa, nenhuma indicação de inflamação (aumento), estresse oxidativo ou genotoxicidade foi observada naquele estudo. Comparando isso com nossos achados, concluímos que a fonte e o tipo de componente poluente do ar podem induzir diferentes graus de EMT e danos pulmonares. Além disso, também deve ser observado que o tempo de exposição e a concentração de DEP parecem afetar significativamente a resposta celular.
Os efeitos da exposição DEP na sinalização de cAMP
O monofosfato de adenosina cíclico (cAMP) é um mensageiro extremamente importante na transdução de sinais extracelulares para o interior da célula, o que se reflete pelo envolvimento direto na regulação de um grande número de processos fisiológicos (celulares). Por exemplo, a sinalização de cAMP está envolvida na manutenção da função de barreira celular, que desempenha um papel positivo na manutenção da função pulmonar. No entanto, a influência direta de DEP na sinalização de cAMP não
235
foi descrita até agora. A indução de cAMP é iniciada principalmente por receptores acoplados à proteína Gs, como o β2-adrenoreceptor (β2-AR) e vários receptores E prostanóides (EP). O Capítulo 2 descreveu como os suportes de cAMP podem contribuir para os sintomas da DPOC e elaborou seu possível papel na saúde e na doença. Os estudos no Capítulo 6 mostraram que a exposição à DEP alterou a expressão do Epac1, onde nenhum efeito significativo foi observado nos substratos Epac2 e fosfo-PKA. Pesquisas de nosso grupo mostraram anteriormente que Epac e PKA desempenham um papel parcial na regulação da inflamação, estresse oxidativo e EMT de maneira coordenada. Entre outras coisas, foi demonstrado que a β -catenina está ligada à EMT pela Epac. Além disso, nosso estudo usando um modelo no qual camundongos foram expostos de forma aguda à fumaça do cigarro mostrou que o Epac1 inibiu o processo de remodelação ligado à EMT, enquanto o Epac2 promoveu inflamação. No Capítulo 6, descrevemos que a DEP induziu a expressão gênica de β 2-AR e EP4, mas não de EP2 e EP3. DEP também aumentou a expressão de mRNA de adenilciclase (AC) 7, -3 e -6, mas não teve efeito em AC1, -4 e -5. De acordo com nossas descobertas, mudanças no perfil de expressão de receptores geradores de cAMP foram demonstradas nos pulmões de, por exemplo, IPF e pacientes com DPOC. Também foi encontrado em células epiteliais traqueais primárias de camundongo e células do músculo liso das vias aéreas humanas que a exposição a hidrocarbonetos aromáticos policíclicos liberados durante a combustão de diesel diminuiu a produção de cAMP em resposta à estimulação β2-AR. No Capítulo 6, avaliamos as mudanças em tempo real no cAMP em células BEAS-2B usando um ensaio GloSensor cAMP, e mostramos que a DEP induziu a produção de cAMP por estimulação com forscolina (ativador direto de AC), fenoterol (agonista β-AR) ou um Análogo de PGE2 (agonista de EP4). Estas observações indicam que a DEP modifica a capacidade dos receptores geradores de cAMP e ACs para produzir cAMP intracelular, o que pode afetar adversamente a função pulmonar.
Efeitos da DEP na função mitocondrial
Na mitocôndria, a indução de estresse oxidativo e inflamação pode ocorrer por meio de um aumento nas concentrações de ROS, levando à disfunção mitocondrial. No Capítulo 6, mostramos que a exposição à DEP resultou no aumento da expressão de mRNA da enzima da matriz mitocondrial SOD-2, sugerindo uma mudança na função mitocondrial. Além disso, os efeitos da DEP na morfologia mitocondrial foram investigados. Para tanto, as mitocôndrias foram divididas em 3 categorias: mitocôndrias alongadas (I),
236
fragmentadas (II) e morfologicamente indefinidas (III). A DEP resultou na fragmentação das mitocôndrias (uma mudança relativa da categoria I para a II); esta observação também demonstra a ocorrência de disfunção mitocondrial devido à exposição DEP. Sob condições específicas, como estresse, as células requerem energia adicional; isso é obtido por meio da fosforilação oxidativa e o ATP "extra" que pode ser gerado é chamado de capacidade de reserva mitocondrial. A exposição ao DEP reduziu significativamente a respiração mitocondrial basal e ligada ao ATP e a capacidade de reserva mitocondrial. A glicólise também é um contribuinte importante para a produção de energia celular; a exposição das células BEAS-2B ao DEP reduziu a capacidade glicolítica e a reserva. Assim, nossos resultados indicam que o DEP reduz drasticamente a capacidade celular de gerar energia adicional.
Estudos anteriores demonstraram que a exposição ao DEP pode reduzir o potencial da membrana mitocondrial em macrófagos, destacando que a exposição ao DEP pode induzir disfunção mitocondrial. Conforme indicado, nossos resultados no Capítulo 6 mostram claramente que a DEP leva de uma maneira dependente da concentração a modificações na morfologia mitocondrial e bioenergética. Esses distúrbios na função mitocondrial celular podem contribuir potencialmente para a disfunção pulmonar. Nossos estudos são os primeiros a examinar os efeitos da exposição à DEP em aspectos específicos da função mitocondrial, como respiração mitocondrial, capacidade de reserva e reserva glicolítica, em células epiteliais brônquicas humanas.
Perspectivas para o futuro
Os estudos descritos nesta tese mostram que a exposição aos componentes da poluição das vias aéreas DBPM e DEP promove inflamação, estresse oxidativo e EMT nas vias aéreas e nos pulmões. Além disso, a DEP induziu disfunção mitocondrial e uma redução na capacidade celular de gerar cAMP. Até agora, para o melhor de nosso conhecimento, nenhum estudo foi publicado examinando o envolvimento de nanodomínios de cAMP mitocondrial nesses efeitos. Propomos que tais estudos façam parte de pesquisas futuras destinadas a melhor compreender os mecanismos moleculares subjacentes aos efeitos negativos de vários componentes da poluição do ar na saúde pulmonar.
Juntos, o estresse oxidativo e a inflamação promovem danos pulmonares e representam os principais mecanismos responsáveis pela toxicidade da poluição do ar. Há claramente uma necessidade urgente de identificar estratégias de terapia direcionadas especificamente a esses processos. Apenas alguns estudos estudaram os efeitos de
237
drogas ou substâncias potenciais nos danos causados pela poluição do ar nos pulmões. Nosso trabalho identifica e destaca o potencial terapêutico promissor do DMF na redução dos parâmetros induzidos pela DEP da inflamação das vias aéreas, estresse oxidativo e nitrosativo e danos pulmonares em geral. Estudos futuros que investiguem a influência diferencial do DMF na resposta inflamatória e no sistema antioxidante podem se basear nessas observações importantes.
Principais conclusões:
• A exposição aguda ao DBPM resulta em uma resposta inflamatória caracterizada por um aumento no número de macrófagos e uma expressão aumentada de TNF-α nos pulmões de camundongos. Além disso, promove dano oxidativo ao induzir a expressão de ROS e peroxidação lipídica (Capítulo 5).
• A resposta inflamatória e o dano oxidativo induzidos por DBPM podem estar relacionados ao aumento da expressão proteica de p-NF-ΚB e Nrf2 no parênquima pulmonar (Capítulo 5).
• A exposição das células BEAS-2B ao DEP resulta em estresse oxidativo e na expressão de citocinas inflamatórias e marcadores EMT (Capítulo 6). A exposição à DEP leva a uma diminuição da capacidade dos receptores acoplados à proteína Gs e subtipos da superfamília AC de gerar cAMP celular. Esses efeitos ocorrem lado a lado com a indução de várias características da disfunção mitocondrial (Capítulo 6). A capacidade reduzida de produzir cAMP, bem como as modificações na morfologia mitocondrial e na bioenergética, muito provavelmente contribuem para os efeitos negativos da poluição do ar na saúde pulmonar.
• O tratamento de camundongos com DMF inibe eficientemente o estresse oxidativo (redução do ROS intracelular) e nitrosativo (redução do ONOO e NO) induzido por DEP (Capítulo 7). A inflamação das vias aéreas devido à exposição crônica ao DEP parece estar associada à um aumento no NF-ΚB p65; isso também, como o aumento de Keap-1, é inibido pelo tratamento com DMF (Capítulo 7). Em conjunto, nossos achados indicam que o DMF pode ser considerado um agente terapêutico no tratamento de doenças pulmonares inflamatórias associadas à poluição do ar.
239 Nederlandse Samenvatting
Luchtvervuiling is globaal een zorgwekkend gezondheidsprobleem en is één van de voornaamste risicofactoren voor sterfte geassocieerd met ongewenste respiratoire complicaties. Het ademhalingssysteem (waaronder de luchtwegen en de longen) wordt primair beïnvloed omdat het direct en met hoge regelmaat wordt blootgesteld aan luchtvervuiling, wat in verband gebracht is met (de ontwikkeling van) COPD en longkanker. In veel landen overschrijdt luchtvervuiling de acceptabele WHO-normen en is gerelateerd aan economische ontwikkeling, industriële groei, verstedelijking, energieconsumptie en vervoer. Luchtvervuiling bestaat voor een belangrijk deel uit fijnstof en gassen, wat bijdraagt aan de toxische effecten. Diesel uitlaatdeeltjes (‘diesel exhaust particles’, DEP) vertegenwoordigen de voornaamste component in luchtvervuiling en bevatten sterk giftige bestanddelen zoals metalen en polycyclische aromatische koolwaterstoffen. In een poging om de invloed van luchtvervuiling tegen te gaan, is het gebruik van biodiesel momenteel onder de loep als een alternatief voor diesel.
In dit proefschrift hebben wij de effecten van blootstelling aan welbekende luchtvervuilingscomponenten, waaronder DEP en diesel-biodiesel fijnstof (‘diesel-biodiesel particulate matter’, DBPM), op de (patho)fysiologie van de long onderzocht door gebruik te maken van zowel in vitro als in vivo modellen. Voor deze studies hebben we DEP verkregen van ‘The National Institute of Standards and Technology (NIST)’; dit wordt veelvuldig gebruikt om de effecten van DEP op verscheidene parameters van diverse longziekten te bestuderen.
Er is substantieel bewijs dat aangeeft dat luchtvervuiling inflammatie en oxidatieve stress kan induceren in de longen. Aan de andere kant, van de ‘second messenger’ cAMP is bekend dat het luchtwegontsteking, oxidatieve stress en mitochondriale dysfunctie kan reduceren. Het voornaamste doel van de studies beschreven in dit proefschrift was om de mechanismen die ten grondslag liggen aan luchtvervuiling-geïnduceerde inflammatie en oxidatieve stress en hun impact op cAMP signalering en mitochondriale functie op te helderen.
Effecten van luchtvervuilingscomponenten op oxidatieve stress in de luchtwegen Oxidatieve stress speelt een belangrijke rol in de door luchtvervuiling-geïnduceerde negatieve effecten op het respiratoire systeem. In Hoofdstuk 5 laten we zien dat acute blootstelling aan DBPM via intranasale instillatie leidt tot een verhoging in reactieve
240
zuurstofcomponenten (‘reactive oxygen species’, ROS) in de bronchoalveolaire lavage vloeistof (BAL) van muizen. Het is welbekend dat ROS overproductie tot oxidatieve schade kan leiden; conform deze notie toonden we aan dat de levels van de oxidatieve stress marker malondialdehyde waren verhoogd in de longen van DBPM muizen. In overeenstemming met onze bevindingen is het in humane longkanker epitheelcellen en muizenmacrofagen aangetoond dat petroleum uitlaatdeeltjes lipide peroxidatie induceren, wat gekenmerkt wordt door een toename in malondialdehyde. Hoofdstuk 7 beschrijft de therapeutische effecten van dimethylfumaraat (DMF) in muizen. Behandeling met DMF verminderde de verhoging in intracellulair ROS, stikstofmonoxide (NO) en peroxynitriet (OONO) in de BAL van dieren die gedurende 60 dagen aan DEP waren blootgesteld. Hieruit concludeerden we dat luchtvervuilingscomponenten oxidatieve stress kunnen induceren, en dat dit farmacologisch te remmen is met DMF.
Het cellulaire antioxidant systeem is in staat om de effecten van oxidatieve stress (deels) te voorkomen of reduceren. De transcriptiefactor Nrf2 (‘nuclear factor erythroid-derived-like 2’) signaalroute wordt geactiveerd door stress signalen en is uitermate belangrijk in de verdediging tegen oxidatieve stress. Activatie van Nrf2 leidt namelijk tot de expressie en secretie van verscheidene cytoprotectieve enzymen. De effecten van acute blootstelling aan DBPM op Nrf2 en NF-B signalering in de longen werden onderzocht in een muizenmodel (Hoofdstuk 5). Onze resultaten laten zien dat een lage concentratie DBPM de eiwitexpressie van Nrf2 en heem oxygenase-1 (HO-1) verhoogde. Echter, een hoge concentratie DBPM had geen effect op Nrf2 maar was wel in staat om een aanzienlijke verhoging in ROS te induceren, wat aangeeft dat met een hoge concentratie DBPM waarschijnlijk een intensere longrespons plaatsvindt waarbij andere antioxidant routes betrokken zijn.
DEP induceerde acuut de genexpressie van HO-1, thioredoxine en superoxidedismutase 2 (SOD-2) in humane bronchiale epitheelcellen (Hoofdstuk 6). Chronische blootstelling aan DEP (60 dagen) had geen effect op Nrf2 expressie (Hoofdstuk 7). Echter, de eiwitexpressie van glutathionperoxidase-1/2 (Gpx-1/2) en catalase was verhoogd in verdediging tegen DEP-geïnduceerde oxidatieve stress; dit werd geremd door DMF-behandeling (Hoofdstuk 7). Dit was opmerkelijk aangezien verwacht werd dat DMF de expressie van antioxidanten zou verhogen (om de effecten van DEP te verminderen). Daarentegen zou er gespeculeerd kunnen worden dat omdat er behandeld werd met DMF en stress dus over tijd werd tegengegaan, de antioxidant respons niet bijzonder uitgesproken is op de tijd van meting.
241
In A549 cellen was door een andere groep aangetoond dat stimulatie met PM2.5 voor 30-60 min nucleaire translocatie van Nrf2 induceerde, wat een teken is van Nrf2 activatie. Verschillen in de bevindingen tussen longweefsel en A549 cellen met betrekking tot Nrf2 inductie/activatie kunnen wellicht verklaard worden door het feit dat het gaat om een A549 alveolaire epitheelcellijn die afkomstig is van longkankerweefsel en/of door de verschillen in tijd van blootstelling aan de stimulus (30-60 min versus 60 dagen). Glutathion (GSH) speelt een centrale rol in de cellulaire redox-balans; daar waar een GSH-deficiëntie leidt tot een toename in de gevoeligheid voor oxidatieve stress (wat geassocieerd is met kankerprogressie), kan verhoogd GSH de antioxidant capaciteit en daarmee de resistentie tegen oxidatieve stress doen toenemen. Gebaseerd op onze bevindingen en de huidige literatuur, hangt de cellulaire respons op blootstelling aan luchtvervuilingscomponenten sterk af van het experimentele model, het bestudeerde celtype, blootstellingstijd aan de stimulus, en het tijdstip van datacollectie. We lieten verschillende effecten op Nrf2 expressie zien in onze DEP- en DBPM-studies in acute en chronische modellen, en toonden aan dat luchtvervuilingscomponenten het vermogen hebben om in de longen diverse cellulaire signaalroutes aan te sturen in respons op oxidatieve stress. Onze bevinding dat acute en chronische blootstelling aan respectievelijk DBPM en DEP Nrf2 differentieel beïnvloedt, lijkt te bevestigen dat Nrf2 expressie afhangt van de blootstellingstijd en/of de stimulus. Desalniettemin, deze resultaten identificeren wellicht een nieuwe dynamiek in de expressie en functie van Nrf2 in acute en chronische stress.
De effecten van luchtvervuilingscomponenten op luchtwegontsteking
Luchtwegontsteking is nauw betrokken bij de negatieve effecten van luchtvervuiling op het respiratoire systeem en luchtvervuiling is geassocieerd met exacerbaties in astma en COPD. Ontstekingscellen zoals neutrofielen en macrofagen zijn cruciaal in het ontstekingsproces, met name vanwege hun vermogen om cytokines te produceren. De data in Hoofdstukken 5 en 7 laten zien dat acute blootstelling van muizen aan DBPM en DEP het aantal macrofagen in de BAL verhoogd. Daarnaast resulteerde chronische DEP expositie tot een toename in het totaal aantal ontstekingscellen in de BAL, wat effectief geremd kon worden door DMF-behandeling (Hoofdstuk 7). Onze bevindingen tonen aan dat acute en chronische blootstelling aan luchtvervuilingscomponenten voldoende is om een toename in ontstekingscellen te induceren in de luchtwegen van muizen.
242
De induceerbare transcriptiefactor NF-B is in belangrijke mate betrokken bij de regulatie van (luchtweg)ontsteking door de transcriptie en secretie van verscheidene cytokines, chemokines en groeifactoren in gang te zetten. In Hoofdstukken 5 en 7 lieten we een toename in p-NF-B en NF-B p65 expressie zien in de longen van muizen die ofwel met DBPM of DEP waren gestimuleerd. Het therapeutische vermogen van DMF om DEP-geïnduceerde luchtwegontsteking te remmen werd bevestigd door de observatie dat de eiwitexpressie van NF-B p65 was verlaagd in de longen van muizen die blootgesteld aan DEP en behandeld met DMF waren (Hoofdstuk 7).
Tevens hebben we de effecten van DBPM en DEP op de inductie van cytokines in respectievelijk muizen en humane epitheelcellen (BEAS-2B) bestudeerd. DBPM verhoogde tumornecrosefactor- (TNF-) in BAL (Hoofdstuk 5) en DEP leidde tot een toename in interleukine (IL)-8 en IL-6 mRNA- en eiwitexpressie (Hoofdstuk 6). Een voorgaande studie gebruikmakend van een ander experimenteel model had reeds laten zien dat verstoven DEP de genexpressie van C-X-C motief chemokine ligand 8 (CXCL8), TNF-, en NF-B verhoogde in primaire humane bronchiale epitheelcellen. Cumulatief geven deze data aan dat blootstelling aan luchtvervuilingscomponenten de NF-B signaalroute kan activeren, wat leidt tot een toename in cytokines en chemokines (o.a. geproduceerd door residente cellen zoals epitheelcellen), en uiteindelijk een verergering van luchtwegontsteking.
Hoewel DBPM en DEP beide in staat zijn om sufficiënt luchtwegontsteking en een (cellulaire) respons geassocieerd met oxidatieve stress te induceren, worden bepaalde karakteristieken door deze luchtwegvervuilingscomponenten differentieel beïnvloed. Om de vraag te beantwoorden of DBPM minder schadelijk is voor longgezondheid dan DEP, gebaseerd op studies kijkend naar ontsteking en oxidatieve stress, is het noodzakelijk om de effecten van DBPM en DEP direct en in hetzelfde model te vergelijken. Studies worden momenteel ontworpen om dit doel te bereiken.
De invloed van DEP expositie op de epitheliale-mesenchymale transitie
Epitheliale-mesenchymale transitie (EMT) wordt gekenmerkt door een verlies in epitheliale integriteit en barrièrefunctie wat gepaard gaat met de transformatie van een epitheliaal naar een meer mesenchymaal fenotype. In Hoofdstuk 6 werden de effecten van DEP op de expressie van EMT markers onderzocht. Blootstelling van BEAS-2B cellen aan DEP resulteerde in de inductie van de mesenchymale markers TGF-1, -catenine, en collageen-1, en een verlaging van de epitheliale markers E-cadherine en
243
ZO-1. Tot dusver zijn er slechts een aantal andere studies geweest die de invloed van luchtvervuiling op EMT hebben onderzocht. Bijvoorbeeld, recent werk toonde aan dat blootstelling van BEAS-2B aan een lage concentratie DEP (50-150 maal lager dan gebruikt in onze studies) voor een looptijd van 6 maanden de eiwitexpressie van E-cadherine, vimentine en N-cadherine niet veranderde, wat aangeeft dat er geen effect was op EMT. Tot onze verbazing, werden er in die studie ook geen indicaties van (toegenomen) ontsteking, oxidatieve stress of genotoxiciteit waargenomen. Wanneer dit vergeleken wordt met onze bevindingen, komen we tot de conclusie dat het zou kunnen zijn dat de bron van en het type luchtvervuilingscomponent een verschillende mate van EMT en longschade induceren. Daarnaast dient het ook vermeld te worden dat de blootstellingstijd aan en de concentratie van DEP in belangrijke mate de cellulaire respons lijken te beïnvloeden.
De effecten van DEP blootstelling op cAMP signalering
Cyclisch adenosinemonofosfaat (cAMP) is een uitermate belangrijke boodschapper in de transductie van extracellulaire signalen naar het interieur van de cel, wat gereflecteerd wordt door directe betrokkenheid in de regulatie van een groot aantal (cel)fysiologische processen. Zo is cAMP-signalering betrokken bij het handhaven van de cellulaire barrièrefunctie, wat een positieve rol speelt in het behouden van longfunctie. Echter, de directe invloed van DEP op cAMP signalering was tot dusver nog niet beschreven. De inductie van cAMP wordt primair geïnitieerd door Gs-eiwit gekoppelde receptoren, zoals de 2-adrenoreceptor (2-AR) en verschillende prostanoïde E receptoren (EP). In Hoofdstuk 2 werd beschreven hoe cAMP scaffolds kunnen bijdragen aan COPD symptomen en werd er uitgeweid over hun mogelijke rol in gezondheid en ziekte. De studies in Hoofdstuk 6 lieten zien dat DEP blootstelling de expressie van Epac1 veranderde, daar waar er geen significante effecten werden waargenomen op Epac2 en fosfo-PKA substraten. Onderzoek van onze groep toonde eerder aan dat Epac en PKA op een gecoördineerde manier een partiële rol spelen in de regulatie van ontsteking, oxidatieve stress en EMT. Er werd onder andere gedemonstreerd dat -catenine door Epac gelinkt wordt aan EMT. Daarnaast kwam uit onze studie die gebruik maakte van een model waarin muizen acuut werden blootgesteld aan sigarettenrook naar voren dat Epac1 het remodeleringsproces gelinkt aan EMT remde, daar waar Epac2 ontsteking bevorderde. In Hoofdstuk 6 beschreven we dat DEP de genexpressie van 2-AR en EP4, maar niet EP2 en EP3, induceerde. Tevens verhoogde DEP de mRNA expressie van adenylaatcyclase (AC)7, -3 en -6, maar had
244
het geen effect op AC1, -4 en -5. In overeenstemming met onze bevindingen zijn veranderingen in het expressieprofiel van cAMP-genererende receptoren aangetoond in de longen van bijv. IPF en COPD patiënten. Ook is in primaire muis tracheale epitheelcellen en humane luchtweg gladde spiercellen gevonden dat blootstelling aan polycyclische aromatische koolwaterstoffen, die vrijkomen tijdens dieselverbranding, de cAMP productie in respons op 2-AR stimulatie verminderde. Wij evalueerden in Hoofdstuk 6 ‘real-time’ veranderingen in cAMP in BEAS-2B cellen door gebruik te maken van een GloSensor cAMP assay, en lieten zien dat DEP de cAMP productie geïnduceerd door stimulatie met forskoline (directe activator van AC), fenoterol (-AR agonist) of een stabiele PGE2 analoog (EP4 agonist) dramatisch reduceerde. Deze observaties geven aan dat DEP het vermogen van cAMP-genererende receptoren en ACs om intracellulair cAMP te produceren modificeert, wat negatieve gevolgen kan hebben voor longfunctie.
AKAP1 wordt geassocieerd met mitochondriale cAMP compartimentering en functie, en dient als een mitochondriaal anker-eiwit. DEP expositie resulteerde in een toename in AKAP1 genexpressie in BEAS-2B cellen (Hoofdstuk 6). Alles bij elkaar genomen, suggereren onze resultaten dat DEP blootstelling leidt tot een verstoring in het cellulaire vermogen om cAMP te genereren, wat wellicht geassocieerd is met een verandering in de expressie van belangrijke sleutelspelers (bijv. receptoren en/of specifieke anker-eiwitten) en/of een ontwrichting tussen AC activatie en cAMP productie. Functioneel gezien, lijken deze veranderingen te leiden tot EMT en een mogelijke verergering van longschade.
Effecten van DEP op mitochondriale functie
In mitochondriën kan de inductie van oxidatieve stress en inflammatie plaatsvinden door een verhoging in ROS concentraties, wat leidt tot mitochondriale dysfunctie. In Hoofdstuk 6 lieten we zien dat blootstelling aan DEP resulteerde in een toegenomen mRNA expressie van het mitochondriale matrix enzym SOD-2, wat een verandering in mitochondriale functie suggereert. Daarnaast werden de effecten van DEP op mitochondriale morfologie onderzocht. Hiertoe werden mitochondriën onderverdeeld in 3 categorieën: langwerpige (I), gefragmenteerde (II) en morfologisch ongedefinieerde (III) mitochondriën. DEP resulteerde in de fragmentatie van mitochondriën (een relatieve switch van categorie I naar II); ook deze observatie ondersteunt het optreden van mitochondriale dysfunctie ten gevolge van DEP blootstelling. Onder specifieke condities zoals stress, hebben cellen additionele energy nodig; deze wordt verkregen door
245
oxidatieve fosforylering en de ‘extra’ ATP die kan worden gegenereerd wordt de mitochondriale reservecapaciteit genoemd. DEP expositie reduceerde significant de basale en ATP-gelinkte mitochondriale respiratie, en de mitochondriale reservecapaciteit. Glycolyse draagt ook in belangrijke mate toe aan de cellulaire energieproductie; blootstelling van BEAS-2B cellen aan DEP verminderde de glycolytische capaciteit en reserve. Onze resultaten geven dus aan dat DEP het cellulaire vermogen om additionele energie te genereren drastisch reduceert.
Voorgaande studies hebben laten zien dat blootstelling aan DEP de mitochondriale membraanpotentiaal kan verminderen in macrofagen, wat onderstreept dat DEP expositie mitochondriale dysfunctie kan induceren. Zoals aangegeven, laten onze resultaten in Hoofdstuk 6 duidelijk zien dat DEP op een concentratie-afhankelijke manier leidt tot modificaties in mitochondriale morfologie en bio-energetica. Dergelijke verstoringen in cellulaire mitochondriale functie kunnen mogelijke bijdragen aan longdysfunctie. Onze studies zijn de eerste die de effecten van DEP blootstelling op specifieke aspecten van mitochondriale functie, zoals mitochondriale respiratie, reservecapaciteit, en glycolytische reserve, hebben bekeken in humane bronchiale epitheelcellen.
Perspectieven voor de toekomst
De studies beschreven in dit proefschrift laten zien dat blootstelling aan de luchtwegvervuilingscomponenten DBPM en DEP inflammatie, oxidatieve stress en EMT bevorderen in de luchtwegen en longen. Daarnaast induceerde DEP mitochondriale dysfunctie en een reductie in het cellulaire vermogen om cAMP te genereren. Tot dusver zijn er naar ons beste weten geen studies gepubliceerd die de betrokkenheid van mitochondriale cAMP nanodomeinen in deze effecten hebben onderzocht. Wij stellen voor dat dergelijke studies onderdeel dienen te zijn van toekomstig onderzoek dat zich richt op het beter begrijpen van de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de negatieve effecten van verscheidene luchtvervuilingscomponenten op longgezondheid.
Samen bevorderen oxidatieve stress en ontsteking longschade en vertegenwoordigen ze de voornaamste mechanismen verantwoordelijk voor luchtvervuilingstoxiciteit. Er is duidelijk een dringende behoefte om therapiestrategieën te identificeren die specifiek op deze processen zijn gericht. Er zijn slechts een aantal studies geweest die de effecten van mogelijke drugs of substanties op schade veroorzaakt door luchtvervuiling in de longen hebben bestudeerd. Ons werk identificeert en benadrukt het veelbelovende
246
therapeutische vermogen van DMF in het verminderen van DEP-geïnduceerde parameters van luchtwegontsteking, oxidatieve en nitrosatieve stress, en longschade in het algemeen. Toekomstige studies die de differentiële invloed van DMF op de inflammatoire respons en het antioxidant systeem onderzoeken kunnen verder bouwen op deze belangrijke observaties.
Belangrijkste conclusies van dit proefschrift:
• Acute blootstelling aan DBPM leidt tot een inflammatoire respons die gekenmerkt wordt door een toename in het aantal macrofagen en een verhoogde TNF- expressie in de longen van muizen. Daarnaast bevordert het oxidatieve schade door de expressie van ROS en lipide peroxidatie te induceren (Hoofdstuk 5).
• De inflammatoire respons en oxidatieve schade geïnduceerd door DBPM is mogelijk gerelateerd aan de toegenomen eiwitexpressie van p-NF-B en Nrf2 in het longparenchym (Hoofdstuk 5).
• Blootstelling van BEAS-2B cellen aan DEP resulteert in oxidatieve stress en de expressie van inflammatoire cytokines en EMT markers (Hoofdstuk 6).
• DEP expositie leidt tot een verminderd vermogen van Gs-eiwit gekoppelde receptoren en subtypes van de AC-superfamilie om cellulair cAMP te genereren. Deze effecten vinden hand in hand plaats met de inductie van verschillende kenmerken van mitochondriale dysfunctie (Hoofdstuk 6). Zowel de verminderde capaciteit om cAMP te produceren als de modificaties in mitochondriale morfologie en bio-energetica dragen hoogstwaarschijnlijk bij aan de negatieve effecten van luchtvervuiling op longgezondheid.
• Behandeling van muizen met DMF remt op een efficiënte manier de door DEP geïnduceerde oxidatieve (reductie in intracellulair ROS) en nitrosatieve (verlaging in ONOO en NO) stress (Hoofdstuk 7). Luchtwegontsteking als gevolg van chronische blootstelling aan DEP lijkt geassocieerd te zijn met een toename in NF-B p65; ook dit wordt net als de verhoging in Keap-1 geremd door DMF behandeling (Hoofdstuk 7). Alles bij elkaar genomen, geven onze bevindingen aan dat DMF wellicht beschouwd kan worden als een therapeutisch middel in de behandeling van inflammatoire longziektes die geassocieerd zijn met luchtvervuiling.
247 Curriculum Vitae
Isabella Cattani Pinto Cavalieri, the author of this thesis, was born in Rio de Janeiro, on the 28 of September in 1989. In 2010, the author started her bachelor in Biological Science at Veiga de Almeida University. During her bachelor, she completed a research internship investigating an in vivo model for emphysema and lung fibrosis at LABIOREDOX at Federal University of Rio de Janeiro. After obtaining her Bachelor degree in 2014, the author entered the Experimental and Human Biology master at the Rio de Janeiro State University. Her research project studied the role of air pollution and the effect in pulmonary system using in vivo model in the research group Tissue Repair Laboratory at Rio de Janeiro State University. In 2016, she started her Ph.D in Morphological Sciences at Federal University of Rio de Janeiro. In 2017, she received a grant from Coordination for the Improvement of Higher Education Personnel, CAPES, for sandwich Ph.D. programme during one year at University of Groningen, The Netherlands, at the Department of Molecular Pharmacology. The supervision of her sandwich Ph.D. was with Prof. Dr. Martina Schmidt, head of Molecular Pharmacology. During her sandwich Ph.D. she had the oportunity to extent her studies on cAMP and also get her double degree. The project of her Ph.D. investigated the role of air pollution and lung effects in inflammation and oxidative stress, and, more specifically, the impact on cAMP signaling and mitochondrial function, the results of which are described in the thesis presented here.
249 List of publications
Schmidt M, Cattani-Cavalieri I, Nunez FJ, Ostrom RS. Phosphodiesterase isoforms and cAMP compartments in the development of new therapies for obstructive pulmonary diseases. Curr Opin Pharmacol. 2020;51:34-42.
Cattani-Cavalieri I, Valenca SDS, Schmidt M. Nanodomains in cardiopulmonary disorders and the impact of air pollution. Biochem Soc Trans. 2020.
Cattani-Cavalieri I, da Maia Valenca H, Moraes JA, Brito-Gitirana L, Romana-Souza B, Schmidt M, et al. Dimethyl Fumarate Attenuates Lung Inflammation and Oxidative Stress Induced by Chronic Exposure to Diesel Exhaust Particles in Mice. Int J Mol Sci. 2020;21(24).
Zuo H, Cattani-Cavalieri I, Valenca SS, Musheshe N, Schmidt M. Function of cAMP scaffolds in obstructive lung disease: Focus on epithelial-to-mesenchymal transition and oxidative stress. Br J Pharmacol. 2019;176(14):2402-15.
Zuo H, Cattani-Cavalieri I, Musheshe N, Nikolaev VO, Schmidt M. Phosphodiesterases as therapeutic targets for respiratory diseases. Pharmacol Ther. 2019;197:225-42. Kennedy-Feitosa E, Cattani-Cavalieri I, Barroso MV, Romana-Souza B, Brito-Gitirana L, Valenca SS. Eucalyptol promotes lung repair in mice following cigarette smoke-induced emphysema. Phytomedicine. 2019;55:70-9.
Cattani-Cavalieri I, Valenca SS, Lanzetti M, Carvalho GMC, Zin WA, Monte-Alto-Costa A, et al. Acute Exposure to Diesel-Biodiesel Particulate Matter Promotes Murine Lung Oxidative Stress by Nrf2/HO-1 and Inflammation Through the NF-kB/TNF-alpha Pathways. Inflammation. 2019;42(2):526-37.
Barroso MV, Graca-Reis A, Cattani-Cavalieri I, Gitirana LB, Valenca SS, Lanzetti M. Mate tea reduces high fat diet-induced liver and metabolic disorders in mice. Biomed Pharmacother. 2019;109:1547-55.
Melo AC, Cattani-Cavalieri I, Barroso MV, Quesnot N, Gitirana LB, Lanzetti M, et al. Atorvastatin dose-dependently promotes mouse lung repair after emphysema induced by elastase. Biomed Pharmacother. 2018;102:160-8.
Pinho-Ribeiro V, Melo AC, Kennedy-Feitosa E, Graca-Reis A, Barroso MV, Cattani-Cavalieri I, et al. Atorvastatin and Simvastatin Promoted Mouse Lung Repair After Cigarette Smoke-Induced Emphysema. Inflammation. 2017;40(3):965-79.
Barroso MV, Cattani-Cavalieri I, de Brito-Gitirana L, Fautrel A, Lagente V, Schmidt M, et al. Propolis reversed cigarette smoke-induced emphysema through macrophage alternative activation independent of Nrf2. Bioorg Med Chem. 2017;25(20):5557-68. Cattani-Cavalieri I, Reis AG, Kennedy-Feitosa E, Pinho-Ribeiro V, Lanzetti M, Gitirana LB, et al. Pulmonary Emphysema Cross-Linking with Pulmonary Fibrosis and Vice Versa: a Non-usual Experimental Intervention with Elastase and Bleomycin. Inflammation. 2017;40(5):1487-96.
251 Acknowledgements
Dear Martina Schmidt, I remember when I meet you in Rio and I saw a lecture from you. I was really happy to meet an international researcher during my internship. I would never imagine that after a few years you would become my supervisor and we would work together. I would like first to thank you for welcoming me to your Department during my year in Groningen. From there I learned a lot with you and with our conversations and discussions. You were always present, teaching me and doing everything possible to guide me through my double Ph.D. Thank you for your constructive comments on my research, article and thesis writing. I learned a lot with you! Thank you also for all our conversations along these years, it was always great to talk to you. Thank you for everything!
To my supervisor from Brazil, Samuel dos Santos Valença, first of all, thank you so much for all the 9 years working together. Thank you for your supervision along these years, for teaching me how to do a research, how to design a good experiment, write articles and thesis. During these years we had nice conversations and discussions. Thank you for believing in me. You were always there to help with anything that I needed. You were always willing to help me through this long journey that is the Ph.D. Thank you so much!
Bruna Romana de Souza, thank you for always encouraging me during my Ph.D., and to be available to help me in case I needed. Since my master you taught me how to do research, to plan experiments and to write article. Thank you for everything
Manuella Lanzetti, thank you for our conversations, your advices and suggestions about the project and for all help during these years.
Amalia Dolga, thank you for always being kind and nice to me. It was my pleasure to meet you. Thank you also for arranging a trip to Bremen for Christmas market. It was super fun! Reinoud Gosens, it was great to meet you. Thank you for all suggestions and comments during the lab meeting and for the fun we had during our pop quizzes. Barbro Melgert, thank you for kindly providing us with macrophages for the experiments. Thank you also for your comments and suggestions during my presentation.
I would also like to thank the assessment committee for reading my thesis. The suggestions and corrections were very helpful and indeed improved the thesis quality. Rennolds Ostrom, thank you for accepting me as a post doc in your lab. I’m looking forward to join your lab and to work with you.
252
Angélica Sabogal, my dear Colombian friend and paranymph, thank you so much for everything! I’m glad to meet you and to have shared the same office. Because of this we were able to talk and share stories about our lives. You are very important for me and I hope that we can meet again in Brazil or Colombia. We had such nice moments together in Groningen that I will never forget.
Asmaa Oun, my dear friend and paranymph, I’m so happy to be able to meet you and to have you as friend. You are such a strong woman, always happy and willing to help when I needed it. Thank you for your help and support with Seahorse measurements and things for my defense. It was my pleasure to have shared the same office with you. I hope we can meet each other again soon.
Haoxiao Zuo, thank you so much for teaching me how to work with cells. Thank you for your friendship and for all help and support! I’m very happy to have had you as a friend during my year in Groningen.
Melissa van der Veen, thank you for everything! Your support and help with the experiments were essential for my conclusion. You were always willing to help and always smiley. It was great to talk to you about several things, specially about series and La Casa de Papel.
Annete Zuidhof, thank you for welcoming me to your office and for such nice conversations. I’m glad to have shared the same office with you. You are very kind and nice person. I admire you for your strength and positiveness.
Hoeke Baarsma, your help and support with the experiments were crucial to finalize my Ph.D. Thank you so much for everything! Emily Oosterhout, thank you for your support with the experiments. Pien Goldsteen, you were always kind and very friendly with me. I felt very luck to meet you and to spend some time with you. Xinhui Wu, it was great to spend some time with you during Lung Science Conference in Estoril, Portugal. Hope to see you soon again in another Lung Science Conference.
I want to thank my coworkers Mariska van den Berg, Loes Kistemaker, Carolina Elzinga, Sophie Bos, Janneke Fekkes-Koolman, John-Poul Ng-Blichfeldt, Chiara Ciminieri, Ayha Rahmawati, Inge Krabbendam, Rosa Kortekaas, Lars Verkleij, and Celine Warries.
I would like to thank to my lovely husband Danillo Amorim Surica for all support during my Ph.D. You were always patient and always trying to keep me calm when I needed it. Your love was crucial to my conclusion. Thank you so much! My beautiful son Thomas
253
Cavalieri Surica, I’m glad to be your mother, your love and smile gives me energy to keep going. Thank you my “grudinho”!
I would like to thank to my family, but specially my parents, Norma Cattani Pinto Cavalieri e Marcos Cavalieri, my brother Fábio Cattani Pinto Cavalieri, and my grandmother Martha Laeticia Cattani Pinto. Your support and love helped me to get here. Without you this would never be possible.
My friends from UFRJ and UERJ, Adriana Melo, Aline Donato Trancoso, Aline Pontes Cardoso, Bianca Saguie, Cynthia Pecli, Emanuel Kennedy Feitosa, Fátima dos Anjos, Fernanda Schanuel, Sara Vergel Posso, Marina Valente your friendship and support were essential, thank you so much! Helber da Maia Valença, with your help and support I was able to finalize mu Ph.D. Thank you so much!
To my Brazilian friends that I made in Groningen, Marina de Rezende e Salomão Jorge, thank you for our time together! Thank you also to Ana Clara Cassanti e Paulo Cezar Rocha, it was great to have your friendship in Groningen, thank you so much for all help! A special thanks to my friend Adriane Reis Canicoba, firstly, thank you for introducing me to Samuel in 2011. This is one of the reasons why I’m concluding my Ph.D. Thank you also for always encouraging me to keep going, for believing in me and for listening when I needed!
