University of Groningen Lactococcus lactis bacteriophages: phage-host interaction and phage transduction Marcelli, Barbara

(1)

University of Groningen

Lactococcus lactis bacteriophages: phage-host interaction and phage transduction

Marcelli, Barbara

DOI:

10.33612/diss.118088081

IMPORTANT NOTE: You are advised to consult the publisher's version (publisher's PDF) if you wish to cite from it. Please check the document version below.

Document Version

Publisher's PDF, also known as Version of record

Publication date: 2020

Link to publication in University of Groningen/UMCG research database

Citation for published version (APA):

Marcelli, B. (2020). Lactococcus lactis bacteriophages: phage-host interaction and phage transduction. Rijksuniversiteit Groningen. https://doi.org/10.33612/diss.118088081

Copyright

Other than for strictly personal use, it is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of the author(s) and/or copyright holder(s), unless the work is under an open content license (like Creative Commons).

Take-down policy

If you believe that this document breaches copyright please contact us providing details, and we will remove access to the work immediately and investigate your claim.

Downloaded from the University of Groningen/UMCG research database (Pure): http://www.rug.nl/research/portal. For technical reasons the number of authors shown on this cover page is limited to 10 maximum.

(2)

540959-L-bw-Marcelli 540959-L-bw-Marcelli 540959-L-bw-Marcelli 540959-L-bw-Marcelli Processed on: 7-2-2020 Processed on: 7-2-2020 Processed on: 7-2-2020

Processed on: 7-2-2020 PDF page: 161PDF page: 161PDF page: 161PDF page: 161

(3)

162

Het belang van Lactococcus lactis voor de zuivelindustrie

L.lactis is een grampositieve bacterie die op grote schaal wordt gebruikt als startercultuur

voor de productie van verschillende gefermenteerde zuivelproducten, waaronder een grote verscheidenheid aan zachte en harde kazen (1). L.lactis speelt een cruciale rol in de zuivelproductie, omdat het de fermentatie van suiker in de rauwe melk in gang zet wat nodig is om het productieproces te starten (2). Bovendien beïnvloeden verschillende tussen- en eindproducten van het L.lactis-metabolisme de smaak en textuur van het uiteindelijke gefermenteerde voedsel (3, 4).

Bacteriofagen van Lactococcus lactis en hun impact op de zuivelindustrie

Bacteriofagen zijn virussen die bacteriële cellen infecteren en de replicatie, transcriptie en translatie machines van hun gastheer gebruiken om nieuwe kopieën van het virale genoom en van de eiwitten waaruit het intacte virus bestaat, te synthetiseren. Ze worden beschouwd als de meest voorkomende biologische entiteiten op de planeet met de aanwezigheid van naar schatting 1031_{deeltjes in elke biologische niche in de biosfeer}

(5). Alle bekende bacteriofagen die L.lactis infecteren, bezitten een dsDNA-genoom en behoren daarom tot de orde Caudovirales (6). Tot nu toe zijn tien verschillende soorten bacteriofagen van Lactococcus lactis bekend, namelijk 936, c2, P335, KSY1, Q54, 1358, P087, 949, P034 en 1706 (7). In zuivelfabrieken kunnen deze bacteriofagen de lactococcen-starterculturen infecteren en doden, wat leidt tot het stopzetten of het volledig mislukken van de fermentatie met als gevolg grote economische verliezen voor de zuivelindustrie (8). Bacteriofagen van lactococcen zijn de afgelopen decennia uitgebreid onderzocht vanwege het schadelijke effect dat ze kunnen hebben op de zuivelproductie. Leden van de 936-, c2- en P335-soorten hebben de meeste aandacht van de wetenschappelijke gemeenschap gekregen, omdat ze het meest voorkomen in de zuivelindustrie (8). Leden van resterende soorten kunnen echter ook een nadelige impact op de fermentatie hebben en zijn ook bestudeerd, al zij het in mindere mate (9-11).

Strekking van het proefschrift

Het werk dat in dit proefschrift wordt gepresenteerd, betreft de studie van verschillende aspecten van infectie door bacteriofagen van Lactococcus lactis en de interactie met bacteriële gastheren. Zuivelbedrijven die L.lactis routinematig gebruiken voor de bereiding van starterculturen, vertrouwen sterk op de voortdurende instroom van nieuwe ontdekkingen met betrekking tot lactococcenbacteriofaag-gastheerinteractie, herkenning van gastheer receptoren, adaptatiemechanismen van bacteriofagen naar nieuwe gastheren en omgevingen, en genoomstructuur en samenstelling. Naast het leveren van waardevolle informatie die gebruikt kan worden om voedselfermentatieprocessen te verbeteren is onderzoek naar bacteriofagen van Lactococcus lactis van groot belang, omdat het referentie informatie kan bieden voor onderzoek naar bacteriofagen die grampositieve bacteriën infecteren.

(4)

163

Faag-gastheer interactiestudie

Onze inspanningen waren gericht op een bibliotheek bestaande uit 22 bacteriofagen die geïsoleerd zijn uit mislukte fermentatieprocessen in zuivelfabrieken wereldwijd. Al deze fagen werden getest op een panel van 18 lactococcen zuivelderivaten en laboratoriumstammen om hun gastheerbereik te beoordelen. Tegelijkertijd hebben we de genoomsequenties van zowel bacteriën als bacteriofagen gesequenced. De fenotypische resultaten werden geanalyseerd samen met de in silico gegevens gegenereerd uit het sequencen van de genomen om de verschillende aspecten te onderzoeken die betrokken zijn bij de bepaling van faag-gastheerbereik. We hebben ons vooral gericht op het beoordelen of de huidige kennis met betrekking tot faag-gastheerinteractie ook van toepassing is op onze verzameling bacteriofagen. We hebben dus bijgedragen aan de toename van genoomsequentiegegevens die beschikbaar zijn over bacteriofagen van

Lactococcus lactis, en, anderzijds, hebben we ten minste één uitzondering geïdentificeerd

met betrekking tot de interactie tussen c2 bacteriofagen en hun gastheren. Verder hebben we mogelijk een nieuwe en nog niet gekarakteriseerde subgroep van bacteriofagen geïdentificeerd binnen de 936 soorten (hoofdstuk 2).

Het sequencen van de genomen maakte ook de identificatie van een nieuw lid van de zeldzame lactococcenfaag soort 1706 mogelijk die tot dat moment alleen bestond uit één bekend lid (faag 1706) (9) en vier andere isolaten die werden beschouwd als verre verwanten (12). Door het combineren van concurrentie testen, microscopie analyse en in silico onderzoek, leveren we sterk bewijs dat aantoont dat deze faag, CHPC971 genaamd, een suikereceptor herkent die ingebed is in de polysacharide pellikel van de celwand van zijn gastheer, en dat rhamnose een belangrijke rol speelt in deze interactie. Ten slotte stelde een gedetailleerde analyse van het faaggenoom ons in staat potentiële genen te identificeren die betrokken zijn bij gastheerherkenning in faag CHPC971 en, mogelijk, in andere leden van deze nog slecht gekarakteriseerde soorten van lactococcenfagen (hoofdstuk 3).

Het gebruikmaken van door bacteriofaag-gemedieerde horizontale genoverdracht voor nuttige doeleinden

Lactococcen-starterculturen spelen een belangrijke rol in zuivelfermentatieprocessen en bij het definiëren van de uiteindelijke smaak en textuur van de eindproducten. Om deze reden onderzoeken zuivelbedrijven voortdurend nieuwe en betrouwbare hulpmiddelen voor de verbetering van de metabole vaardigheden van de bacteriestammen die worden gebruikt als starterculturen (13). Recombinant-DNA technologie, die routinematig wordt gebruikt in onderzoekslaboratoria, zou de perfecte strategie zijn voor selectieve genotypische verbetering van micro-organismen, vooral vanwege de nauwkeurigheid en betrouwbaarheid. Deze benadering leidt echter tot organismen die als genetisch gemodificeerd (GMO’s) worden beschouwd en die de Europese Unie momenteel

(5)

164

strikt verbiedt om op de markt te brengen (14, 15). In hoofdstuk 4 behandelen we het mogelijke gebruik van door bacteriofagen gemedieerde laterale genoverdracht (bacteriofaagtransductie), als een hulpmiddel voor genoomveranderingen in L. lactis starterculturen. Een dergelijke techniek zou tot bacteriestammen kunnen leiden die als niet-GMO’s worden beschouwd en zodanig mogen worden gebruikt op de levensmiddelenmarkt in de Europese Unie. Drie isolaten behorende tot de c2-soort werden geselecteerd en getest op hun vermogen om chromosomaal en plasmide DNA over te dragen tussen stammen van lactococcen. Plasmide DNA bleek succesvol te zijn overgedragen met alle geteste bacteriofagen, en onze gegevens bieden waardevolle informatie over de opzet van een efficiënte faagtransductieprocedure.

Analyse van alternatieve faag-gastheer interactiemechanismen

Hoofdstuk 5 onderzoekt een minder vaak onderzocht faag-gastheer interactiemechanisme,

bekend als ‘’carrier-state life cycle’’ (CSLC) (16), in L. lactis. De in dit hoofdstuk gerapporteerde gegevens bieden bevestigend bewijs van de aanwezigheid van een CSLC-faag, behorende tot de c2-soort, in het laboratoriummodel stam L. lactis MG1363. Door een gecombineerde benadering van fenotypische en in silico analyse te gebruiken, konden we aantonen dat de interactie tussen de CSLC-faag met een tweede, ongelijke, c2-bacteriofaag die L.lactis MG1363 infecteert, leidt tot de afgifte van een gemengde faagpopulatie, waarvan de leden variëren in hun genoomsequentie en gastheerbereik. We stellen voor dat dit één van de evolutionaire mechanismen is die bacteriofagen gebruiken om zich snel aan te passen aan verschillende gastheren en omgevingen. Wij zijn van mening dat deze resultaten waardevol zullen blijken te zijn voor het voorkomen van bacteriofaaginfectie van industriële starterstammen. Onze gegevens bieden ook baanbrekende resultaten en waardevolle inzichten in alternatieve faag-gastheer interacties bij grampositieve bacteriën en tonen aan dat de resultaten van faaginfecties ingewikkelder kunnen zijn dan momenteel wordt verondersteld.

De belangrijkste resultaten van dit proefschrift zijn samengevat en verder bediscussieerd in hoofdstuk 6.

(6)

165

REFERENTIES

1. Song AA-L, In LLA, Lim SHE, Rahim RA. 2017. A review on Lactococcus lactis: from food to factory. Microbial Cell Factories 16:55.

2. Wouters JTM, Ayad EHE, Hugenholtz J, Smit G. 2002. Microbes from raw milk for fermented dairy products. International Dairy Journal 12:91–109.

3. Steele J, Broadbent J, Kok J. 2013. Perspectives on the contribution of lactic acid bacteria to cheese flavor development. Current Opinion in Biotechnology 24:135–141.

4. Marilley L, Casey MG. 2004. Flavours of cheese products: metabolic pathways, analytical tools and identification of producing strains. International Journal of Food Microbiology 90:139–159.

5. Clokie MR, Millard AD, Letarov AV, Heaphy S. 2011. Phages in nature. Bacteriophage 1:31–45.

6. Deveau H, Labrie SJ, Chopin M-C, Moineau S. 2006. Biodiversity and classification of lactococcal phages. Appl Environ Microbiol 72:4338–4346.

7. Oliveira J, Mahony J, Hanemaaijer L, Kouwen TRHM, van Sinderen D. 2018. Biodiversity of bacteriophages infecting Lactococcus lactis starter cultures. J Dairy Sci 101:96–105.

8. Muhammed MK, Kot W, Neve H, Mahony J, Castro-Mejía JL, Krych L, Hansen LH, Nielsen DS, Sørensen SJ, Heller KJ, van Sinderen D, Vogensen FK. 2017. Metagenomic Analysis of Dairy Bacteriophages: Extraction Method and Pilot Study on Whey Samples Derived from Using Undefined and Defined Mesophilic Starter Cultures. Appl Environ Microbiol 83: e00888-17.

9. Garneau JE, Tremblay DM, Moineau S. 2008. Characterization of 1706, a virulent phage from Lactococcus lactis with similarities to prophages from other Firmicutes. Virology 373:298–309.

10. Samson JE, Moineau S. 2010. Characterization of Lactococcus lactis Phage 949 and Comparison with Other Lactococcal Phages. Appl Environ Microbiol 76:6843–6852.

11. Dupuis M-E, Moineau S. 2010. Genome organization and characterization of the virulent lactococcal phage 1358 and its similarities to Listeria phages. Appl Environ Microbiol 76:1623–1632.

12. Kot W, Neve H, Vogensen FK, Heller KJ, Sørensen SJ, Hansen LH. 2014. Complete Genome Sequences of Four Novel Lactococcus lactis Phages Distantly Related to the Rare 1706 Phage Species. Genome Announc 2(4). 13. Derkx PMF, Janzen T, Sørensen KI, Christensen JE, Stuer-Lauridsen B, Johansen E. 2014. The art of strain

improvement of industrial lactic acid bacteria without the use of recombinant DNA technology. Microb Cell Fact 13 Suppl 1,S5.

14. Fresco LO. 2013. The GMO stalemate in Europe. Science 339:883.

15. GMO authorisations for food and feed - Food Safety (2003) Official Journal L268, 22 September, pp 1-22. 16. Díaz-Muñoz SL, Koskella B. 2014. Advances in Applied Microbiology, Chapter Four, Bacteria–Phage Interactions

(7)