University of Groningen Biodegradable implants for the biphasic pulsatile delivery of antigens Beugeling, Max

(1)

University of Groningen

Biodegradable implants for the biphasic pulsatile delivery of antigens

Beugeling, Max

DOI:

10.33612/diss.134204081

IMPORTANT NOTE: You are advised to consult the publisher's version (publisher's PDF) if you wish to cite from it. Please check the document version below.

Document Version

Publisher's PDF, also known as Version of record

Publication date: 2020

Link to publication in University of Groningen/UMCG research database

Citation for published version (APA):

Beugeling, M. (2020). Biodegradable implants for the biphasic pulsatile delivery of antigens: Toward single-injection vaccines. University of Groningen. https://doi.org/10.33612/diss.134204081

Copyright

Other than for strictly personal use, it is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of the author(s) and/or copyright holder(s), unless the work is under an open content license (like Creative Commons).

Take-down policy

If you believe that this document breaches copyright please contact us providing details, and we will remove access to the work immediately and investigate your claim.

Downloaded from the University of Groningen/UMCG research database (Pure): http://www.rug.nl/research/portal. For technical reasons the number of authors shown on this cover page is limited to 10 maximum.

(2)

547040-L-sub01-bw-Beugeling 547040-L-sub01-bw-Beugeling 547040-L-sub01-bw-Beugeling 547040-L-sub01-bw-Beugeling Processed on: 27-8-2020 Processed on: 27-8-2020 Processed on: 27-8-2020

Processed on: 27-8-2020 PDF page: 145PDF page: 145PDF page: 145PDF page: 145 145

I

Summary

II

Samenvatting

III

Biography & List of publications

IV

Dankwoord / Acknowledgements

Appendices

(3)

(4)

I SUMMARY

Currently, most vaccines require a primary (primer) and after a certain period of time, a secondary (booster) administration of the antigen in order to optimally protect the vaccinee against the pathogen. Hence, most vaccines are administered by using a multi-injection regime. However, such a multi-injection regime, also known as the prime-boost regime, presents several logistical and/or financial problems that lead to under-vaccination, especially in low- and middle-income countries. To decrease under-vaccination, these problems could be reduced by developing an injectable biodegradable implant with a biphasic pulsatile release profile. Such an implant mimics the currently applied prime-boost regime after a single shot by releasing a part of the antigen immediately after administration (primer), while the remaining part is released after a certain, preferably adjustable, lag time (booster). The aim of the research described in this thesis was to investigate the suitability of two different types of poly(DL-lactic-co-glycolic acid) (PLGA)-based prototypes for the biphasic pulsatile delivery of antigens.

The first prototype was based on the direct compaction of a physical mixture containing the antigen and either PLGA with a lactic:glycolic acid ratio of 50:50 (PLGA 50:50) or poly(DL-lactic acid) (PLA) (chapter 2). In vitro release studies, using theophylline as a model drug, showed that a biphasic pulsatile release profile with a 50-60% burst release and a 40-50% boost release was obtained from these physically mixed compacts if the glass transition temperature of the polymer was above the temperature during compaction but below the temperature during the release study. The results also showed that the lag time could be increased by increasing the lactic acid content of the applied polymer, i.e. PLGA 50:50-based compacts showed a shorter lag time prior to the delayed release than PLA-based compacts. This concept was evaluated for its suitability for the biphasic pulsatile delivery of bacterial polysaccharide-based antigens using blue dextran with a molecular weight of either 70 or 2000 kDa as model polysaccharides. An in vitro release study using PLGA 50:50-based compacts showed biphasic pulsatile release profiles similar to that of theophylline-containing compacts, which indicates that the molecular weight of the incorporated antigen does not influence the release characteristics. Collectively, these results show that the physical mixture prototype may be suitable for the biphasic pulsatile delivery of bacterial polysaccharide-based antigens. For the biphasic pulsatile delivery of protein-based antigens, this prototype was unfortunately not suitable.

Therefore, the second prototype, a core-shell implant consisting of a nonporous PLGA shell around a solid-state core containing the antigen, was investigated for protein-based antigens (chapter 3). We focused on the most challenging part of the biphasic pulsatile release profile, i.e. obtaining a delayed release of protein-based antigens after a certain, preferably adjustable, lag time. Relatively large (approximately 9 x 5 mm) core-shell compacts were evaluated as a proof of concept using ovalbumin

(5)

(OVA) as a model protein for protein-based antigens. To investigate whether the lag time prior to the delayed release could be tailored, PLGA with a lactic:glycolic acid ratio of either 50:50, 75:25, or 100:0 (= PLA) was applied as shell material. In vitro release studies with these core-shell compacts indeed showed a delayed release of OVA. However, the release was incomplete. The lag time prior to the delayed OVA release could be increased by increasing the lactic acid content of the polymeric shell. BALB/c mice immunized with a subcutaneously (s.c.) inserted OVA-containing core-shell compact with either a PLGA 50:50 or PLGA 100:0 shell showed a delayed OVA-specific IgG1 antibody response. Thus, these results indicate that a delayed release of OVA can also be achieved in vivo. Similar to the findings of the in vitro release study, the lag time prior to the delayed OVA-specific IgG1 antibody response increased with increasing lactic acid content of the polymeric shell.

Recently, various studies have shown that the pre-fusion protein (pre-F) of respiratory syncytial virus (RSV) holds great potential as antigen in the development of a vaccine against the virus (chapter 4).

Therefore, pre-F was freeze-dried in the presence of stabilizing excipients and the resulting powder was incorporated into the core-shell compact (chapter 5). Several analytical techniques indicated that the integrity of pre-F was fully maintained during freeze-drying and storage for at least 28 days at 60 °C. In addition, incorporation of the pre-F-containing powder into a core-shell compact with a PLGA 50:50 shell did not affect the integrity of pre-F. Similar to OVA-containing core-shell compacts, the in vitro release study showed a delayed but incomplete release of pre-F. Nevertheless, BALB/c mice immunized with a s.c. inserted pre-F-containing core-shell compact showed a delayed RSV virus-neutralizing antibody response, indicating that a delayed release of pre-F can also be obtained in vivo.

Miniaturization of the core-shell compact was investigated by using injectable PLGA 50:50 micro-tubes. In addition, it was investigated whether the primer dose could be added onto the device (chapter 6). To this end, the micro-tubes were filled with a powder containing OVA (booster). After filling, the micro-tubes were closed and the outer surface of the micro-tubes were coated with a fast dissolving thin layer containing OVA (primer). An in vitro study showed that these micro-tubes exhibited the desired biphasic pulsatile release profile. To demonstrate the biphasic pulsatile release in vivo, the device should be evaluated in an appropriate animal model.

In conclusion, the biphasic pulsatile delivery of antigens could successfully be achieved with prototypes based on the two different concepts described in this thesis. However, for a clinically acceptable product, substantial challenges related to the stability of protein-based antigens within the PLGA device after administration still need to be overcome. When this is achieved, the successful development of a clinically acceptable product could save many lives annually, especially in low- and middle-income countries (chapter 7).

(6)

(7)

(8)

II SAMENVATTING

De meeste vaccins vereisen een primaire (primer) en na een bepaalde tijd een secundaire (booster) toediening van het antigeen om de gevaccineerde optimaal te beschermen tegen de ziekteverwekker. Daarom worden de meeste vaccins toegediend door middel van een multi-injectie regime. Een dergelijk multi-injectie regime, ook wel bekend als het prime-boost regime, brengt echter verschillende logistieke en/of financiële problemen met zich mee die leiden tot een lage vaccinatiegraad, vooral in lage- en middeninkomenslanden. Deze situatie zou verbeterd kunnen worden door een injecteerbaar en biologisch afbreekbaar implantaat met een bifasisch pulserend afgifteprofiel te ontwikkelen. Na een enkele injectie imiteert een dergelijk implantaat het huidig toegepaste prime-boost regime door een deel van het antigeen onmiddellijk na toediening af te geven (primer), terwijl het resterende deel wordt afgegeven na een bepaalde, bij voorkeur instelbare, tijd (booster). Het onderzoek beschreven in dit proefschrift had als doel om te evalueren of twee verschillende soorten prototypen, beide gebaseerd op poly(DL-lactide-co-glycolide) (PLGA), geschikt zijn voor de bifasische pulserende afgifte van antigenen.

Het eerste prototype was gebaseerd op de directe compactie van een fysisch mengsel bestaande uit het antigeen en ofwel PLGA met een lactide:glycolide monomeerverhouding van 50:50 (PLGA 50:50) of poly(DL-lactide) (PLA) (hoofdstuk 2). In

vitro afgifte studies toonden aan dat 50-60% van het modelgeneesmiddel, theofylline,

onmiddellijk werd afgegeven terwijl het resterende deel pas na een aantal weken als een puls werd afgegeven. Voorwaarde was wel dat de glastransitietemperatuur van het polymeer boven de temperatuur tijdens compactie lag, maar onder de temperatuur tijdens de afgifte. De resultaten toonden ook dat de tijd totdat de tweede afgifte plaatsvond verlengd kon worden door het lactide gehalte van het toegepaste polymeer te verhogen, dat wil zeggen: bij compacten gebaseerd op PLGA 50:50 vond de tweede afgifte eerder plaats dan bij compacten gebaseerd op PLA. Onderzocht werd of dit concept geschikt is voor de bifasische pulserende afgifte van bacteriële op polysacharide gebaseerde antigenen door gebruik te maken van gelabeld dextraan met een molecuulgewicht van 70 of 2000 kDa als modelpolysachariden. In een in vitro afgifte studie met compacten gebaseerd op PLGA 50:50 werden bifasische pulserende afgifteprofielen gevonden die vergelijkbaar waren met die van theofylline bevattende compacten, wat aangeeft dat het molecuulgewicht van het geïncorporeerde antigeen de afgiftekarakteristieken niet beïnvloedt. Samenvattend tonen deze resultaten dat het fysisch mengsel prototype geschikt kan zijn voor de bifasische afgifte van bacteriële op polysacharide gebaseerde antigenen. Dit prototype was helaas niet geschikt voor een bifasische pulserende afgifte van op eiwit gebaseerde antigenen.

Daarom werd het tweede prototype onderzocht. Dit prototype bestond uit een antigeen bevattende kern met daaromheen een niet-poreuze laag van een biodegradeerbaar polymeer (hoofdstuk 3). Wij hebben ons gericht op het meest

(9)

uitdagende deel van het bifasische pulserende afgifteprofiel, dat wil zeggen: het verkrijgen van een uitgestelde afgifte van op eiwit gebaseerde antigenen na een bepaalde, bij voorkeur instelbare, tijd. Dit prototype werd in de vorm van relatief grote (ongeveer 9 x 5 mm) compacten geëvalueerd als proof of concept. Hierbij werd ovalbumine (OVA) gebruikt als model voor op eiwit gebaseerde antigenen. Om te onderzoeken of de tijd voorafgaand aan de uitgestelde afgifte aangepast kon worden, werd PLGA met een lactide:glycolide verhouding van ofwel 50:50, 75:25 of 100:0 (= PLA) toegepast als niet-poreuze biodegradeerbare laag rondom de kern met OVA. In vitro afgifte studies met deze compacten lieten inderdaad een uitgestelde afgifte van OVA zien, ofschoon deze niet volledig was. De tijd voorafgaand aan de uitgestelde afgifte van OVA kon verlengd worden door de lactide:glycolide monomeerverhouding van het polymeer te verhogen. BALB/c muizen die geïmmuniseerd waren met een subcutaan (s.c.) ingebracht compact met ofwel PLGA 50:50 of PLGA 100:0 als biodegradeerbaar polymeer vertoonden een uitgestelde OVA-specifieke IgG1 antilichaamrespons. Deze resultaten geven dus aan dat een uitgestelde OVA afgifte ook in vivo bereikt kan worden. Net als bij de bevindingen van de in vitro afgifte studie, nam de tijd voorafgaand aan de uitgestelde OVA-specifieke IgG1 antilichaamrespons toe met een toenemend lactide:glycolide monomeerverhouding van het polymeer.

In verschillende onderzoeken is onlangs aangetoond dat het pre-fusie eiwit (pre-F) van het respiratoir syncytieel virus (RSV) veel potentie heeft als antigeen in de ontwikkeling van een vaccin tegen het virus (hoofdstuk 4).

Daarom werd pre-F gevriesdroogd in aanwezigheid van stabiliserende hulpstoffen en werd het resulterende poeder verwerkt in eenzelfde compact als beschreven in hoofdstuk 3 (hoofdstuk 5). Verschillende analytische technieken gaven aan dat de integriteit van pre-F volledig werd behouden tijdens vriesdrogen en tijdens opslag gedurende ten minste 28 dagen bij 60 °C. Verder had de incorporatie van het gevriesdroogde pre-F in een compact met PLGA 50:50 als biodegradeerbaar polymeer geen invloed op de integriteit van pre-F. Net als bij de OVA bevattende compacten, toonde de in vitro afgifte studie een uitgestelde, maar incomplete afgifte van pre-F. Desalniettemin vertoonden BALB/c muizen die geïmmuniseerd waren met een s.c. ingebracht pre-F bevattend compact een uitgestelde RSV virus neutraliserende antilichaamrespons, wat aangeeft dat een uitgestelde afgifte van pre-F ook in vivo verkregen kan worden.

Omdat de compacten beschreven in hoofdstuk 3 en 5 te groot zijn voor klinische toepassing werd miniaturisatie van het concept onderzocht door gebruik te maken van injecteerbare PLGA 50:50 microbuizen. Daarnaast werd onderzocht of de primer dosis op het implantaat kan worden toegevoegd (hoofdstuk 6). Hiertoe werden de microbuizen gevuld met een poeder dat OVA bevatte (booster). Na het vullen werden de microbuizen gesloten en werd het buitenoppervlak van de microbuizen gecoat met een snel oplossende dunne laag waarin OVA geïncorporeerd was (primer). Een in

(10)

Processed on: 27-8-2020 PDF page: 153PDF page: 153PDF page: 153PDF page: 153 153 vitro afgifte studie toonde dat deze microbuizen het gewenste bifasische pulserende

afgifteprofiel hadden. Om de bifasische pulserende afgifte in vivo te bevestigen zal het implantaat geëvalueerd moeten worden in een geschikt diermodel.

Kortom, de bifasische pulserende afgifte van antigenen kon succesvol worden bereikt met de prototypen gebaseerd op de twee verschillende concepten die in dit proefschrift worden beschreven. Voor een klinisch aanvaardbaar product moeten echter nog substantiële uitdagingen met betrekking tot de stabiliteit van op eiwit gebaseerde antigenen in het PLGA implantaat na toediening worden overwonnen. Wanneer dit wordt bereikt, kan de succesvolle ontwikkeling van een klinisch aanvaardbaar product jaarlijks vele levens redden, vooral in lage- en middeninkomenslanden (hoofdstuk 7).

(11)

Processed on: 27-8-2020 PDF page: 154PDF page: 154PDF page: 154PDF page: 154

III BIOGRAPHY & LIST OF PUBLICATIONS

Max Beugeling was born on the 3rd_{of April, 1991 in Groningen, The Netherlands. After}

finishing his pre-university education at Het Drachtster Lyceum in Drachten, he started his study Pharmacy at the University of Groningen (2009). During his study Pharmacy, he developed a strong interest in pharmaceutical technology and biopharmacy. Therefore, Max decided to perform his master’s project at the department of Pharmaceutical Technology and Biopharmacy, under the supervision of Prof. H.W. Frijlink, Dr. W.L.J. Hinrichs, and Dr. H.J. Woerdenbag. In this research project, he investigated whether the water solubility of diazepam could be increased by developing solid-state diazepam-hydroxypropyl-β-cyclodextrin inclusion complexes. After receiving his master’s degree

cum laude (2016), Max started a PhD project at the same department. Once again

supervised by Prof. H.W. Frijlink and Dr. W.L.J. Hinrichs, and partly in collaboration with Janssen Pharmaceutica (Beerse, Belgium), he studied whether the currently applied multi-injection vaccination schedules could be mimicked by biodegradable implants. To this end, he investigated the suitability of two different types of poly(DL-lactic-co-glycolic acid)-based prototypes for the biphasic pulsatile delivery of antigens.

(12)

Processed on: 27-8-2020 PDF page: 155PDF page: 155PDF page: 155PDF page: 155 155 M. Beugeling*, K. Amssoms*, F. Cox, B. De Clerck, E. Van Gulck, J.A. Verwoerd, G. Kraus,

D. Roymans, L. Baert, H.W. Frijlink, W.L.J. Hinrichs, Development of a stable respiratory syncytial virus pre-fusion protein powder suitable for a core-shell implant with a delayed release in mice: A proof of concept study, Pharmaceutics. 11 (2019) 510. M. Beugeling, J. De Zee, H.J. Woerdenbag, H.W. Frijlink, J.C. Wilschut, W.L.J. Hinrichs, Respiratory syncytial virus subunit vaccines based on the viral envelope glycoproteins intended for pregnant women and the elderly, Expert Rev. Vaccines. 18 (2019) 935-950. B. Gareb, S. Posthumus, M. Beugeling, P. Koopmans, D.J. Touw, G. Dijkstra, J.G.W. Kosterink, H.W. Frijlink, Towards the oral treatment of ileo-colonic inflammatory bowel disease with infliximab tablets: Development and validation of the production process, Pharmaceutics. 11 (2019) 428.

M. Beugeling*, N. Grasmeijer*, P.A. Born, M. van der Meulen, R.S. van der Kooij, K. Schwengle, L. Baert, K. Amssoms, H.W. Frijlink, W.L.J. Hinrichs, The mechanism behind the biphasic pulsatile drug release from physically mixed poly(DL-lactic(-co-glycolic) acid)-based compacts, Int. J. Pharm. 551 (2018) 195-202.

K. Amssoms*, P.A. Born*, M. Beugeling*, B. De Clerck, E. Van Gulck, W.L.J. Hinrichs, H.W. Frijlink, N. Grasmeijer, G. Kraus, R. Sutmuller, K. Simmen, L. Baert, Ovalbumin-containing core-shell implants suitable to obtain a delayed IgG1 antibody response in support of a biphasic pulsatile release profile in mice, PLoS One. 13 (2018) e0202961.

* Authors contributed equally

(13)

(14)

IV DANKWOORD / ACKNOWLEDGEMENTS

Promoveren doe je (gelukkig) niet alleen. Ik kan dan ook met zekerheid zeggen dat er ontzettend veel mensen zijn die op een bepaalde manier hebben bijgedragen aan de totstandkoming van dit proefschrift. Het zijn er zelfs zo veel dat ik niet iedereen met een aantal persoonlijke woorden kan bedanken in dit dankwoord, voor diegenen: bedankt voor je bijdrage!

Allereerst wil ik mij wenden tot mijn promotor: prof. dr. H.W. Frijlink. Beste Erik, tijdens mijn bacheloronderzoek heb ik kennis mogen maken met jou en jouw afdeling. Mijn interesse in farmaceutische technologie en biofarmacie werd in die periode zo sterk gevoed dat ik het niet kon laten om weer bij jou aan te kloppen voor mijn masteronderzoek. Tijdens dit masteronderzoek werkte ik aan inclusiecomplexen met cyclodextrines, een onderwerp naar jouw hart! Dat laatste heb ik geweten ook, ik kreeg direct jouw proefschrift mee naar huis als naslagwerk. In mijn laatste studiejaar kreeg ik van jou het geweldige aanbod om promotieonderzoek bij jou te komen doen, hier ben ik je tot op de dag van vandaag dankbaar voor. Tijdens mijn promotie was (bijna) niets onmogelijk, bedankt voor al het vertrouwen dat je mij hebt gegeven. Tot slot wil ik zeggen dat jouw enthousiasme en liefde voor het vak aanstekelijk zijn.

Mijn dank gaat ook uit naar mijn co-promotor: dr. W.L.J. Hinrichs. Beste Wouter, tijdens mijn masteronderzoek werd ik door jou begeleid. Onze samenwerking werd gelukkig voortgezet tijdens mijn promotieonderzoek. Ik heb jouw begeleiding als essentieel ervaren voor mijn persoonlijke en professionele ontwikkeling, hartelijk dank hiervoor. Verder wil ik jou bedanken voor de snelle en waardevolle feedback op mijn stukken, jouw bijdrage hebben zonder enige twijfel altijd geleid tot een betere kwaliteit. Je bent één van de grootste sfeermakers van de afdeling en het is geweldig om te zien hoe jij er voor zorgt dat studenten zich thuis voelen op de afdeling.

De leden van de leescommissie, prof. dr. ir. W.E. Hennink, prof. dr. A.L.W. Huckriede en prof. dr. G.F.A. Kersten, bedankt voor het evalueren van het proefschrift.

Philip, ik heb het genoegen gehad om met samen met jou te mogen werken aan het begin van mijn PhD project. Tijdens deze samenwerking heb ik als groentje veel van jou mogen leren, dankjewel! Ik bedenk mij trouwens ineens dat wij nog steeds uiteten moeten gaan, zullen wij dit snel afspreken? P.S. Het Coca-Cola blikje ligt er nog steeds. Niels, ook van jou heb ik als groentje veel mogen leren. Je bent altijd zeer behulpzaam geweest, bedankt!

Katie, jij was vanuit de samenwerkende partij, Janssen Pharmaceutica (Beerse, België),

(15)

betrokken bij een deel van mijn PhD project. Ik wil je bedanken voor onze vruchtbare samenwerking.

To all BIDA team members from Janssen Pharmaceutica and Janssen Infectious Diseases and Vaccines (Leiden, The Netherlands), thank you for your contribution. De redder in nood van velen van de afdeling, Anko. Waar zal ik beginnen? De UV-VIS spectrofotometer, de HPLC, of de vriesdroger? Je stond altijd klaar om te helpen wanneer er sprake was van apparatuur die niet naar behoren functioneerde. Daarnaast hebben wij samen heel wat meters afgelegd in onze zoektochten naar bijzondere materialen die ik nodig had voor experimenten. Bedankt voor al je hulp.

Mitchel, als kersverse doctor heb jij mij enorm geholpen door mij wegwijs te maken tijdens de afrondingsfase van mijn promotietraject, hartelijk dank hiervoor.

Uiteraard wil ik ook graag mijn (ex-)kantoorgenoten, Naomi, Imco en Annemarie, bedanken. Wat een geweldig sfeertje hadden wij altijd op kamer 207, ik kan het niet anders zeggen. Daarnaast wil ik jullie bedanken voor het feit dat jullie mijn (soms) ietwat eigenaardig voedingspatroon (bijvoorbeeld rauwe paprika’s en blikken bonen) omarmden.

To all other (ex-)colleagues of the department of Pharmaceutical Technology and Biopharmacy, thank you so much for creating and maintaining a good atmosphere. In addition, I would like to thank all bachelor and master students that I supervised for their efforts.

Wouter Tonnis, makker, wij hebben elkaar leren kennen toen ik mijn masteronderzoek op de afdeling kwam doen. Op dat moment was jij bezig met het afronden van jouw PhD. In die drukke periode nam je tijd om mij te helpen met enkele experimenten op het lab. Daarnaast werd ik door jou betrokken bij de afronding van jouw promotie (en ook de bijbehorende festiviteiten). Jouw enthousiasme en de vele gesprekken die wij hebben gevoerd, hebben mij geïnspireerd om te promoveren. Tijdens mijn eigen promotie kon ik altijd bij jou terecht, dankjewel voor je steun.

Partner in crime, Bahez, onze reis begon in ‘09, toen wij beiden begonnen aan de studie Farmacie. Ondanks het feit dat wij jaargenoten waren, spraken wij elkaar tijdens de bachelor fase niet. Pas in het eerste jaar van de master kwam het tot een gesprek toen onze paden de avond ervoor tijdens het hardlopen waren gekruist. Al snel na dit eerste gesprek ontstond onze vriendschap, welke door de jaren heen is gegroeid tot iets heel speciaals. Samen hebben wij alle hoogte- en dieptepunten gedeeld en ik kan niet

(16)

onder woorden brengen hoe belangrijk jouw onvoorwaardelijke steun is geweest voor mij. Onze vriendschap zal ik voor altijd koesteren, dankjewel vriend.

Anniek, wat ben ik ontzettend blij dat jij de opmaak van het proefschrift hebt verzorgd. Bedankt voor je inzet.

Hans, Mardi, Juul, Charlotte en Rens, een weekendje samen met jullie in de Achterhoek bracht mij altijd de benodigde ontspanning. Heerlijk met z’n allen in de tuin zitten, darten in de kelder, SingStar spelen, Pitch & Putt golf, slechts een greep uit alle gezelligheid. Begin dit jaar verlieten we zelfs de Achterhoek om een week te langlaufen in Oostenrijk, dat was een geweldige ervaring. Bedankt voor jullie steun en al de gezelligheid.

Arnold en Mientje, Henk en Thea, een kopje koffie bij jullie in combinatie met een goed gesprek heeft mij altijd erg goed gedaan. Bedankt!

Lieve oma Ulla, ik kan zeggen dat u een grote inspiratiebron voor mij bent. Bedankt voor de vele gesprekken die wij hebben gevoerd over de meest uiteenlopende zaken. Ik houd van u.

Amanda en Johan, ondanks het feit dat wij elkaar minder vaak zien dan voorheen, heb ik mij altijd gesteund gevoeld door jullie. Dank jullie wel.

Lieve papa en mama, ik ben trots op het feit dat jullie mijn ouders zijn. Hoe ontzettend dankbaar ik ben voor jullie onvoorwaardelijke liefde en steun is onbeschrijfelijk. Ik houd van jullie.

Allerliefste Lise, toen wij elkaar leerden kennen was ik nog maar een half jaartje bezig met mijn PhD. Deze reis hebben wij dus grotendeels samen afgelegd en ik zou het niet anders willen. Je bent er altijd voor mij geweest, in leuke, maar zeker ook in minder leuke tijden. Je hebt mij onvoorwaardelijke liefde en steun gegeven, ook al heb ik jouw geduld meermaals op de proef gesteld. Je bent een geweldig mens en ik houd ontzettend veel van je. Bedankt voor alles en ik kijk enorm uit naar onze toekomst.